黃　娟,隋曉梅,王怡男,單　虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島　266109)

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犬瘟熱病毒疫苗免疫逃逸株的血凝素基因變異研究

黃娟,隋曉梅,王怡男,單虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266109)

摘要：為了弄清是否有新基因型犬瘟熱病毒出現(xiàn),對(duì)山東省不同地區(qū)的免疫水貂、狐貍和犬進(jìn)行了犬瘟熱病毒檢測(cè),擴(kuò)增了病毒核衣殼基因和血凝素基因(H),并對(duì)13 個(gè)犬瘟熱病毒山東株(8株貂源,2株狐貍源,3株犬源)血凝素基因進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果表明,13個(gè)犬瘟熱病毒山東株之間H基因核苷酸同源性為99.1%～100.0%,均為Asia-1型,這也是我國目前水貂犬瘟熱病毒唯一的基因型。與2012年之前的犬瘟熱病毒中國分離株及疫苗株相比,13個(gè)毒株H基因有4個(gè)氨基酸的一致性變異,即 P200S、M263I、I542N和Y549H,N-糖基化位點(diǎn)比Onderstepoort 株多6或7個(gè),比CDV3株多3或4個(gè)?？乖苑治霰砻?與疫苗株相比,13株山東株在540-549位氨基酸出現(xiàn)一個(gè)新的抗原區(qū)域,210-230，327-347位的抗原區(qū)域也與疫苗株不同,這些變異可能是我國貂狐犬瘟熱免疫失敗的原因。

關(guān)鍵詞：犬瘟熱病毒;血凝素基因;免疫失敗

犬瘟熱病毒(Caninedistempervirus,CDV)是高度傳染性的病原,可感染許多食肉目動(dòng)物,尤其是犬科動(dòng)物。過去人們認(rèn)為貓科動(dòng)物對(duì)CDV抵抗力最強(qiáng),但美國曾報(bào)道過貓科動(dòng)物的致死性感染[1]。CDV被認(rèn)為是非人靈長類動(dòng)物和瀕危動(dòng)物如東北虎的重要威脅[2-3],引起世界范圍內(nèi)人們對(duì)CDV可能引起人類感染和危害野生動(dòng)物保護(hù)的擔(dān)憂。弱毒疫苗廣泛應(yīng)用于犬和其他動(dòng)物來預(yù)防CDV感染,然而,免疫犬和水貂仍發(fā)生CDV感染是和疾病已見幾例報(bào)道[4-5],表明定期監(jiān)測(cè)和檢測(cè)CDV是非常重要和必要的。

CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬,其負(fù)股單鏈基因組RNA編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜相關(guān)基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素(H)和聚合酶(L)[6]。受體結(jié)合蛋白H是CDV主要的保護(hù)性抗原蛋白,具有相當(dāng)大的遺傳多樣性,因此，被廣泛用于分子流行病學(xué)調(diào)查研究[5,7-9]。基于H基因序列的進(jìn)化樹分析表明CDV 毒株可以分為13個(gè)基因型:America-1(或疫苗型)、America-2、Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4、Rockborn-like、Europe Wildlife、Arctic/Arctic-like、South Africa、South America-1/Europe、South America-2 和 South America-3[7-11]。

在我國,關(guān)于CDV遺傳多樣性的報(bào)道多是基于對(duì)犬源毒株的研究[5,10-13],而水貂和狐貍源毒株以及免疫動(dòng)物CDV的基因特征相關(guān)信息較少。2012年以來,山東省免疫水貂和狐貍屢次發(fā)生犬瘟熱疑似病例,所有患病動(dòng)物都曾經(jīng)免疫過Onderstepoort株或CDV3 活苗,為了弄清免疫動(dòng)物CDV山東株的基因特征,本試驗(yàn)對(duì)13個(gè)來自免疫水貂、狐貍和犬的CDVH基因進(jìn)行了測(cè)序和分析。

1材料和方法

1.1臨床病料

2012年4月至2014年6月,收集門診上來自于山東省不同地區(qū)有免疫接種史的自然發(fā)病死亡動(dòng)物。據(jù)畜主口述,這些動(dòng)物臨床癥狀包括發(fā)熱、化膿性的眼和鼻分泌物、足墊變厚。病理解剖發(fā)現(xiàn)疑似CDV感染的病變,如支氣管炎、扁桃體炎、胃腸炎等。隨機(jī)選取其中的13份病例,采集肺和腦組織樣品,勻漿之后凍融3次,4 ℃ 8 000 r/min 離心 10 min,取上清保存于-80 ℃ 冰箱備用。

1.2RNA提取

用TRIzol 試劑(Invitrogen,美國)按說明書操作程序提取組織上清中的總 RNA,提取到的 RNA 溶解在20 μL DEPC水中。CDV3 疫苗毒和健康水貂組織分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.3RT-PCR檢測(cè)CDV

取3 μL總RNA采用一步法 RT-PCR擴(kuò)增265 bpN基因片段,用于CDV 的檢測(cè)。引物見表1。反應(yīng)條件如下:42 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,50.8 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用引物CDV-H-F/CDV-H-R擴(kuò)增H全基因,用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV,200 U/μL)(TaKaRa,大連)和9-Random Hexamers合成cDNA。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

表1　本研究使用的引物

注:a.相對(duì)于Onderstepoort株(AF378705)基因組。

Note:a.Corresponding to positions of the Onderstepoort strain genome(AF378705).

1.4基因克隆與測(cè)序

PCR產(chǎn)物在1% 瓊脂糖(Biowest,西班牙)凝膠電泳后,目的條帶(1 921 bp)用EZ-10 Spin 柱式 DNA 膠回收試劑盒(上海生工)回收純化。純化的PCR 產(chǎn)物克隆至pMD19-T 載體(TaKaRa,Japan),挑取3個(gè)克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序,獲得的序列用DNASTAR SeqMan 軟件進(jìn)行拼接。

1.5H基因進(jìn)化樹和氨基酸分析

采用MEGA 6.06[14]軟件Clustal W方法進(jìn)行序列比對(duì)和編輯。依據(jù)參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法,采用MEGA6.06軟件鄰接法對(duì)本試驗(yàn)獲得的13個(gè)CDV山東株和35 個(gè) CDV 參考株(13個(gè)基因型代表株)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,核苷酸水平差異小于5% 的CDV 毒株歸為同一基因型[16]。利用MEGA 6.06 軟件分析了13個(gè)CDV山東株氨基酸序列,關(guān)鍵點(diǎn)的氨基酸位點(diǎn)包括CDV受體-信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子結(jié)合位點(diǎn)[17]也進(jìn)行了分析。 H蛋白上可能的N-糖基化位點(diǎn)和抗原性位點(diǎn)分別用NetNGlyc1.0 和DNASTAR Protean 軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1免疫動(dòng)物CDV的檢測(cè)

所有的13個(gè)病例全部顯示CDV N PCR陽性,H基因擴(kuò)增、克隆、測(cè)序、拼接后登陸GenBank獲得登錄號(hào) KP127955～KP127967,13個(gè)臨床樣本信息見表2。

表2　臨床樣本信息

2.2免疫動(dòng)物CDVH基因核苷酸序列分析

序列分析顯示,13個(gè)來自于免疫動(dòng)物的CDV山東株之間核苷酸同源性較高,為99.1%～100.0%(表3);13個(gè)山東株與Asia-1型的095Cr(Accession No:AB286952)、HLJ(07)1(Accession No:EU325721)和HeB(09)3(Accession No:HM448832)同源性最高(96.5%～98.0%),與經(jīng)典CDV株(America-1型或疫苗型)CDV3(Accession No:DQ778941)、Onderstepoort(Accession No:EU143737)和 Lederle(Accession No:DQ903854)核苷酸同源性僅有90.1%～90.9%。CDVH基因編碼區(qū)(1 824 nt)進(jìn)化樹分析顯示13個(gè)山東株均屬于Asia-1基因型(圖 1)。

表3　CDV H基因核苷酸和氨基酸同源性比較

注：1.HY1208F;2.LY1206M;3.QD1208D;4.QD1306M;5.WF1202M;6.WF1209M;7.WF1306M;8.WF1307M;9.WF1403D;10WF1403M;11.WH1302F;12.YT1308M;13.YT1404D;14.CDV3;15.Onderstepoot。

2.3免疫動(dòng)物CDVH基因推導(dǎo)氨基酸分析

氨基酸序列分析顯示,13個(gè)山東株之間氨基酸同源性為98.7%～100.0%,與Onderstepoort株和CDV3 氨基酸同源性分別為88.4%～89.2% 和 90.1%～90.9%(表 3)。與Onderstepoort 和 CDV3 相比,來源于免疫動(dòng)物的13個(gè)山東株有91個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異。與GenBank登錄的11株2012年之前的非免疫動(dòng)物來源的中國毒株相比,13個(gè)山東株H基因有4個(gè)氨基酸的一致性變化,即P200S、M263I、I542N 和Y549H(表4)。LY1206M,WF1306M,WF1403D,WF1403M和YT1404D株在306位是天冬酰胺酸,以前從未報(bào)道過。13個(gè)山東株H基因530,549位氨基酸殘基沒有區(qū)別。受體SLAM 結(jié)合位點(diǎn)(187-191,503,520,526,529,537,539,548,550)上,13個(gè)山東株與疫苗株相比發(fā)生R502K變異,HY1208F株在 537位由酪氨酸(Y)突變?yōu)榘腚装彼?C),其余位點(diǎn)均沒有變異。

13個(gè)山東株和35個(gè)參考株采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹,用Tamura 3-parameter計(jì)算進(jìn)化距離,Bootstrap(1 000 重復(fù))

毒株Strains氨基酸殘基Residues187-19120026330636945250250352052652953053753954254854955014/GQ332530RCSGAPMHEIRDYDRGYYITYPCDV-JT1/HM749644..........K...........giantpanda/AF178038..........K...........HeB(07)3/EU325723..........K...........HeB(09)3/HM448832..........K...........HL/EF445052..........K....N......HLJ1/EU743934.......Y..K....R......JL(07)3/EU564812..........K...........

表4(續(xù))

注:上面11個(gè)CDV毒株為隨機(jī)選取的2012年以前報(bào)道的中國株;下面13株為本研究從免疫動(dòng)物檢測(cè)的CDV(加粗);下劃線為疫苗株,以14/GQ332530株為基準(zhǔn);氨基酸殘基相同的以黑點(diǎn)(.)表示;SLAM受體結(jié)合區(qū)域用斜體表示;免疫動(dòng)物來源的CDV與疫苗株及2012年以前的毒株相比有4個(gè)氨基酸殘基的不同(陰影)。

Note:Upper 11 CDV strains are randomly selected from published Chinese isolates before 2012;Lower 13 strains were isolated from vaccinated animals in this paper(bold);Vaccine strains were underlined;Residues identical to those of 14/GQ332530 are indicated with an dark spot(.);Residues of SLAM receptor binding site are italic;4 residues difference between vaccinated and nonvaccinated animals are shadowed.

2.4免疫動(dòng)物CDV H蛋白抗原性分析

13個(gè)山東株潛在N-糖基化位點(diǎn)比Onderstepoort株多6個(gè)或7個(gè)，比CDV 3株多3個(gè)或4個(gè)。與Ondersteporrt和CDV3疫苗株相比，13個(gè)山東株在309位和542位、12個(gè)山東株在584位增加了潛在的N-糖基化位點(diǎn)(表5)。LY1206M、WF1403D、WF1403M和YT1404D株在306位有一潛在的 N-糖基化位點(diǎn)。

表5　13個(gè)山東株和疫苗株CDV H基因潛在的N-糖基化位點(diǎn)

注:N.潛在糖基化位點(diǎn);-.陰性。

Note:N.Potential N-glycosylation sites;-.Negative.

抗原性分析表明,13個(gè)CDV山東株H蛋白推導(dǎo)的氨基酸疏水性和疫苗株不同(圖 2)。Jameson-Wolf 表位預(yù)測(cè)表明13個(gè)CDV山東株在540-549位比疫苗株Onderstepoort 和CDV3多了一個(gè)抗原性區(qū)域,氨基酸210-230 和327-347(Onderstepoort)位點(diǎn)抗原性也明顯不同(圖2)。

540-549位氨基酸增加的一個(gè)抗原區(qū)域用黑箭頭標(biāo)示(↑);其他2個(gè)不同的抗原區(qū)域分別用倒三角(▼)和下劃線指示(-)。

3討論

我國曾報(bào)道過犬、貉、貂、狐、大熊貓、小熊貓和猴的 CDV 感染[5,10-13],以前的研究表明在我國大陸有6個(gè)基因型(Asia-1、Asia-3、Asia-4、Rockborn-like、Arctic-like、Recombinant)[5,10-13,18]。本研究中,所有的CDV陽性患病動(dòng)物根據(jù)臨床記錄均有免疫接種史。有趣的是,來自于不同宿主(貂、狐和犬)、不同地區(qū)(濰坊、青島等)、不同時(shí)間(2012-2014年)的13個(gè)CDV毒株H基因序列高度同源(99.1%～100.0%),說明這些毒株由同一個(gè)病毒進(jìn)化而來,在2012-2014年流行傳播引起免疫動(dòng)物感染發(fā)病。進(jìn)化樹分析表明這13個(gè)毒株均為Asia-1基因型,這是我國目前CDV流行的主要基因型,也是目前我國水貂和山東省報(bào)道的唯一基因型,說明水貂來源的CDV-H基因變異較少。因此,貂場(chǎng)CDV 控制策略應(yīng)該主要放在加強(qiáng)生物安全,建立潔凈農(nóng)場(chǎng);免疫接種犬只,因?yàn)槿且阎腃DV儲(chǔ)存宿主[19]。

活疫苗Onderstepoort和CDV3(Onderstepoort克隆株)在我國被廣泛應(yīng)用于免疫接種。本研究中,來源于免疫動(dòng)物的13個(gè)CDV山東株與疫苗株在進(jìn)化樹上明顯處于不同分支,表明這些動(dòng)物不可能是由于疫苗毒株返強(qiáng)導(dǎo)致發(fā)病。與2012年之前的中國毒株及疫苗株相比,13個(gè)山東株H基因有4個(gè)氨基酸的一致性變異,特別是542位異亮氨酸突變?yōu)樘於０匪?導(dǎo)致抗原區(qū)域和N-糖基化位點(diǎn)增加。蛋白上氨基酸的疏水性和N-糖基化位點(diǎn)會(huì)影響免疫原性[20],H蛋白上N-糖基化會(huì)掩蓋抗原表位,從而妨礙H蛋白與中和抗體的結(jié)合;N-糖基化位點(diǎn)的變異也會(huì)影響CDV毒力[21]。新毒株發(fā)生抗原性和毒力變異,能夠逃避疫苗免疫保護(hù),可能是臨床上免疫失敗的原因。對(duì)日本東京2個(gè)動(dòng)物醫(yī)院的調(diào)查結(jié)果表明,2/3 被診斷為犬瘟熱的犬有免疫接種史,大多數(shù)犬體內(nèi)有高水平的Onderstepoort株中和抗體,但針對(duì)野毒株的中和抗體水平很低,表明Onderstepoort株和野毒株膜蛋白抗原表位不同[22-23]。因此,選擇新分離的當(dāng)?shù)亓餍兄曜鳛镃DV疫苗毒株尤為重要。

CDV毒株致病力增強(qiáng)也可能是導(dǎo)致免疫失敗的原因。由于受體 SLAM是CDV入侵機(jī)體、宿主-病毒相互作用中的關(guān)鍵分子[17],也分析了CDV-H上相應(yīng)的 SLAM 結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)1:502,503;位點(diǎn)2:526,529,548,550;位點(diǎn)3:187-191;位點(diǎn)4:520,537,539,548)[17]。SLAM 結(jié)合位點(diǎn) 1,2,3,4 上的氨基酸殘基均沒有變異,502位氨基酸除外,13 個(gè)CDV 山東株是 K502,2個(gè)疫苗株是R502,但這種取代被認(rèn)為不大可能影響病毒-受體結(jié)合[17]。CDV-H Y549被認(rèn)為是CDV感染犬科動(dòng)物的關(guān)鍵氨基酸[24],然而,13個(gè)來源于貂、狐和犬的 CDV山東株及 2 個(gè)疫苗株均表現(xiàn)為Y549H。因此,本試驗(yàn)基因分析結(jié)果對(duì)了解CDV-宿主相互作用僅能提供有限信息,免疫失敗是否由CDV毒力變異引起尚需通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

犬瘟熱病毒的流行和傳播不僅危害貂狐等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的健康,還威脅東北虎、熊等野生動(dòng)物的健康[3,19]。本研究報(bào)道了新的CDV野毒株,其抗原區(qū)域和N-糖基化位點(diǎn)都比疫苗株多,加強(qiáng)對(duì)臨床上犬瘟熱疫苗免疫失敗的原因探究,有助于保護(hù)毛皮動(dòng)物、伴侶動(dòng)物和野生動(dòng)物的健康。

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Sequence Analysis of the Hemagglutinin Gene ofCaninedistempervirusfrom Vaccinated Dogs,Minks and Foxes

HUANG Juan,SUI Xiaomei,WANG Yinan,SHAN Hu

(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Universities of Shandong,Qingdao266109,China)

Abstract：In order to understand whether new genotype emerged,we detected Canine distemper virus(CDV)in immunized dogs,breeding foxes and minks in different regions by amplification of nucleocapsid(N)and hemagglutinin(H)gene.13 strains from CDV-positive cases(8 minks,2 foxes and 3 dogs)were sequenced.The results showed that the 13 Chinese strains shared 99.1%-100.0% nucleotide identity.Compared with those of other Chinese CDV strains isolated before 2012,four consistent amino acid changes,P200S,M263I,I542N and Y549H,were observed in the H coding sequence of CDV isolated from vaccinated animals,which contribute to an additional N-glycosylation site and antigenic epitope.All of the strains obtained from 13 samples were characterized as genotype Asia-1 according to the sequence analysis of the complete H gene,which was the sole genotype in minks in China.These findings provide a comprehensive understanding of current immune failure and the molecular epidemiology of CDV in China.

Key words:Canine distemper virus;Hemagglutinin gene(H);Vaccination failure

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.037

中圖分類號(hào)：S85;S432.4+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0231-08

通訊作者：單虎(1967-),男,山東威海人,教授，博士，主要從事動(dòng)物傳染病防制與生物制品學(xué)研究。

作者簡介：黃娟(1977-),女,河南信陽人,副教授,博士,主要從事動(dòng)物傳染病防制研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472196)

收稿日期：2016-02-17