孫　晗　侯　旭　申玉芹　鄭　義　婁譯心　汪　洋　齊　佳　孫新華

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林　長春　130021)

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MT01對人成骨樣細胞系MG63內(nèi)Toll樣受體7,9表達的影響

孫晗侯旭申玉芹鄭義婁譯心汪洋齊佳孫新華

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討人成骨樣細胞系MG63(簡稱MG63)內(nèi)Toll樣受體(TLRs)的表達情況及MT01與細胞內(nèi)TLRs的關(guān)聯(lián)。方法應(yīng)用RT-PCR法檢測MG63內(nèi)TLR1～10 mRNA的表達情況；MT01與MG63作用12、24、48 h后,Real time PCR法檢測MG63細胞內(nèi)TLR7,9 mRNA表達的變化；Western印跡法檢測MG63細胞內(nèi)TLR7,9 蛋白表達的變化。結(jié)果MG63細胞表達TLR1～10 mRNA；一定濃度的MT01作用于細胞后,對TLR7,9 mRNA及蛋白表達有顯著的抑制作用，這種抑制作用無時間依賴性。結(jié)論MG63細胞表達TLR1-10 mRNA，一定濃度的MT01可影響MG63細胞內(nèi)TLR7,9 mRNA及蛋白的表達。

〔關(guān)鍵詞〕MT01；人成骨樣細胞系MG63；Toll樣受體

Toll樣受體(TLRs)是一種模式識別受體，在高等脊椎動物的固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著樞紐作用〔1〕。有研究表明，TLRs家族中諸如TLR9對牙槽骨改建具有調(diào)控作用，可調(diào)控骨改建過程中成骨細胞的成骨分化〔2〕。目前發(fā)現(xiàn)，在TLRs受體家族中，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體上的TLR7,9可識別引發(fā)早期固有免疫應(yīng)答的核酸類分子如寡脫氧核糖核苷酸(ODN)等〔3～5〕。MT01是本課題組依據(jù)人線粒體DNA序列設(shè)計并人工合成的單鏈DNA，是一種免疫負性調(diào)節(jié)劑，可抑制免疫細胞如人外周血單核細胞內(nèi)TLR7,9與激動劑結(jié)合產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)〔5〕。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MT01可促進成骨細胞增殖、活化,抑制實驗性大鼠牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收,促進骨形成〔6,7〕。本實驗擬研究一定濃度MT01對成骨細胞MG63內(nèi)TLR7,9表達的影響，為進一步闡述MT01調(diào)控骨改建的免疫學(xué)機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料與試劑超凈工作臺(TECH，中國)；恒溫離心機(beckman coulter,美國)； CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；100 mm培養(yǎng)皿、 6孔板、8聯(lián)管(COSTAR，美國)；人源性成骨樣細胞系 MG63 (ATCC,CRL-1427)，MT01(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室自主設(shè)計、大連TAKARA全硫代修飾合成)；HG-DMEM(Gibco，美國)；胎牛血清(PAA 公司，美國)；胰蛋白酶(Sigma 公司，美國)； TLR7,9一抗(博奧森，中國)；β-actin一抗(Abcam,美國)；過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(Molecular Probes，美國)；RIPA裂解液 (鼎國昌盛，中國)； TLR7,9 mRNA引物合成(三博遠志，中國)；SYBR Premix Ex Taq(大連TAKARA,中國)；Primer Script RT reagent Kit(大連TAKARA,中國)；反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR引物序列：TLR1：正義：CAGTGTCTGGTACACGCATGGT，反義：TTTCAAAAACCGTGTCTGTTAAGAGA；TLR2：正義：GCCAAAGTCTTGATTGATTGG，反義：TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG；TLR3：正義：CCTGGTTTGTTAATTGGATTAACGA，反義：TGAGGTGGAGTGTTGCAAAGG；TLR4：正義：GGTGGAAGTTGAACGAATGG，反義：CTGTCCTCCCACTCCAGGTA；TLR5：正義：CAGAAACCTGCCCAACCTTAG，反義：GATCCAAGCGAGTTAAAGCCTT；TLR6：正義：GTGAGTGGTGCCATTACGAA，反義：TTTGGGAAAGCAGAGTGGAG；TLR7：正義：TTACCTGGATGGAAACCAGCTAC，反義：TCAAGGCTGAGAAGCTGTAAGCTAG；TLR8：正義：AGCGGATCTGTAAGAGCTCCATC，反義：CCGTGAATCATTTTCAGTCAAGAC；TLR9：正義：GCAGTCAATGGCTCCCAGTTC，反義：GCGGTAGCTCCGTGAATGAGTG；TLR10：正義：TTATGACAGCAGAGGGTGATGC，反義：CTGGAGTTGAAAAAGGAGGTTATAGG；GAPDH：正義：CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反義：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。實時熒光定量(Real time)PCR引物序列:TLR7:正義：GGAGGTATTCCCACGAACACC，正義：TGACCCCAGTGGAATAGGTACAC；TLR9：正義：GGACCTCTGGTACTGCTTCCA，正義：AAGCTCGTTGTACACCCAGTCT；GAPDH：反義CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反義：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。

1.2實驗方法

1.2.1RT-PCR法檢測MG63內(nèi)TLRs mRNA的表達情況 復(fù)蘇 MG63，含10%胎牛血清的HG-DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代，3×105個/孔細胞濃度鋪6孔板，孵育24 h，收集細胞，Trizol法提取總RNA，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制25 μl RT PCR反應(yīng)體系：Buffer(10×)2.5 μl,10 mmol/L dNTPs 2 μl,cDNA 1 μl,PCR上游引物0.5 μl,PCR下游引物0.5 μl,TaqDNA 聚合酶1 μl (2U),dd H2O 17.5 μl。PCR 條件為 94℃,60 s;55℃,120 s;72℃,90 s;循環(huán)30次。PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后,在GIS 1D 凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描定量。

1.2.2Real time PCR法檢測MT01作用后不同時間點MG63內(nèi)TLR7,9 mRNA的表達情況細胞培養(yǎng)、鋪板同前，加入含有1 mg/L MT01的完全培養(yǎng)基后，于共孵育12、24、48 h分別收集細胞，加入同體積磷酸鹽緩沖液(PBS)設(shè)為空白對照組。RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄同前。在8連管中配制25 μl Real time PCR 反應(yīng)體系：SYBR Primer Ex TaqTM(2×)12.5 μl，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ROX reference DyeⅡ(50×) 0.5 μl，cDNA 2 μl,ddH2O 9 μl。反應(yīng)條件：95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min，循環(huán)48次。

1.2.3Western印跡法檢測MT01作用后不同時間點MG63內(nèi)TLR7,9 蛋白的表達情況細胞培養(yǎng)、鋪板同前，加入含有1 mg/L MT01的完全培養(yǎng)基后，于共孵育12、24、48 h分別收集細胞，加入同體積PBS設(shè)為空白對照組。按照試劑盒說明提取蛋白質(zhì)并對其進行定量。之后分別將預(yù)染蛋白和樣品液上樣，電泳分離總蛋白。按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移說明書組裝濾紙凝膠纖維素夾層,60 V恒壓條件下,4℃轉(zhuǎn)移2 h。將轉(zhuǎn)移后的膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育2 h,以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉后的膜加入一抗，4℃孵育過夜。加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗,室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,經(jīng)X膠片曝光顯影。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1MG63內(nèi)TLRs mRNA表達情況成骨樣細胞MG63內(nèi)有TLR1～10 mRNA的表達，其中TLR2,5,10 mRNA表達稍弱 (圖1)。

圖1　RT-PCR法檢測MG63內(nèi)TLR1～10 mRNA的表達情況

2.2不同時間點MT01對TLR7,9 蛋白表達的影響12、24 h組，TLR7蛋白量與對照組相比顯著減少，而48 h組的TLR7蛋白量與12、24 h組相比稍有增高，但仍低于對照組。實驗組TLR9蛋白的表達量低于對照組(圖2)。

圖2　MT01作用于MG63后，不同時間點TLR7, TLR9蛋白的表達情況

2.3不同時間點MT01對TLR7,9 mRNA表達的影響Real time PCR檢測顯示：MT01能抑制細胞內(nèi)TLR7,9 mRNA的表達。12、24 h組中的TLR7 mRNA的表達量(0.072、0.071)顯著減少，與對照組(設(shè)為1)比差異顯著(P<0.05)；48 h組中的TLR7 mRNA的表達量(0.124)與前兩組相比略微增高，但仍低于對照組(P<0.05)。12、24、48 h組中的TLR9 mRNA表達量(0.443、0.146、0.149)均低于對照組(設(shè)為1)(P<0.05)。但MT01對TLR7,9 mRNA的抑制作用沒有明顯的時間依賴性。

3討論

人成骨樣細胞系MG63具有與人成骨細胞相似的表型特征及分化特性〔8〕，因其具有易培養(yǎng)、價格便宜、取材方便等特性，近年來被廣泛用來研究成骨等方面的特性。關(guān)于不同來源的成骨細胞上TLRs的表達情況目前尚無定論。Yasuyuki等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)人成骨細胞系SaOS-2表達TLR1,4,5,6,9 mRNA；有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞上表達TLR1～10 mRNA〔10〕；而Takeshi等〔11〕對于MC3T3的研究發(fā)現(xiàn)老鼠的成骨細胞僅表達TLR2,4,3,6 mRNA。造成這種差異的原因可能由于細胞起源及細胞種類不同，所能表達的TLRs種類也各不相同〔12〕。本實驗結(jié)果說明TLRs的表達可能受細胞種類的影響。這也提示如果選用不同種屬的細胞進行實驗，還要注意種屬特異性的問題。

MT01(5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3')的序列富含胞嘧啶，Yang等〔5〕研究表明MT01可以識別免疫細胞內(nèi)的TLRs，并且抑制由TLR7,9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這種免疫負調(diào)節(jié)活性可能是序列依賴性的。通過Hou等〔13〕對MT01進入細胞的時相性觀察發(fā)現(xiàn)，隨著加藥時間的變化， MT01 進入細胞的量表現(xiàn)出一定的時間依從性規(guī)律，在12 h進入細胞的量達到了峰值。本實驗結(jié)果說明MT01能抑制TLR7蛋白的表達。同時間點檢測的蛋白量與基因量稍有差異可能是由于在轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程中，影響翻譯的條件如原料、模板、能量和酶等發(fā)生變化引起的〔14〕。

有研究表明TLR7,9的激活可導(dǎo)致自身免疫性疾病〔15〕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔16〕及各種自身免疫性疾病的發(fā)生。同時有研究表明表達于成骨細胞及破骨細胞上TLR9的激活，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生各種炎性因子如白介素、腫瘤壞死因子等〔2〕。這些炎性因子協(xié)同作用可以抑制成骨細胞的成骨功能，促進破骨細胞活化，從而破壞骨改建的平衡，導(dǎo)致骨吸收〔17〕。本實驗所用的這種新型的寡核苷酸MT01可以抑制TLR7,9的表達，抑制早期祖細胞的TLRs活化，抑制骨含量減少，保持骨代謝與免疫系統(tǒng)的平衡。本實驗發(fā)現(xiàn)MT01作為一種免疫負性調(diào)節(jié)劑能夠影響成骨細胞TLR7,9的表達，進而可以影響骨改建進程，因此，MT01有可能成為潛在的骨吸收抑制劑。深入研究MT01與骨改建的關(guān)系，可為今后的臨床應(yīng)用提供一定實驗基礎(chǔ)。

4參考文獻

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〔2016-03-16修回〕

(編輯曲莉)

基金項目：吉林省科技廳自然科學(xué)基金面上項目資助項目(20150101173JC);吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計劃(2012080632)

通訊作者：孫新華(1954-)，女，教授，主要從事牙齒移動生物學(xué)研究。

〔中圖分類號〕R783.5

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2071-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.010

第一作者：孫晗(1990-),女，在讀碩士，主要從事牙齒移動生物學(xué)研究。