韋樹根，馬小軍，付金娥，周 敏，潘麗梅

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究廣西分所 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530222)

桑寄生不同部位總RNA提取方法比較研究＊

韋樹根1,2，馬小軍1＊＊，付金娥2，周 敏3，潘麗梅2

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究廣西分所 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530222)

目的：從桑寄生中提取高質(zhì)量的RNA。方法：以桑寄生葉片、莖、花和種子為材料，采用TRIzol試劑盒法、改良TRIzol法、CTAB-LiCl法、CTAB-異丙醇法4種方法，比較不同材料及不同方法分離RNA的效果。結(jié)果：TRIzol試劑盒法和改良TRIzol法均不能有效的去除桑寄生中的多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，不適合用于桑寄生RNA的提?。籆TAB-LiCl法提取的RNA質(zhì)量較高、完整性較好, 可滿足各種后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求；CTAB-異丙醇法提取桑寄生RNA的效果雖然較好，但還達(dá)不到小RNA分析實(shí)驗(yàn)要求。結(jié)論：為桑寄生后續(xù)分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)，也為次生代謝物較豐富的藥用植物RNA的提取提供參考。

桑寄生 RNA提取 多糖 蛋白質(zhì) CTAB-LiCl

2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定桑寄生為桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.）Danser的干燥帶葉莖枝[1]。桑寄生苦、甘、平，具有祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎元；多用于治療風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟，筋骨無力，崩漏經(jīng)多，妊娠漏血，胎動(dòng)不安，頭暈?zāi)垦?。提取質(zhì)量高、純度高、完整性好的RNA是分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，對(duì)于進(jìn)行RT-PCR，cDNA合成、RNA序列分析、Northem印跡雜交等具有重要意義[2,3]。由于植物組織中化學(xué)成分復(fù)雜，

并沒有一種RNA提取方法適用于所有的植物[4]。桑寄生化學(xué)成分復(fù)雜，目前從桑寄生提取物中分離到多 種化學(xué)成分，主要有甾體化合物、三萜、黃酮類化合物、有機(jī)酸、胺類化合物、生物堿、氨基酸和肽類化合物等[5]，復(fù)雜的化學(xué)成分增加了桑寄生RNA提取的難度，雖然李永華等對(duì)桑寄生化學(xué)成分、種子特性及DNA條形碼鑒定等方面進(jìn)行了研究[6-8]，但在桑寄生不同部位的RNA提取方面未見有研究。故本文通過比較TRIzol法、改良TRIzol法、CTABLiCl法和CTAB-異丙醇四種方法提取桑寄生不同部位的RNA, 所得結(jié)果將為桑寄生進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2015年6-7月樣品采于廣西藥用植物園栽培基地,樣品包括桑寄生葉片、莖、花、果立即用液氮速凍或-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TRIzol試劑盒（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：84704），氯仿（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20130718），異丙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130906），氯仿:異戊醇為24:1（天津博迪化工股份有限公司，批號(hào)：20130513），苯酚（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20140220），75%乙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20120531），CTAB8 mol/L（北京久峰潤(rùn)達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0140314）。LiCl（廣州市金華化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130523），1%瓊脂糖凝膠（批號(hào)：20150104），1×TAE緩沖液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號(hào)：20131116），DEPC水（加焦炭酸二乙酯滅菌超純水（廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140413）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Eppendorf移液槍（德國(guó)Eppendorf公司），SIGMA Sartorius 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）、Bio-Rad電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）、MILLIPORE超純水機(jī)（法國(guó)MILLIPORE公司）、制冰機(jī)（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司）、恒溫干燥箱（上海天恒醫(yī)療器械有限公司）、渦旋振蕩儀器（上海青浦滬西儀器廠）、水浴鍋（上海天恒醫(yī)療器械有限公司）、微量分光光度計(jì)（韓國(guó)OPTIZEN Nano Q型）。

1.4 操作方法

1.4.1 TRIzol試劑盒提RNA

取0.2 g植物組織，在液氮中研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至裝有1 mL TRIzol的1.5 mL離心管中，再加入0.2 mL氯仿渦旋混勻15 s，室溫靜置3 min，4℃下12 000 rpm離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，渦旋混勻，室溫靜置10 min，4℃下12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃下8 190 rpm離心5 min，棄上清，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC處理水溶解。

圖1 TRIzol法

圖2 改良TRIzol法

1.4.2 改良TRIzol法提RNA

根據(jù)韋榮昌[9]改良TRIzol法為基礎(chǔ)進(jìn)行改良：取0.2 g植物組織，在液氮中研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至裝有1 mL TRIzol的1.5 mL離心管中，渦旋振蕩1 min，4℃下2 000 rpm離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）溶液，渦旋振蕩1 min，室溫靜置3-5 min，4℃下12 000 rpm離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇，室溫靜置3-5 min，4℃下12 000 rpm離心15 min，加入等體積氯仿，室溫靜置3-5 min，4℃下12 000 rpm離心15 min，取上清液200 μL轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.5 mL預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻8-10次，室溫靜置8-10 min，4℃下12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇溶液，4℃下8 190 rpm離心5 min，棄上清，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC處理水溶解。

1.4.3 CTAB-LiCl法

根據(jù)宋蓓[10]LiCl法為基礎(chǔ)進(jìn)行改良：取0.2 g液氮研磨的樣品迅速轉(zhuǎn)移至60℃預(yù)熱的含有600 μL CTAB的離心管中，渦旋振蕩30 s，置60℃水浴2 min，期間顛倒混勻2-3次，室溫冷卻1 min后加入等體積氯仿：異戊醇溶液，渦旋振蕩1 min后，4℃下12 000 rpm離心15 min，取上清液，加入等體積的氯仿:異戊醇溶液，渦旋振蕩1 min，4℃下12 000 rpm離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/3體積的8 mol·L-1LiCl，4℃過夜沉淀，4℃下12 000 rpm離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇溶液，4℃下8 190 rpm離心5 min，棄上清，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC處理水溶解。

1.4.4 CTAB-異丙醇法

步驟同CTAB-LiCl法，用等體積的異丙醇沉淀。

1.5 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的純度和完整性，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRIzol試劑盒法和改良TRIzol提RNA

用TRIzol法以及改良TRIzol法提取RNA時(shí)，沉淀呈淡黃色，無法溶解在DEPC水中，加熱溶解后，溶液呈乳白色混懸狀，且無法完全溶解。電泳后，結(jié)果如圖1和圖2，條帶均模糊不可見，可能是RNA長(zhǎng)片段與多糖或某些次生代謝物結(jié)合，不能被核酸染料染色所致。

2.2 CTAB-LiCl法

電泳結(jié)果圖見圖3，RNA濃度及OD值見表1，葉、莖、花條帶清晰，OD260/OD280均在1.80-2.10之間，說明RNA在整個(gè)提取過程中結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)生明顯降解。OD260/OD230均在2.00-2.30之間，說明去DNA和蛋白質(zhì)效果很好。而種子外面還包裹一層膠狀的果肉，可能含多糖和酚類物質(zhì)較多，提取過程中未去除干凈，由圖3和OD260/OD280可知RNA出現(xiàn)了降解，而且含量也較低，CTABLiCl法不適合作為提取種子RNA的方法。

2.3 CTAB-異丙醇法

電泳結(jié)果圖見圖4，RNA濃度及OD值見表2。葉片的條帶模糊，略有降解，但OD260/OD280在1.80-2.10之間，濃度也較高，可能是點(diǎn)樣過程中RNA污染了。莖、花、種子的OD260/OD280和OD260/OD230在合格范圍內(nèi)，18S和28S條帶也較清晰，但5S條帶模糊，不清晰，說明CTAB-異丙醇法提取桑寄生的效果雖然較好，但達(dá)不到用于小RNA的分析。

3 討論

在提取植物組織總RNA的過程中，RNA酶（RNase）是決定提取效果的重要因素，包括內(nèi)源性RNase和外源性RNase。外源RNase存在的范圍廣而且很穩(wěn)定。由于RNA是單鏈，不穩(wěn)定，很容易降解。故在RNA提取時(shí)，所有研缽和玻璃器皿必須高溫烘烤，所有離心管和槍頭等塑料制品必須滅RNase酶且為提RNA專用，所有試劑的稀釋必須用滅菌的DEPC水；為減少RNA的降解，所有操作都應(yīng)該在低溫下。操作臺(tái)面應(yīng)該用75%乙醇擦拭干凈，在提取過程中多次用75%乙醇消毒；操作人員在操作過程中應(yīng)佩戴口罩，使用一次性手套，并經(jīng)常更換，減少人員流動(dòng)，從而防止外源RNase的污染。

不同的植物提取RNA的方法不一樣，富含次生代謝物的植物，分離高質(zhì)量RNA的難度非常大[11，12]。其次組織的破碎程度、RNase的活性等[13]都會(huì)影響RNA提取的質(zhì)量。多糖能與RNA共沉淀形成難溶的膠狀物，還可以抑制許多酶的活性[14]。由于桑寄生化學(xué)成分多，含多糖、蛋白質(zhì)，所以要盡可能去除這些雜質(zhì)，才能得到較好的結(jié)果。本研究采用TRIzol試劑盒法、改良TRIzol法、CTAB-LiCl法、CTAB-異丙醇法等4種方法，比較不同材料不同方法分離RNA的效果，目的找到一種適合于提取桑寄生不同組織RNA的方法，從而分離出高質(zhì)量的RNA，為桑寄生進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。研究的結(jié)果表明，TRIzol試劑盒法比較簡(jiǎn)單方便，耗時(shí)也較短，但是可能由于步驟比較簡(jiǎn)單，對(duì)雜質(zhì)的去除不夠徹底。改良TRIzol法加了苯酚，去除多糖、蛋白質(zhì)等成分的能力更強(qiáng)，但還是不能將多糖和蛋白質(zhì)等成分去除干凈，無法從樣品中提取RNA?？赡苁且?yàn)樯＜纳鷮儆诤嗵呛头宇惓煞州^多,在桑寄生不同組織的RNA提取中，CTAB較TRIzol試劑更能有效去除多糖和酚類等物質(zhì)，CTAB法提取的RNA沉淀呈透明狀，溶解完全且電泳結(jié)果條帶整齊無降解現(xiàn)象，從而能得到純度較高、質(zhì)量較好的RNA。LiCl本身沉淀大片段RNA效果好的特點(diǎn)使得到的RNA大片段損失很少，CTAB-LiCl法提取的RNA質(zhì)量較高、完整性較好,條帶清晰，OD260/OD280均在1.80-2.10之間，可以滿足后續(xù)各種分子生物學(xué)研究的要求。而異丙醇沉淀獲得的沉淀體積大，導(dǎo)致了多糖和酚類物質(zhì)的共沉淀作用，CTAB-異丙醇法提取桑寄生RNA的效果也較好，可用于轉(zhuǎn)錄組及qPCR等實(shí)驗(yàn)分析，但5S條帶模糊，達(dá)不到小RNA分析的實(shí)驗(yàn)。故綜合各種因素，CTAB-LiCl更適合桑寄生RNA的提取。

表1 不同部位RNA的濃度和OD值

圖3 CTAB-LiCl法

表2 不同部位RNA的濃度和OD值

圖4 CTAB-異丙醇法

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2010: 280.

2 郭彥萃,熊毅,張志.桑黃總RNA提取方法研究.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 26(1): 95-96.

3 李紅熙,徐美隆,楊智.一種適合葡萄多種組織的總RNA提取方法.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28(7): 155-159.

4 孫海波,王智慧,劉學(xué)群,等.一種適用于油菜、大豆、花生、芝麻四種油料作物種子的RNA提取方法.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2012, 34(4): 353-358.

5 李永華,阮金蘭,陳士林,等.中國(guó)桑寄生科Loranthaceae藥用植物資源學(xué)研究進(jìn)展.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2009, 11(5): 665-669.

6 Li Y H, Ruan J L, Chen S L, et al. Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique. J Med Plants Res, 2010, 4(24): 2706-2709.

7 蘇本偉,張協(xié)君,李永華,等.柿樹寄主的桑寄生科7種不同屬桑寄生藥用植物中槲皮苷含量分析.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014, 16(2): 368-372.

8 李永華,阮金蘭,陳士林,等.廣寄生種子結(jié)構(gòu)及其萌發(fā)實(shí)驗(yàn)研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化. 2010, 12(6): 920-923.

9 韋榮昌,馬小軍,白隆華,等.羅漢果果實(shí)總RNA提取方法的比較研究.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 26(6): 1629-1634.

10 宋蓓,趙錦,劉孟軍,等.改良CTAB-LiCl法提取棗總RNA體系的建立.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 23(7): 79-83.

11 Wang T, Zhang N, Du L. Isolation of RNA of high quality and yield from Girakgo biloba leaves. Biotechnol Lett, 2005, 27: 629-633.

12 劉芳,官春云.富含多酚類植物RNA提取的研究進(jìn)展.作物研究, 2015, 29(1): 91-95.

13 Sambrool J, Fritscli E F, M aniatis T. Molecular cloning: a laboratory manuals (2nd edition). New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 343-361.

14 李書杰,郭曉博,王運(yùn)英,等.山藥總RNA不同提取方法的比較研究.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 43(3): 129-132.

Comparison of Four Methods for Total RNA Extraction from Different Sections of Taxillus chinensis (DC.) Danser

Wei Shugen1,2, Ma Xiaojun1, Fu Jin’e2, Zhou Min3, Pan Limei2
(1. Institute of Medicinal Plant Development, China Academy of Chinese Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Guangxi Branch of Institute of Medical Plant Development, China Academy of Chinese Medical Sciences, Nanning 530023, China; 3. College of Pharmacy, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530222, China)

This study was aimed to extract high quality RNA from the T. chinensis (DC.) Danser. The leaves, stems, flowers and seeds of T. chinensis (DC.) Danser were used as materials. Four methods, which were the TRIzol reagent kit method, improved TRIzol method, CTAB-LiCl method, and CTAB-isopropyl alcohol method, were used to compare the effect of different methods and materials for the separation of RNA. The results showed that TRIzol reagent kit method and the improved TRIzol method cannot effectively remove the impurities such as polysaccharide and protein in the T. chinensis (DC.) Danser. Both of them were not suitable for the extraction of RNA from T. chinensis (DC.) Danser. The extraction of RNA with CTAB-LiCl method was with integrity andhigh quality, which can meet the requirements of various molecular biology experiments subsequently. The RNA extraction effect with the CTAB-isopropyl alcohol method fromT. chinensis(DC.) Danser was better, but it still cannot meet the small RNA analysis experiment requirement. It was concluded that the study provided foundation forT. chinensis(DC.) Danser subsequent molecular biology research, as well as provided the reference for the extraction of RNA from medicinal plants with relatively rich secondary metabolites.

Taxillus chinensis(DC.) Danser, RNA extraction, polysaccharide, protein, CTAB-LiCl

10.11842/wst.2016.03.003

R282

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-10-13

修回日期：2016-12-23

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81403045）：桑寄生頑拗性種子保存及脫水敏感性死亡機(jī)理研究，負(fù)責(zé)人：韋樹根；廣西壯族自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳青年科學(xué)基金（2014GXNSFBA118204）：桑寄生頑拗性種子脫水敏感性分子機(jī)理研究，負(fù)責(zé)人：潘麗梅；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09304006）：中藥材種子種苗和種植（養(yǎng)殖）標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)子課題——云木香、桑寄生、草果種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，負(fù)責(zé)人：馬小軍。

＊＊ 通訊作者：馬小軍，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：藥用植物遺傳育種。