華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院普外科 (唐山 063000)

王明君　張青松?　曹立贏　溫英武　費樂學(xué)　高建超　鄭景珍　鐘　爍　王　瑜

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甲基硫代腺苷對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖及RNA聚合酶Ⅲ依賴基因轉(zhuǎn)錄影響實驗研究*

華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院普外科 (唐山 063000)

王明君張青松?曹立贏溫英武費樂學(xué)高建超鄭景珍鐘爍王瑜

摘要目的：探討甲基硫代腺苷(MTA)對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖的影響及其轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)機制。方法：采用MTT比色技術(shù)及細(xì)胞計數(shù)作生存曲線的方法分析MTA對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖的影響，并采用Realtime PCR的方法分析RNA聚合酶Ⅲ依賴基因(tRNAs、5S rRNA)。結(jié)果：0.5、1、2、3mmol/L MTA作用16h后，RKO細(xì)胞的增殖能力分別為對照組的(84.1±4.5)%、(69.4±5.2)%、(55.3±3.8)%、(40.9±3.5)%(P均<0.01)；MTA 0.5mmol/L作用4、8 h后，RKO細(xì)胞tRNAs、5S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為對照組的0.584±0.033、0.624±0.035，0.453±0.025、0.372±0.027(P均﹤0.01)。結(jié)論：MTA對RKO細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤活性，且對RNA聚合酶Ⅲ依賴基因轉(zhuǎn)錄的下調(diào)可能起到重要作用。

主題詞@甲基硫代腺苷結(jié)腸腫瘤/病理學(xué)細(xì)胞增殖RNA聚合酶Ⅲ

甲基硫代腺苷(Methylthioadenosine,MTA)是多胺和蛋氨酸代謝過程中的代謝產(chǎn)物。我們以往的研究表明MTA對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用[1]。本研究為明確其具體機制，著重研究MTA對結(jié)腸癌RNA聚合酶Ⅲ依賴基因(tRNAs、5S rRNA)的轉(zhuǎn)錄水平的影響，旨在為MTA的臨床使用提供實驗理論依據(jù)。

材料和方法

1材料 結(jié)腸癌RKO細(xì)胞購自ATCC公司；MTA，MTT(噻唑藍(lán))購自Sigma公司，MTA用二甲亞砜配成0.5 mmol/L溶劑；RKO細(xì)胞用含100 mL/L小牛血清MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；RNA提取試劑盒購自Genemega公司；cDNA合成試劑盒(編號28025-013)、RNaseOUT 核酸抑制劑(編號10777-019)、隨機引物(編號48190-011)、0.1MDTT(編號00147)購自invitrogen公司；RT-PCR引物設(shè)計如下：tRNAs(F) 5’-GTC AGG ATG GCC GAG TGG TCT AAG-3’, (R) 5’-CCA CGC CTC CAT ACG GAG AAC CAG AAG ACC C-3’； 5S rRNA(F)5’-GGC CAT ACC ACC CTG AAC GC-3’，(R)5’-CAG CAC CCG GTA TTC CCA GG- 3’。

2方法

2.1細(xì)胞增殖檢測：實驗分為對照組和MTA組，藥物處理前1 d種植于6孔板。MTA的濃度分別為0.5、1、2及3 mmol/L，處理過程中使每組均含有等量的二甲基亞砜。每一分組均另有2個復(fù)孔， MTA的作用時間均為16 h。在細(xì)胞被處理16 h后，棄去培養(yǎng)液，加入5 g/L MTT溶液(M-0283)100 μl后，再加入新鮮培養(yǎng)液1 ml。培養(yǎng)箱中放置4 h后，直接加入MTT溶解劑(M-0408)1 ml，輕輕震蕩使結(jié)晶充分溶解，用比色分光儀檢測A570nm和A690nm，用A570nm減去A690nm的背景值，該差值與該組存活細(xì)胞數(shù)成正比。

2.2生存曲線的繪制:實驗細(xì)胞分為對照組和MTA組，藥物處理前6h種植于6孔板中，初始RKO細(xì)胞數(shù)為40000個/孔，MTA的濃度0.5 mmol/L，每一分組均另有20個復(fù)孔，每隔24h取各組三孔進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，其余各組更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，MTA組按1 mmol/L濃度加入MTA，共進(jìn)行7d的細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生存曲線。

2.3tRNAs、5S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平的檢測

2.3.1藥物處理及分組：實驗分為溶劑對照組，MTA組。藥物處理前夜細(xì)胞種植于6孔板中，16h后，向每孔加入甲基硫代腺苷溶液和DMSO，使其甲基硫代腺苷的終濃度分別為0mmol/L，0.5mmol/L，并使各組含有等量DMSO，藥物處理時間為4、8h。

2.3.2Realtime PCR：在細(xì)胞被處理后，經(jīng)過以下步驟：總RNA的提取(EZgeno 總RNA提取試劑盒)、cDNA的合成(M-MLV Reverse Transcriptase 試劑盒)、用合成的cDNA進(jìn)行Realtime PCR：① 向96孔板中加入：Realtime 反應(yīng)混合液SYBR Green 10μl、相應(yīng)引物各0.5μl、cDNA5μl(1∶100稀釋)、水4μl。②每個樣品要在同一塊反應(yīng)板中除檢測待測基因外，還需同時檢測看家基因HPRT,每個反應(yīng)在同一塊反應(yīng)板中至少重復(fù)2次。③加樣后，在Realtime PCR儀中按以下反應(yīng)程序進(jìn)行：①95℃15min；②95℃15s、61℃35s，循環(huán)40次；③72℃5min；④ 4℃ forever。反應(yīng)完成后，Realtime PCR儀反應(yīng)程序?qū)⑻峁┟總€反應(yīng)孔在同一“門檻”下的Ct值。

3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 MTA對細(xì)胞增殖的影響與對照組比較，5’-MTA 0.5、1、2、3 mmol/L 作用16 h后，RKO細(xì)胞存活率分別為(84.1±4.5)% 、(69.4±5.2)%、(55.3±3.8)%、(40.9±3.5)%(P均<0.01)。重復(fù)4次實驗。說明5’-MTA 0.5 mmol/L以上可明顯抑制RKO細(xì)胞的增殖，這種誘導(dǎo)作用存在劑量依賴關(guān)系。

2MTA作用于RKO細(xì)胞的生存曲線與對照組相比，RKO細(xì)胞在0.5 mmol/L MTA作用下，1～7d內(nèi)，腫瘤細(xì)胞的增殖受到了明顯的抑制(附圖)。

3MTA處理結(jié)腸癌RKO細(xì)胞tRNAs、5S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平變化Realtime PCR分析結(jié)果表明：MTA 0.5mmol/L作用4、8h后，設(shè)定對照組的值為1，tRNAs、5S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平見附表。說明0.5mM MTA作用于RKO細(xì)胞后，4、8h時間點上tRNAs、5S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。

附圖　MTA處理結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的生存曲線

4h8htRNAs0.584±0.0330.453±0.0255SrRNA0.624±0.0350.372±0.027

注：以上各組與對照組相比較,P<0.05

討論

許多腫瘤細(xì)胞的普遍特征是缺乏MTA代謝的關(guān)鍵酶MTA磷酸化酶的活性(MTAP)[2]。缺乏MTAP的細(xì)胞分泌MTA，而不是通過代謝途徑分解MTA。人們根據(jù)這一特點想到了提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的MTA濃度可能會抑制腫瘤細(xì)胞的生長[3]。研究表明，當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)MTA濃度增高后，就會產(chǎn)生對腫瘤的增殖、侵襲性和腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生抑制作用[4]。腫瘤細(xì)胞的這一代謝特點引起了人們的注意，因為這可以用于腫瘤的藥物治療。使用抗代謝藥物如氨甲蝶呤阻斷嘌呤的生物合成，可以有效的殺死MTAP活性的缺乏腫瘤細(xì)胞，正常細(xì)胞可通過MTA生成腺苷的途徑而得到保護(hù)。由此可見，MTA的治療會對正常細(xì)胞起保護(hù)性的作用。這種差別的原因目前還不清楚。有一種解釋是可能由于這兩種細(xì)胞含MTAP的不同，導(dǎo)致了它們在MTA的代謝的不同。更為重要的是，有研究表明長時間給予老鼠高濃度MTA并未發(fā)現(xiàn)有副作用出現(xiàn)。Tony等[5]通過建立炎癥物質(zhì)誘導(dǎo)鼠產(chǎn)生結(jié)腸癌的動物模型，發(fā)現(xiàn)MTA可明顯抑制炎癥物質(zhì)誘導(dǎo)的鼠結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

腫瘤細(xì)胞有一個共同的特征：核漿比例失調(diào)，核仁肥大。這個特征是臨床對腫瘤病理診斷的一個重要指標(biāo)，至今已沿用了一個多世紀(jì)。研究表明：核糖核酸RNA(rRNA)在細(xì)胞的核仁由RNA聚合酶I 和III轉(zhuǎn)錄而成。RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄18S和28S 等RNAs，其分子量巨大。而RNA 聚合酶III轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是一些小片斷的無翻譯作用的RNA，其分子常在200個核苷酸以內(nèi)，包括tRNAs 和 5S rRNAs[6]。這些小分子RNA 直接參與蛋白質(zhì)的合成。tRNAs 和5S rRNA 的多寡與細(xì)胞的生長，增殖和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。研究表明：原癌基因蛋白如Ras, c-Jun和c-Myc 促進(jìn)Pol III 基因的轉(zhuǎn)錄，而抑癌基因蛋白如pRb, p53, PTEN和Maf1抑制Pol III基因的轉(zhuǎn)錄[7]。

本研究結(jié)果表明，0.5 mM以上不同濃度的MTA均可明顯抑制RKO細(xì)胞的增殖， RKO細(xì)胞在MTA作用下，1～7d內(nèi)，腫瘤細(xì)胞的增殖受到了明顯的抑制。以上實驗提示，MTA對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖抑制作用是明確的，且存在劑量依賴關(guān)系和長時間的有效性。本研究同時也提示結(jié)腸癌RKO細(xì)胞MTA作用后均出現(xiàn)tRNAs, 5S rRNAs轉(zhuǎn)錄水平水平的下調(diào)，這就從另一方面表明MTA對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的抗腫瘤活性，并從RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控角度分析了MTA對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制的作用機制。同時我們也認(rèn)為，RNA 聚合酶III轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是一多因素、多步驟的過程，尤其是MTA對乳腺癌細(xì)胞RNA 聚合酶III的亞單位TBP、Brf1及Bdp1是如何影響的，應(yīng)成為我們今后進(jìn)一步研究的方向。這些研究將為MTA的臨床推廣提供實驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[7] Zhong Q, Shi G, Zhang Q,etal. Role of phosphorylated histone H3 serine 10 in DEN-induced deregulation of Pol III genes and cell proliferation and transformation[J]. Carcinogenesis, 2013, 34: 2460-2469.

(收稿：2015-04-15)

【中圖分類號】R364.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.007

*河北省唐山市科技支撐項目(14130260B)

▲通訊作者