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BDH2基因過表達(dá)對(duì)啤酒酵母雙乙酰代謝的影響

石婷婷，李憑，肖冬光*

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津,300457)

摘要利用基因工程手段，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增啤酒酵母S2中的雙乙酰還原酶基因BDH2，構(gòu)建了BDH2基因整合過表達(dá)的重組酵母菌株B2Z。利用real-time PCR的方法對(duì)酵母BDH2基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，相比于出發(fā)菌株，其BDH2基因的表達(dá)水平提高到原來的7.35倍。啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，BDH2基因的過表達(dá)對(duì)雙乙酰的降低有效果，B2Z雙乙酰的峰值和雙乙酰最終含量比出發(fā)菌株S2分別降低42.61%和32.73%，其他啤酒指標(biāo)如酒精度、發(fā)酵度、殘?zhí)呛惋L(fēng)味物質(zhì)與出發(fā)菌株略有變化，但各物質(zhì)的濃度都在優(yōu)質(zhì)啤酒建議的范圍之內(nèi)，符合啤酒發(fā)酵的指標(biāo)要求。

關(guān)鍵詞啤酒；BDH2基因；基因工程；釀造；雙乙酰

雙乙酰是啤酒發(fā)酵過程中的重要副產(chǎn)物，它與2,3-戊二酮合稱為連二酮，連二酮是影響啤酒風(fēng)味成熟的重要物質(zhì)。啤酒中2,3-戊二酮的含量遠(yuǎn)低于雙乙酰，但是2,3-戊二酮的風(fēng)味閾值又大大高于雙乙酰，因此，雙乙酰是決定啤酒風(fēng)味成熟的重要物質(zhì)，當(dāng)啤酒中雙乙酰的含量超過閾值就會(huì)產(chǎn)生一種令人不愉快的搜飯味，影響啤酒的感官質(zhì)量[1-3]。

雙乙酰是由啤酒酵母細(xì)胞通過纈氨酸代謝途徑產(chǎn)生的α-乙酰乳酸(α-acetolactate)產(chǎn)生的，分泌至細(xì)胞外的α-乙酰乳酸經(jīng)過非酶促的氧化脫羧反應(yīng)自生合成雙乙酰，生成的雙乙酰被酵母重新吸收，在雙乙酰還原酶的作用下被還原成乙偶姻，乙偶姻被乙偶姻還原酶進(jìn)一步還原成2,3-丁二醇，再次分泌至細(xì)胞外[4-6]，乙偶姻在啤酒中的風(fēng)味閾值為3～50 mg/L，遠(yuǎn)大于雙乙酰的0.1 mg/L，可促進(jìn)啤酒口味達(dá)到成熟[7]。但在后酵和貯酒過程中，酵母數(shù)量少，且還原雙乙酰的速度慢，造成雙乙酰還原周期長(zhǎng)，一般在啤酒發(fā)酵后期還原雙乙酰需要約5～10 d[8]，此階段占啤酒釀造過程總時(shí)間的60%以上，因而雙乙酰的形成與消除是啤酒風(fēng)味成熟的重要限速步驟。BDH2基因所編碼的雙乙酰還原酶是雙乙酰還原成乙偶姻過程中的關(guān)鍵酶[9]，增加BDH2基因的拷貝數(shù)，可加快雙乙酰的還原，減少雙乙酰。本研究通過分子生物學(xué)的方法，將BDH2基因置于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子后，在啤酒工業(yè)酵母中進(jìn)行了加強(qiáng)表達(dá)，并進(jìn)行啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵液中雙乙酰的含量變化及其發(fā)酵性能，并利用real-time PCR的方法對(duì)酵母BDH2基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。

1材料和方法

1.1菌株和質(zhì)粒(表1)

表1　本實(shí)驗(yàn)所使用菌株和質(zhì)粒

1.2試劑和工具酶

引物，委托鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成；高保真性DNA 擴(kuò)增酶采用TransTaqHiFi，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、去磷酸化酶購自大連寶生物公司；DNA提取試劑盒購自大連寶生物公司；G418、氨芐青霉素購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鮭魚精DNA，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3主要培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：10 g/L酵母提取物，20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

YEPD(G418)培養(yǎng)基：YEPD固體培養(yǎng)基溶化后，降溫至60℃左右時(shí)加入一定量的G418儲(chǔ)存液，使得G418的最終質(zhì)量濃度為600 mg/L。

LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

LB(Ampr)培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基溶化后，降溫至60 ℃左右時(shí)加入一定體積的100 mg/mL的氨芐青霉素溶液，使得氨芐青霉素的最終質(zhì)量濃度為100 mg/L。

麥芽汁培養(yǎng)基：稱量一定量的粉碎的麥芽，按1∶4的料水比于65 ℃糖化至碘檢完畢，用糖度計(jì)調(diào)整外觀糖度至12°Brix，115 ℃滅菌20 min。

以上培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需加20 g/L瓊脂。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1引物設(shè)計(jì)(表2)

表2　本研究所用引物

1.4.2E.coli的轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增好的片段在E.coli中進(jìn)行轉(zhuǎn)化[10]，構(gòu)建BDH2過表達(dá)質(zhì)粒。

1.4.3啤酒酵母的轉(zhuǎn)化劑轉(zhuǎn)化子鑒定

酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[11]。并且利用G418篩選轉(zhuǎn)化子，提取酵母轉(zhuǎn)化子的基因組后采用PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化子上不同位置的引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證， 如果能夠擴(kuò)增得到預(yù)期大小的條帶，則說明是正確的轉(zhuǎn)化子。

1.4.4BDH2基因表達(dá)量的測(cè)定

利用real-time PCR的方法[12]檢測(cè)BDH2基因表達(dá)量的變化。

1.4.5CO2失重的測(cè)定

發(fā)酵初期每天稱重測(cè)定發(fā)酵液的質(zhì)量。

1.4.6雙乙酰的測(cè)定(啤酒分析方法)

應(yīng)用采用鄰苯二胺比色法測(cè)定[13]。

1.4.7還原糖、酒精度及發(fā)酵度的測(cè)定

還原糖采用斐林試劑法測(cè)定[14]；酒精度和發(fā)酵度的測(cè)定依據(jù)啤酒分析方法進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.4.8風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

啤酒發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后采用氣相色譜法測(cè)定。內(nèi)標(biāo)物為乙酸正戊酯。氣相色譜儀為Agilent 7890C；色譜柱 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 260 ℃：30 m×320 μm×0.5 μm，配FID檢測(cè)器。載氣為高純氮，流速2.5 mL/min。起始柱溫為50 ℃，保持2 min，以 5℃/min的升溫速度升至80 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min 的升溫速度升至100 ℃。檢測(cè)器溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，進(jìn)樣量為0.4 μL。分流方式為分流，分流比為20∶1。

1.5啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

一級(jí)種子培養(yǎng)：取斜面菌種1環(huán)，接種于裝有5 mL的12 °Brix麥汁培養(yǎng)基的試管中，在28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)：一級(jí)種子液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量接入盛有50 mL的12 °Brix麥汁的150 mL三角瓶?jī)?nèi)，16 ℃靜置培養(yǎng)72 h。

啤酒發(fā)酵：二級(jí)種子液經(jīng)過離心得到酵母泥，酵母泥按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的接種量接入盛有250 mL的12 °Brix麥汁的三角瓶?jī)?nèi)，10 ℃靜置發(fā)酵9 d，4 ℃后酵至15 d。

2結(jié)果與分析

2.1BDH2過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

選用一種酵母菌游離型質(zhì)粒穿梭載體YEp352，一種組成型表達(dá)的釀酒酵母強(qiáng)啟動(dòng)子PGK，使插入到PGK啟動(dòng)子和終止子之間的目的基因可以在釀酒酵母中過量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究的出發(fā)釀酒酵母菌株對(duì)G418敏感，因此選擇G418抗性作為篩選標(biāo)記。

游離型質(zhì)粒穿梭載體YEp352和PGK片段經(jīng)BamHI 和SalI 酶切處理后，用DNA連接酶過夜連接，將PGK連接到Y(jié)EP352質(zhì)粒上；克隆目的基因BDH2，經(jīng)XhoI酶切處理并去磷酸化后，插入表達(dá)載體YEP352上的PGK啟動(dòng)子和終止子之間；KANMX基因盒從PUG6質(zhì)粒上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)BamHI酶切處理后并去磷酸化，連接到表達(dá)載體YEP352上的BamHI位點(diǎn)。成功構(gòu)建了含有PGK1強(qiáng)啟動(dòng)子、目的基因BDH2和KANMX抗性基因的BDH2過表達(dá)重組質(zhì)粒YEP-KPB2，見圖1。

圖1　重組質(zhì)粒YEP-KPB2構(gòu)建的流程Fig.1　Construction of recombinant plasmid YEP-KPB2

2.2重組酵母菌株的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒YEP-KPB2為模板，GB2-UP和GB2-DOWN為引物擴(kuò)增擴(kuò)增得到重組片段“KanMXPGK+BDH2”。然后利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法使敲除盒與出發(fā)菌株S2基因組的BDH2基因上發(fā)生同源重組，生長(zhǎng)在G418質(zhì)量濃度為600 mg/L的YEPD平板上。對(duì)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，即以轉(zhuǎn)化子基因組為模板，以K-UP和K-DOWN為引物，能夠擴(kuò)增得到1 600 bp的片段，與理論上KanMX基因大小一致，說明KanMX基因已經(jīng)整合入轉(zhuǎn)化子染色體上；再次，驗(yàn)證重組片段的各個(gè)組件是否都發(fā)生了正確的重組，以YZ-SUP和YZ-SDOWN為引物，能夠擴(kuò)增得到481 bp的片段；以YZ-XUP和YZ-XDOWN為引物，能夠擴(kuò)增得到780 bp的片段，并以出發(fā)菌株S2的基因組為對(duì)照模板，沒有PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，說明轉(zhuǎn)化子發(fā)生了正確的同源重組。轉(zhuǎn)化子的PCR 驗(yàn)證結(jié)果見圖2。最終篩選得到BDH2基因整合過表達(dá)的重組菌株，命名為B2Z。

圖2　BDH2整合過表達(dá)重組菌株P(guān)CR驗(yàn)證Fig. 2　PCR analysis of the yeast recombinants with BDH2 overexpression1, 2 以K-UP和K-DOWN為引物進(jìn)行驗(yàn)證；3, 4 以YZ-SUP和YZ-SDOWN為引物進(jìn)行驗(yàn)證；5, 6 以YZ-XUP和YZ-XDOWN為引物進(jìn)行驗(yàn)證；1, 3, 5 模板為出發(fā)菌株S2的基因組；2, 4, 6 模板為BDH2整合過表達(dá)重組菌株B2Z的基因組

2.3BDH2基因表達(dá)量的測(cè)定

利用real-time PCR的方法對(duì)酵母BDH2基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，見圖3。

圖3　重組菌株與出發(fā)菌株BDH2基因表達(dá)量對(duì)比Fig.3　Measurement of of expression levels of BDH2 gene in the recombinant strain and the host strain by real time PCR

由圖3可知，BDH2基因的過表達(dá)，增加了BDH2基因的拷貝數(shù)，重組菌株相比于出發(fā)菌株，其BDH2基因的表達(dá)水平提高到原來的7.35倍。

2.4啤酒發(fā)酵期間CO2失重的變化

從發(fā)酵開始到發(fā)酵第9天，每天稱重發(fā)酵液的質(zhì)量，計(jì)算累計(jì)CO2失重，比較重組菌株和出發(fā)菌株的發(fā)酵速率，見圖4。

圖4　重組菌株和出發(fā)菌株累計(jì)CO2失重的對(duì)比Fig. 4　Comparison of cumulative CO2 weightlessness of the recombinant yeast strain and the host strain

由圖4可知，重組菌株B2Z和出發(fā)菌株S2，在發(fā)酵2～7 d累計(jì)CO2失重均呈對(duì)數(shù)值增加，在第9天時(shí)基本不再增加，期間，重組菌株B2Z的累計(jì)CO2失重比出發(fā)菌株S2略低，但是整體發(fā)酵趨勢(shì)與S2一致，說明BDH2基因的過表達(dá)沒有影響酵母的生長(zhǎng)速率，也沒有影響啤酒發(fā)酵的速度。

2.5重組菌株與出發(fā)菌株雙乙酰代謝的比較

在啤酒發(fā)酵過程中測(cè)定了重組菌株和出發(fā)菌株的雙乙酰的峰值，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定了各菌株的雙乙酰含量，見圖5。

圖5　重組菌株與出發(fā)菌株雙乙酰代謝的對(duì)比Fig. 5　Comparison of diacetyl metabolic of the recombinant yeast strain and the host strain

由圖5可知，在啤酒發(fā)酵過程中，重組菌株的雙乙酰峰值比出發(fā)菌株降低了，出發(fā)菌株S2，重組菌株B2Z的雙乙酰峰值分別為1.15 mg/L和0.66 mg/L，比出發(fā)菌株S2降低了42.61%；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，出發(fā)菌株S2，重組菌株B2Z的雙乙酰最終含量分別為0.55 mg/L和0.37mg/L，比出發(fā)菌株S2降低了32.73%。研究發(fā)現(xiàn)，利用質(zhì)粒Yep352和磷酸甘油酸激酶基因PGK1的啟動(dòng)子，將啟動(dòng)子PGK1插入Yep352質(zhì)粒中，驅(qū)動(dòng)了下游目的基因BDH2的表達(dá)，使其拷貝數(shù)得以增加，提高目的基因BDH2的基因表達(dá)水平，可以降低雙乙酰的含量，BDH2基因的過表達(dá)對(duì)啤酒發(fā)酵中雙乙酰的降低有效果。

2.6啤酒發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)恰⒕凭燃鞍l(fā)酵度的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定了各重組酵母菌株與初發(fā)菌株的酒精度，真正發(fā)酵度和殘?zhí)牵姳?。

表3　重組菌株與出發(fā)菌株酒精度、真正發(fā)酵度

由表3看出，在發(fā)酵結(jié)束后重組菌株相比于出發(fā)菌株，殘?zhí)锹愿?，酒精度略低于S2。在發(fā)酵結(jié)束后重組菌株與出發(fā)菌株在酒精度、殘?zhí)?、外觀發(fā)酵度和真正發(fā)酵度等指標(biāo)上沒有明顯差異，并且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，說明BDH2基因的過表達(dá)并沒有明顯影響到這些啤酒基礎(chǔ)指標(biāo)，重組菌株符合啤酒發(fā)酵的指標(biāo)要求，具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力。

2.7啤酒發(fā)酵結(jié)束后風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定了各重組酵母菌株與初發(fā)菌株之間代謝產(chǎn)生主要高級(jí)醇和酯類物質(zhì)，見表4。

結(jié)果表明，BDH2基因過表達(dá)的重組酵母菌株與出發(fā)菌株釀制的啤酒相比，其發(fā)酵液中含有的某些主要高級(jí)醇和乙酸乙酯的量有所降低，乳酸乙酯和乙偶姻的量有所提高。這可能是雙乙酰代謝途徑某些物質(zhì)代謝流發(fā)生變化導(dǎo)致一些醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)代謝能力的變化，BDH2基因的過表達(dá)降低了雙乙酰的含量，使雙乙酰還原為乙偶姻，因此乙偶姻的含量提高了。雖然各風(fēng)味物質(zhì)的量有所變化，但都在優(yōu)質(zhì)啤酒建議的范圍之內(nèi)。

表4重組菌株與出發(fā)菌株風(fēng)味物質(zhì)的比較

單位：mg/L

注：a代表重組菌株與出發(fā)菌株代謝產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的量具有明顯的差異(Student’s t testP≤0.05)。

3結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室保藏菌株為出發(fā)菌株，利用分子生物學(xué)方法對(duì)BDH2基因進(jìn)行了整合過表達(dá)。進(jìn)行啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示BDH2基因的過表達(dá)確實(shí)能有效的降低雙乙酰的含量，與出發(fā)菌株S2相比，雙乙酰峰值降低了42.61%，最終雙乙酰含量降低了32.73%。 利用real-time PCR的方法對(duì)酵母BDH2基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，相比于出發(fā)菌株，其BDH2基因的表達(dá)水平提高到原來的7.35倍。在啤酒發(fā)酵中，雙乙酰的閾值范圍為0.1～0.15 mg/L，本文中的啤酒發(fā)酵是實(shí)驗(yàn)室三角瓶小試發(fā)酵，未能達(dá)到工業(yè)上啤酒發(fā)酵的條件，因此，在后期雙乙酰還原時(shí)未能使雙乙酰還原到其閾值范圍。其他啤酒指標(biāo)如酒精度、發(fā)酵度、殘?zhí)呛惋L(fēng)味物質(zhì)比出發(fā)菌株略有變化，但各物質(zhì)的濃度都在優(yōu)質(zhì)啤酒建議的范圍之內(nèi)，符合啤酒發(fā)酵的指標(biāo)要求。

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Effects of overexpression ofBDH2 gene on diacetyl metabolic in beer yeast

SHI Ting-ting，LI Ping，XIAO Dong-guang*

(Key Lab of Industrial Fermenting Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China)

ABSTRACTIn this paper, new industrial brewer’s yeast strains B2Z with BDH2 gene overexpression was constructed using genetic engineering by PCR amplification of the diacetyl reductase gene BDH2 in beer yeast S2. The expression levels of BDH2 gene in the recombinant strain and the host strain was measured by real time PCR, and compared with the host strain, the BDH2 gene expression level of B2Z was increased to 7.35 times. Beer fermentation experiments showed that overexpression of BDH2 gene could reduce the production of diacetyl, and the diacetyl peak and diacetyl concentration were decreased by 42.61% and 32.73% compared with those in the host strain S2. Other indicators such as alcohol, beer fermentation degree, residual sugar and flavor changed slightly, but were still in the suggested range of high quality beer, and conformed to the index requirements of beer fermentation.

Key wordsbeer; BDH2 gene; genetic engineering; brewing; diacetyl

收稿日期：2015-09-23，改回日期：2015-11-09

基金項(xiàng)目：食品微生物基因組改造(國(guó)家863計(jì)劃)(2012AA022108)；教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”(IRT1166)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602003
第一作者：博士(肖冬光教授為通訊作者，E-mail:xiao99@tust.edu.cn)。