王付才，張震宇，孫付保，姚動邦，周楊

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

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1株產(chǎn)順式-4-羥基-L-脯氨酸基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵初步優(yōu)化

王付才，張震宇*，孫付保*，姚動邦，周楊

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

摘要順式-4-羥基-L-脯氨酸是一種可用于合成多種藥物和香料的手性結(jié)構(gòu)物質(zhì)。通過對L-脯氨酸順式-4-羥化酶基因的優(yōu)化設(shè)計，并引入色氨酸串聯(lián)啟動子，構(gòu)建出1株能表達(dá)L-脯氨酸順式-4-羥化酶的重組大腸桿菌JM109/pEHC4，從而可以將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為順式-4-羥基-L-脯氨酸。對該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，得出優(yōu)選培養(yǎng)基為(g/L)：葡萄糖10，甘油10，蛋白胨10，NaCl 6，F(xiàn)eSO4 ·7H2O 0.278，L-抗壞血酸0.528，(NH4)2SO(4 ) 5，K2HPO4 1，MgSO4 0.2，CaCl(2 )0.015，L-脯氨酸4。在該條件下發(fā)酵12 h，順式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到657.08 mg/L，比優(yōu)化前提高了3.76倍；在24 h時產(chǎn)量達(dá)到1 582.75 mg/L。研究結(jié)果為順式-4-羥基-L-脯氨酸的微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞L-脯氨酸順式-4-羥化酶；密碼子優(yōu)化；重組大腸桿菌；微生物轉(zhuǎn)化；發(fā)酵優(yōu)化

L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline，L-Hyp)，是L-脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物。根據(jù)其羥基化位置及空間結(jié)構(gòu)的不同，可形成4種立體異構(gòu)體：反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hyp)、順式-4-羥基-L-脯氨酸(cis-4-Hyp)、反式-3-羥基-L-脯氨酸(trans-3-Hyp)和順式-3-羥基-L-脯氨酸(cis-3-Hyp)。其中cis-4-Hyp是一種重要的手性結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可以用于藥物以及香料制造。特別是在制藥領(lǐng)域，cis-4-Hyp可以防止前膠原折疊成穩(wěn)定的三級螺旋構(gòu)象，從而減少纖維化和腫瘤細(xì)胞生長過程中膠原的過度沉積[1-2]，因此其可用作抗纖維化、抗腫瘤[3]和抗高血壓藥物[4]。

在自然界中，cis-4-Hyp存在于鬼筆鵝膏毒性肽的水解產(chǎn)物鬼筆毒素中[5]，也以游離的形式存在于檀香木中[6]，但在哺乳動物系統(tǒng)中未知。目前cis-4-Hyp主要通過trans-4-Hyp的差向異構(gòu)化反應(yīng)[7]或者復(fù)雜的化學(xué)全合成[8]來獲得，然而差向異構(gòu)化合成中用到的trans-4-Hyp本身就是一種價格昂貴的化學(xué)物質(zhì)，而化學(xué)合成法生產(chǎn)cis-4-Hyp難度大，工藝繁瑣，生產(chǎn)成本高。與化學(xué)合成法相比，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)cis-4-Hyp具有操作簡便、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、無環(huán)境污染、成本低等多種優(yōu)點，所以以微生物轉(zhuǎn)化法為基礎(chǔ)的cis-4-Hyp生產(chǎn)方法必然成為趨勢。

據(jù)報道，有多種微生物表現(xiàn)出L-脯氨酸順式-4-羥化酶(cis-P4H)活性[9]。2009年，HARA等[10]人首次發(fā)現(xiàn)可以將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為cis-4-Hyp的微生物，包括百脈根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)以及苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)。并且發(fā)現(xiàn)cis-P4H屬于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族[10-11]，酶催化反應(yīng)需要非血紅素亞鐵離子以及O2的參與。然而，其在cis-4-Hyp生產(chǎn)過程中需要用到有毒性的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，以及菌體培養(yǎng)與酶轉(zhuǎn)化過程分步進(jìn)行的問題使得整個過程較為復(fù)雜并且增加了生產(chǎn)成本。目前，國內(nèi)尚沒有微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)cis-4-Hyp的報道。

本研究中通過優(yōu)化cis-P4H基因后，構(gòu)建出1株適合在大腸桿菌中表達(dá)的含有色氨酸串聯(lián)啟動子(Ptrp2)的cis-P4H表達(dá)工程菌E.coliJM109/pEHC4。并對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定了cis-4-Hyp生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基組成及濃度，為以后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

菌株E.coliBL21(DE3)、JM109、DH5α、W3110、SCS110為本實驗室保存；克隆表達(dá)載體pES(pUC19改造型)購于上海旭冠公司。

1.1.2酶和試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III和BamH I以及T4DNA連接酶、DNA Marker均購自Takara公司；胰蛋白胨、蛋白胨、DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購自上海生工生物公司；cis-4-Hyp標(biāo)準(zhǔn)品購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；酵母提取物購自O(shè)xoid公司；其他常用試劑均購自國藥試劑。

1.1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10 ，酵母提取物5 ，NaCl 10 ，pH 7.0；固體培養(yǎng)基需加入15～20 g/L的瓊脂粉。初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，甘油5，胰蛋白胨8，(NH4)2SO45，K2HPO41，NaCl 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.278，MgSO40.2，CaCl20.015，L-脯氨酸 4，pH 6.5。

1.2實驗方法

1.2.1cis-P4H基因的優(yōu)化

根據(jù)已公布的苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的cis-P4H基因序列(其原始基因序列見NCBI Gene ID: 14808181)，在Jcat(http://www.jcat.de/)上進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使目的基因更適合在大腸桿菌中表達(dá)，同時消除常用酶切位點，并將原始序列中的終止密碼子修改為TAAT強終止子，再使用RNAstructure 5.3軟件優(yōu)化mRNA的二級結(jié)構(gòu)。在經(jīng)兩次優(yōu)化的序列5’端加上Hind III，3’端加上BamH I酶切位點，以利于后續(xù)的操作。優(yōu)化后的cis-P4H基因由上海旭冠公司合成并連接到pES載體上，即pES-hypc4。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在cis-P4H基因表達(dá)的過程中選用了不需要誘導(dǎo)劑的強組成型啟動子——色氨酸串聯(lián)啟動子(Ptrp2)。將已合成好的含cis-P4H基因的質(zhì)粒pES-hypc4與本實驗室保藏含Ptrp2的載體同時經(jīng)Hind III、BamH I雙酶切，膠回收后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pES-Ptrp2-hypc4(pEHC4)。

1.2.3重組菌培養(yǎng)及cis-4-Hyp的微生物轉(zhuǎn)化方法

種子培養(yǎng):挑取活化后的JM109/pEHC4單菌落接種到含有氨芐抗性的30 mL(250 mL錐形瓶)LB培養(yǎng)基中，37 °C，220 r/min培養(yǎng)大約8 h。發(fā)酵培養(yǎng):按6%的接種量將種子液接入30 mL(250 mL錐形瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C，220 r/min培養(yǎng)12 h。微生物轉(zhuǎn)化：過濾除菌后的4 g/L的底物L(fēng)-脯氨酸在接種時一并加入培養(yǎng)基中，L-脯氨酸隨著菌體的生長和產(chǎn)酶過程一同轉(zhuǎn)化，12 h后測定發(fā)酵液中底物L(fēng)-脯氨酸轉(zhuǎn)化為cis-4-Hyp的量。

1.2.4cis-4-Hyp濃度測定方法

參考文獻(xiàn)[12]利用氯胺T法測定，由于培養(yǎng)基的影響，其中空白對照實驗為10.74 mg/L。

1.2.5cis-P4H酶活測定

cis-P4H酶活測定參考文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行，cis-P4H細(xì)胞活性以每1 g濕細(xì)胞的酶活性(U/g)表示，每分鐘催化生成1 μmol的cis-4-Hyp的酶活性被定義為1個單位的酶活(1 U)。酶活測定時，cis-4-Hyp的濃度利用氯胺T法測定。

1.2.6發(fā)酵培養(yǎng)基組分及濃度的選擇

實驗采用單因素條件對重組大腸桿菌JM109/pEHC4的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，包括碳源葡萄糖(1、5、10、15、20 g/L)和甘油(0、2、5、10、15 g/L)、氮源來源(分別為8 g/L的玉米漿、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母提取物)，及蛋白胨質(zhì)量濃度(5、8、10、15、20 g/L)、硫酸亞鐵濃度(0.01、0.1、1、2 mmol/L)和氯化鈉質(zhì)量濃度(2、4、6、8、10 g/L)。每個因素的實驗都是在上一因素實驗確定的最佳條件基礎(chǔ)上進(jìn)行的。

2結(jié)果與分析

2.1cis-P4H基因的優(yōu)化與合成

生物體之間密碼子使用偏愛性的差異導(dǎo)致了各種異源基因表達(dá)問題，但可以通過合理的基因優(yōu)化設(shè)計來克服。按1.2.1方法優(yōu)化cis-P4H基因，通過同義密碼子的替換調(diào)整mRNA的5’端結(jié)構(gòu)，使起始密碼子后的數(shù)個堿基組成的密碼子翻譯口袋呈現(xiàn)打開狀態(tài)(圖1)。

圖1　cis-P4H基因mRNA 5’末端二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig. 1　Potential mRNA secondary structures around the ATG start codon of the unadjusted gene (A) and the adjusted gene (B)

2.2重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

目前cis-P4H基因表達(dá)所用到的啟動子都屬于誘導(dǎo)型T7啟動子[8,10]，該啟動子的表達(dá)需要IPTG的誘導(dǎo)，并且基因表達(dá)時需要嚴(yán)格控制誘導(dǎo)時間以及誘導(dǎo)劑濃度。由于IPTG具有一定的毒性，一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG。因此，本研究通過引入不需要誘導(dǎo)的Ptrp2來解決上面的問題，并且有助于進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。

按1.2.2方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEHC4(圖2A)。將其轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后得到1 093 bp和2 692 bp左右的兩條片段(圖2B)，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1-DNA Marker DL15 000; 2-Double digestion of pEHC4 圖2　cis-P4H表達(dá)載體構(gòu)建Fig. 2　cis-P4H expression vector construction (A) The profile of the recombinant plasmid. (B) EcoR I, BamH I Double digestion of pEHC4

2.3宿主菌的選擇及cis-P4H酶活分析

將測序正確的質(zhì)粒pEHC4分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)、JM109、DH5α、W3110、SCS110五種宿主菌中，分別測定5株重組菌的cis-P4H酶活及cis-4-Hyp產(chǎn)量，結(jié)果表明重組大腸桿菌JM109/pEHC4中的酶活最高，達(dá)到285.63 mU/g，同時，cis-4-Hyp產(chǎn)量達(dá)到174.90 mg/L(表1)。

表1　不同重組菌的cis-P4H細(xì)胞活性

注：a重組菌培養(yǎng)12 h后的cis-P4H細(xì)胞活性，測定見材料與方法；b無細(xì)胞空白對照。

2.4重組菌生長曲線及種齡的選擇

種齡對微生物發(fā)酵周期有著重要影響，種齡過嫩或者過老，不但延長發(fā)酵周期，而且還會降低產(chǎn)量，發(fā)酵中一般選擇菌種生長的對數(shù)中后期為宜。挑取E.coliJM109/pEHC4單菌落接種于LB中，培養(yǎng)方法按1.2.3所述。菌種OD600與時間的關(guān)系如圖3所示。

圖3　重組大腸桿菌JM109/pEHC4生長曲線Fig.3　The growth curve of recombinant E.coli JM109/pEHC4

從圖3可以看出，菌種接入LB后，4 h開始進(jìn)入對數(shù)期，4～9 h為菌種的對數(shù)生長期，9 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。一般而言，處于對數(shù)中后期的菌種活力最高而且性狀穩(wěn)定，生命力強可以及時適應(yīng)新環(huán)境。因此，選擇最佳種齡時間為7 h。

2.5發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.5.1碳源葡萄糖質(zhì)量濃度及甘油質(zhì)量濃度對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響

對葡萄糖質(zhì)量濃度的優(yōu)化見圖4A。結(jié)果表明，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增高，cis-4-Hyp的產(chǎn)量隨之增加，在葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L時達(dá)到最大值。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度大于10 g/L時，cis-4-Hyp的產(chǎn)量和OD600值開始下降，因為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.5，偏酸性，并且葡萄糖過量會加速菌體的呼吸，在通氣不足、溶氧不能滿足需要的情況下，其代謝中間產(chǎn)物如乙酸等[13]不完全氧化而積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降，不僅會限制菌體的生長還會影響cis-P4H的酶活。一般將葡萄糖和緩慢利用的碳源組成混合碳源，這樣既有利于菌體的生長又有利于產(chǎn)物的形成。在葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L的條件下，對遲效碳源甘油濃度進(jìn)行優(yōu)化(圖4B)，結(jié)果表明甘油質(zhì)量濃度在10 g/L時，cis-4-Hyp的產(chǎn)量達(dá)到最大，并且過高濃度的甘油并不利于產(chǎn)量的提升。

圖4　葡萄糖質(zhì)量濃度(A)和甘油質(zhì)量濃度(B)對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of glucose (A) and glycerol (B) concentration on the production of cis-4-Hyp

2.5.2氮源來源及其質(zhì)量濃度對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響

對氮源進(jìn)行單因素篩選發(fā)現(xiàn)其對菌體生長狀況的影響較顯著，酵母提取物雖然有利于菌體的生長，但是并不利于cis-4-Hyp的轉(zhuǎn)化生成。當(dāng)?shù)鞍纂俗鳛榈磿r，cis-4-Hyp的產(chǎn)量達(dá)到最大(圖5A)，其余產(chǎn)量大小依次為胰蛋白胨>酵母提取物>玉米漿。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類,不僅為微生物提供氮源還提供碳源以及生長因子等。對蛋白胨濃度進(jìn)行優(yōu)化后得出最佳濃度為10 g/L,結(jié)果表明繼續(xù)增加蛋白胨的濃度，并不利于cis-4-Hyp產(chǎn)量和OD600的提升(圖5B)。

圖5　氮源來源(A)和蛋白胨質(zhì)量濃度(B)對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響Fig.5　Effect of different organic nitrogen(A) and peptone concentrations (B) on the production of cis-4-Hyp

2.5.3硫酸亞鐵濃度對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響

cis-P4H屬于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族，需要非血紅素亞鐵離子的參與。在L-抗壞血酸存在與否的條件下對發(fā)酵培養(yǎng)基中的亞鐵離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，cis-4-Hyp的產(chǎn)量最高時的亞鐵濃度為1 mmol/L左右(圖6)，而且適量的L-抗壞血酸增加了cis-4-Hyp的產(chǎn)量。這種效應(yīng)被觀察到普遍存在于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族中，一般解釋為L-抗壞血酸的存在能夠減少Fe2+催化過程中Fe3+的產(chǎn)生[8]。但是，在L-抗壞血酸濃度>3 mmol/L時，抑制作用占據(jù)優(yōu)勢。

圖6　在L-抗壞血酸存在與否的條件下，F(xiàn)eSO4濃度(摩爾比FeSO4/L-抗壞血酸=1∶3)對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響Fig.6　cis-4-Hyp production at different concentrations of FeSO4 alone and in the presence of L-ascorbate(由于濃度范圍大小超過3個數(shù)量級，所以使用對數(shù)坐標(biāo))

2.5.4氯化鈉質(zhì)量濃度對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響

脯氨酸的高親和力轉(zhuǎn)運通過由PutP基因[14]編碼的次級主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)介導(dǎo)。大腸桿菌中的Na+/脯氨酸轉(zhuǎn)運體(PutP)是一種充分表征的次級主動轉(zhuǎn)運體，脯氨酸進(jìn)入細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運依賴于Na+或Li+的電化學(xué)梯度[15]。通過對NaCl濃度的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增大菌體的OD600逐漸減小，濃度在6 g/L時cis-4-Hyp的產(chǎn)量最高(圖7)。

圖7　NaCl質(zhì)量濃度對cis-4-Hyp產(chǎn)量的影響Fig.7　Effect of NaCl concentration on the production of cis-4-Hyp

2.6優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基的驗證

經(jīng)過初步優(yōu)化后得出最佳培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，甘油10，蛋白胨10，NaCl 6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.278(1 mmol/L)，L-抗壞血酸0.528(3 mmol/L)，(NH4)2SO45，K2HPO41， MgSO40.2，CaCl20.015，脯氨酸4，pH 6.5。對優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行驗證，相同的發(fā)酵條件下，12 h后cis-4-Hyp的產(chǎn)量達(dá)到657.08 mg/L，比優(yōu)化前提高了3.76倍。并且隨著時間的延長產(chǎn)量繼續(xù)增加，在24 h達(dá)到1 582.75 mg/L(圖8)。

圖8　重組菌JM109/pEHC4發(fā)酵驗證Fig．8　Fermentation verification of recombinant E. coli JM109/pEHC4

3結(jié)論

cis-4-Hyp不僅可以用于香料制造而且可作為藥物中間體合成多種藥物，所以具有重要的商業(yè)價值。本研究通過從苜蓿中華根瘤菌中獲取cis-P4H基因，構(gòu)建了pEHC4表達(dá)載體，并在大腸桿菌JM109中成功表達(dá)。在發(fā)酵初始即將底物L(fēng)-脯氨酸一同添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，無需收集菌體作為酶源再進(jìn)行催化的分步工序，通過一步酶催化反應(yīng)生產(chǎn)cis-4-Hyp，簡化了工藝。并通過引入色氨酸串聯(lián)啟動子(Ptrp2)，在避免誘導(dǎo)劑IPTG使用的同時，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。對培養(yǎng)基初步優(yōu)化之后,重組菌JM109/pEHC4 12 h的cis-4-Hyp產(chǎn)量達(dá)到657.08 mg/L，比優(yōu)化前提高了3.76倍。此外，由于添加的底物L(fēng)-脯氨酸并未消耗完全，隨著時間的延長cis-4-Hyp的產(chǎn)量還會繼續(xù)增加。本方法為工業(yè)上生產(chǎn)cis-4-Hyp提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

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Construction ofcis-4-hydroxy-L-proline producing recombinantE.coliand preliminary optimization of its fermentation conditions

WANG Fu-cai, ZHANG Zhen-yu*, SUN Fu-bao*,YAO Dong-bang, ZHOU Yang

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

ABSTRACTcis-4-hydroxy-L-proline is a valuable chiral building block for the organic synthesis of pharmaceuticals and perfume. By optimizing the target gene and introducing a tryptophan tandem promoter recombinant strain expressing the L-proline cis-4-hydroxylases, E. coli JM109/pEHC4, was constructed. Through the expression of L-proline cis-4-hydroxylases, free L-proline was converted to cis-4-hydroxy-L-proline. The optimized medium composition contained glucose 10 g/L, glycerol 10 g/L, peptone 10 g/L, NaCl 6 g/L, FeSO4 ·7H2O 0.278 g/L, L-ascorbate 0.528 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 0.2 g/L, CaCl2 0.015 g/L, and L-proline 4 g/L. Finally, after fermentation under the optimal conditions for 12 h, cis-4-hydroxy-L-proline production reached 657.08 mg/L, which was 3.76 times higher than that before fermentation, and then reached 1 582.75 mg/L after 24 h. Microbial transformation by L-proline cis-4-hydroxylases is a potential approach for cis-4-hydroxy-L-proline production.

Key wordsL-proline cis-4-hydroxylases； codon optimization, recombinant Escherichia coli； microbial transformation； fermentation optimization

收稿日期：2015-09-07，改回日期：2015-11-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金(30970058)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012554)；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))開放課題基金(KLIB-ZR200801)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602002

第一作者：碩士研究生(張震宇教授，孫付保副教授為通訊作者，E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn;fubaosun@jiangnan.edu.cn)。