吳海龍，崔巖，成家楊

(北京大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東深圳，518055)

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綜述與專(zhuān)題評(píng)論

破囊壺菌二十二碳六烯酸(DHA)的制備工藝及應(yīng)用前景

吳海龍，崔巖，成家楊*

(北京大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東深圳，518055)

破囊壺菌具有二十 碳六烯酸( docosahexaenvic acid，DHA)含量高、油脂組成簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速率快等優(yōu)點(diǎn)，是DHA商業(yè)開(kāi)發(fā)的潛在來(lái)源。目前，破囊壺菌DHA的制備工藝還處于嘗試和探索階段，特別是破囊壺菌的發(fā)酵工藝、油脂的提取工藝和DHA的純化工藝。該文對(duì)上述工藝的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)破囊壺菌DHA的產(chǎn)業(yè)化潛力進(jìn)行了分析，為破囊壺菌DHA的工業(yè)化研究提供參考。

破囊壺菌;發(fā)酵;油脂提取;二十 碳六烯酸( DHA)純化;產(chǎn)業(yè)化

破囊壺菌( Thraustochytrids)是一類(lèi)異養(yǎng)的海洋真菌，在分類(lèi)學(xué)上屬于不等毛門(mén)( Heterokontophyta)、網(wǎng)黏菌綱( Labyrinthulomycetes)、破囊壺菌目( Thraustochytriales)、破囊壺菌科( Thraustochytriaceae)[1]。一般認(rèn)為，破囊壺菌科有7屬[2]，包括: Althorni、Ulkenia、Aplanochytrium、Japonochytrium、Labyrinthuloides、Schizochytrium和Thraustochytrium。破囊壺菌中的油脂含量能達(dá)到干重的50%以上，膽固醇含量低，90%以上脂肪酸以甘油三酯的形式存在[3];油脂的主要成分為DHA( 40%以上)和棕櫚酸( C16∶0)[4－5]，其他脂肪酸含量很少。

DHA( docosahexaenoic acid，C22∶6)全稱(chēng)是二十二碳六烯酸，又稱(chēng)“腦黃金”，也是人體自身難合成的必需脂肪酸之一，它是大腦和視網(wǎng)膜的重要組成部分，對(duì)胎嬰兒智力和視力的發(fā)育至關(guān)重要。DHA能防治心腦血管疾病，預(yù)防老年癡呆癥和神經(jīng)性疾病，抑制炎癥和改善視力，在保健品和食品領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。其中，以配方形式添加到嬰兒奶粉中，占DHA消費(fèi)總量的67%[6]。預(yù)計(jì)今后全球每年的DHA需求量將高達(dá)10萬(wàn)t，總價(jià)值在300～800億美元，市場(chǎng)潛力巨大[7]。

破囊壺菌合成DHA的途徑主要有2個(gè):脂肪酸合成酶( FAS)途徑和聚酮合酶( PKS)途徑[8]。脂肪酸合成酶( FAS)途徑是破囊壺菌中使用較多的合成途徑，具體過(guò)程見(jiàn)圖1。首先在脂肪酸合成酶的催化下由乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A經(jīng)過(guò)反應(yīng)，生成C18∶0，然后在脫飽和酶、延長(zhǎng)酶的作用下，經(jīng)C18∶3、C20∶5，最終生成C22∶6，即為DHA。聚酮合酶( PKS)途徑由乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A提供碳原子，先轉(zhuǎn)化為含有酰基載體蛋白質(zhì)( ACP)的酯類(lèi)，并在縮合酶的作用下生成3-酮丁酰中間物。隨后在酮乙基還原酶、脫水酶和烯酰還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為丁酰-ACP。最后，丙二酰輔酶A再次按上述方式連接到脂肪酰鏈上[1]，每次增加2個(gè)碳原子，逐漸延長(zhǎng)碳鏈，最終生成DHA。

圖1 FAS途徑
Fig.1 FAS pathway

目前，破囊壺菌DHA的制備工藝還處于嘗試和探索階段。圖2列出了DHA的簡(jiǎn)要生產(chǎn)流程。

圖2 DHA的簡(jiǎn)要生產(chǎn)流程
Fig.2 Production process of DHA from Thraustochytrids

為制備出高質(zhì)量的DHA產(chǎn)品，首先要對(duì)菌株進(jìn)行篩選，適宜工業(yè)化生產(chǎn)的菌株應(yīng)具備生長(zhǎng)速率快、DHA含量高、耐低鹽等特性[3]。之后，是對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究菌株的發(fā)酵條件[9－11]。最后，收集生物質(zhì)并進(jìn)行油脂提取、DHA純化工藝的研究，制備出高純度的DHA產(chǎn)品。本文將對(duì)破囊壺菌發(fā)酵、油脂提取和DHA純化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)DHA的產(chǎn)業(yè)化潛力進(jìn)行分析。

1 破囊壺菌發(fā)酵工藝

溫度、pH、鹽度和培養(yǎng)基成分等環(huán)境因子對(duì)破囊壺菌中DHA的含量均有巨大影響[12]。首先，應(yīng)優(yōu)化發(fā)酵條件，使破囊壺菌的代謝向著有利于DHA積累的方向進(jìn)行。隨后，在最佳條件下逐步擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模，最終達(dá)到工業(yè)規(guī)模[13]。表1列出了部分高產(chǎn)DHA的菌株以及各自的發(fā)酵規(guī)模和DHA產(chǎn)量。從表1中可以看出，這些菌株經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后DHA含量基本都接近或達(dá)到了40%，而且全部來(lái)自于Schizochytrium和Aurantiochytrium。

表1部分高產(chǎn)DHA的破囊壺菌
Table 1 Some Thraustochytrids of high DHA productivity

發(fā)酵方式 菌種 規(guī)模/L 時(shí)間/ h油脂產(chǎn)量/ ( g·L－1) DHA含量/% DHA產(chǎn)量/ ( g·L－1)參考文獻(xiàn)搖瓶Schizochytrium limacinum SR21 0.05 48 24.3 23.5 5.7 [20]Aurantiochytrium sp.strainTC020 0.1 69 37.0 38.9 14.4 [21]Aurantiochytrium sp.T66 0.5 167 52 30.0 15.6 [22]Aurantiochytrium sp.BL10 1 120 42.3 39.7 16.8 [14]分批培養(yǎng)Schizochytrium sp.Strain SR21 3 96 37.3 35.6 13.3 [23]Schizochytrium sp.KH105 3 96 13.2 25.8 3.4 [24]Schizochytrium sp.LU310 － 144 52.1 47.5 24.7 [15]分批補(bǔ)料培養(yǎng)Schizochytrium sp.S31 Aurantiochytrium limacinum SR21 Schizochytrium sp.CCTCC M209059 7.5 5 5 7 1 0 50 1 500 7 000 96 96 165 136 140 76.2 37.9 28.9 74.1 43.7 32.4 28.0 72.5 20.3 48.9 37.6 18.4 36.2 38.6 14.0 37.4 38.7 14.4 35.2 40.3 14.2 49.2 40.1 19.7 [16][17][18][25][19]

從表1還可以看出，搖瓶培養(yǎng)得到的DHA產(chǎn)量都在20 g/L以下，但隨著搖瓶體積的擴(kuò)大，DHA產(chǎn)量也在增大。YANG等[14]在1 L的搖瓶中培養(yǎng)Aurantiochytrium sp．BL10，120 h后油脂中DHA含量達(dá)到了39.7%，DHA產(chǎn)量達(dá)到了16.8 g/L。

部分研究采用了分批培養(yǎng)模式，DHA產(chǎn)量較搖瓶培養(yǎng)有了顯著提高。LING等[15]在發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)Schizochytrium sp．LU310，144h后油脂中DHA含量達(dá)到了37.9%，DHA產(chǎn)量達(dá)到了24.7 g/L。

分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式下的DHA產(chǎn)量則明顯高于上述兩種培養(yǎng)方式。CHANG等[16]在7.5 L發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)Schizochytrium sp．S31，96 h后油脂中DHA含量達(dá)到了47.5%，DHA產(chǎn)量達(dá)到了28.9 g/L。LI等[17]在5 L的發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料培養(yǎng)Aurantiochytrium limacinum SR21，96 h后油脂中DHA含量達(dá)到了43.7%，產(chǎn)量達(dá)到了32.4 g/L。但HUANG等[]在5 L的發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料培養(yǎng)Aurantiochytrium limacinum SR21，165 h后得到的油脂中DHA含量雖然達(dá)到了72.5%，但最終的DHA產(chǎn)量卻只有20.3 g/L，遠(yuǎn)低于LI等得到的DHA產(chǎn)量。

總體來(lái)說(shuō)，破囊壺菌的發(fā)酵規(guī)模還停留在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，基本都在10 L以下。QU等[]將Schizochytrium sp.CCTCC M209059進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)，將發(fā)酵規(guī)模從10，50 L擴(kuò)大到了1 500，7 000 L，DHA的產(chǎn)量和產(chǎn)率穩(wěn)中有升，7 000 L時(shí)DHA產(chǎn)量達(dá)到了19.7 g/L，占到總脂含量的40.1%。

2 油脂提取工藝

由于破囊壺菌的油脂主要存在于由細(xì)胞壁所包裹的破囊壺菌菌體細(xì)胞內(nèi)[26]，難分離出來(lái)，所以需要在油脂提取前對(duì)其進(jìn)行破壁處理。常見(jiàn)的破壁處理方法可分為物理破壁法和生化破壁法。物理破壁法包括高壓均質(zhì)法、機(jī)械勻漿法、反復(fù)凍融法、超聲法、微波法和研磨法。生化破壁法主要包括化學(xué)滲透法、酸熱法、堿熱法和酶溶法。吳克剛等[25]對(duì)超聲波破碎破囊壺菌細(xì)胞進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，超聲波可以有效破碎破囊壺菌細(xì)胞，使脂質(zhì)得率提高60%。破壁處理后，需要將油脂提取出來(lái)，常用的提取方法有:溶劑萃取法、直接酯化法、直接皂化法和超臨界流體萃取法。

2.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法是目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的油脂提取法之一，按操作形式可分為浸提法、攪拌熱回流法和索氏提取法等。溶劑萃取法的優(yōu)點(diǎn)是出油率高、可在低溫下進(jìn)行、動(dòng)力消耗小、易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模和自動(dòng)化生產(chǎn)，缺點(diǎn)是溶劑有易燃性和毒性，且油脂中會(huì)有溶劑殘留。溶劑萃取法的關(guān)鍵是選出合適的溶劑。實(shí)驗(yàn)室常用的溶劑有氯仿、石油醚、丙酮、己烷、甲醇和乙醇，也可使用混合溶劑，如氯仿-甲醇-水。氯仿-甲醇-水混合溶劑法是由BLIGH和DYER[27]于1959年建立的較為成熟的方法，該法的提取過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、徹底，但由于溶劑較大的毒性和易燃性，不適合用于食品工業(yè)中。BURJA等[28]用小型化的BLIGH-DYER法提取Thraustochytrium sp.ONC-T18中的油脂，油脂提取率雖然達(dá)到了71.4%(干重)，但DHA含量?jī)H為16.8%。

2.2 直接酯化法

直接酯化法是指原料與酯化試劑(乙酰氯或三氟化硼的醇溶液)進(jìn)行酯交換，該方法的優(yōu)點(diǎn)是提取率高，缺點(diǎn)是酯化試劑毒性較大。KIM等[29]用直接酯化法提取Aurantiochytrium sp.中的DHA，DHA含量達(dá)到了57.4%(干重)。

2.3 直接皂化法

直接皂化法是指原料與醇?jí)A溶液( KOH與CH3OH或C2H5OH)反應(yīng)后提取，該方法快速簡(jiǎn)便。ADAM等[27]用直接皂化法提取Thraustochytrium sp.中的油脂，油脂提取率達(dá)到了69.7%(干重)。

2.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法( supercritical fluid extraction，SFE)是一種新型的高效分離技術(shù)，特點(diǎn)是提取完成后溶劑與產(chǎn)品自動(dòng)分離，最常用的是超臨界二氧化碳萃取法( supercritical carbon dioxide，SC-CO2)。SCCO2能有效分離碳數(shù)差別較大的脂肪酸，但要把碳原子數(shù)相近的脂肪酸分開(kāi)，必須結(jié)合其他分離技術(shù)。適當(dāng)添加夾帶劑能提高溶劑的萃取能力，降低操作壓力和成本，但夾帶劑的添加也會(huì)帶來(lái)一些問(wèn)題。NILSSON[30]等發(fā)現(xiàn)，若添加乙醇作為夾帶劑，在增大脂肪酸溶解度的同時(shí)也會(huì)降低選擇性。SC-CO2不需要使用有機(jī)溶劑，萃取速度快，DHA提取率高，不影響萃取物的有效成份，適合生產(chǎn)DHA產(chǎn)品，但成本較高。TANG等[]采用超臨界CO2萃取法提取Schizochytrium limacinum中的DHA，在35 MPa、40℃、95%乙醇為夾帶劑的最佳條件下，油脂提取率達(dá)到干重的33.9%，其中的DHA含量達(dá)到了27.5%。

3 DHA純化工藝

將破囊壺菌中的油脂提取出后，需要對(duì)DHA進(jìn)行純化，進(jìn)一步提高純度。目前常用的純化方法包括低溫結(jié)晶法、銀離子絡(luò)合法、分子蒸餾法、尿素包合法和脂肪酶催化反應(yīng)法。

3.1 低溫結(jié)晶法

低溫結(jié)晶法利用雙鍵數(shù)不同的脂肪酸在有機(jī)溶劑中溶解度的差異進(jìn)行分離純化，而這種差異在低溫下更顯著。該法操作簡(jiǎn)單方便，但產(chǎn)率較低，需使用大量有機(jī)溶劑，且溶劑會(huì)有殘留，故常作為預(yù)濃縮方法與其他方法配合使用[32]。

3.2 銀離子絡(luò)合法

銀離子絡(luò)合法是按脂肪酸碳雙鍵數(shù)目的差異分離各組分。研究表明[33]，當(dāng)不飽和脂肪酸的碳數(shù)與其所含的雙鍵數(shù)的比值小于等于6時(shí)絡(luò)合反應(yīng)才可能進(jìn)行，對(duì)于飽和、單不飽和脂肪酸，其比值肯定大于6。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是提純度高，但由于硝酸銀價(jià)格昂貴，且硝酸銀的大量回收問(wèn)題尚未解決，所以目前只停留在實(shí)驗(yàn)室階段。

3.3 分子蒸餾法

分子蒸餾法利用不同脂肪酸分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程的差異，在極高的真空度下，使液體在遠(yuǎn)低于其沸點(diǎn)的溫度下進(jìn)行分離。在一定的溫度和壓力條件下，飽和、單不飽和脂肪酸分子由于運(yùn)動(dòng)的平均自由程大，首先蒸出;不飽和脂肪酸的分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程短，最后蒸出[34]。通過(guò)多級(jí)蒸餾，便可有效地分離不同組分，獲得高純度的DHA[35－36]。分子蒸餾法是目前工業(yè)生產(chǎn)高純度EPA和DHA最常用的方法之一，但提純度只有50%～60%[37]。此外，分子蒸餾法能耗高，且不能有效分離分子量相近的組分[38]。

3.4 尿素包合法

尿素包合法主要是基于不飽和程度和碳鏈長(zhǎng)度分離脂肪酸，通常在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，如甲醇或乙醇，不宜使用能與尿素相結(jié)合的溶劑，如丙酮。尿素包合法的缺點(diǎn)在于難以分開(kāi)雙鍵數(shù)相近的脂肪酸，而且得到的產(chǎn)物需要進(jìn)一步純化。尿素包合過(guò)程的主要影響因素包括:尿素與脂肪酸的質(zhì)量比、結(jié)晶溫度。尿素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，除去的飽和、低不飽和脂肪酸就越多，但會(huì)導(dǎo)致一部分不飽和脂肪酸的損失[39]。溫度越低，越易形成尿素結(jié)合物，但也會(huì)導(dǎo)致一些不飽和脂肪酸與尿素結(jié)合。TANG等[31]用尿素包合法富集Schizochytrium limacinum中的DHA，在2∶1尿脂比、－10℃結(jié)晶溫度和8 h結(jié)晶時(shí)間的最佳條件下，DHA純度從29.7%提高到了60.4%，富集率為60.6%。

3.5 高效液相色譜法

不同雙鍵數(shù)和碳數(shù)的脂肪酸具有不同極性，從而導(dǎo)致其在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)存在差異，高效液相色譜法( HPLC)利用分配系數(shù)的差異分離脂肪酸，可分為銀離子高效液相色譜法( Ag-HPLC)和反相高效液相色譜法( RP-HPLC)。高效液相色譜法分離脂肪酸時(shí)常用的流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水。HPLC法具有回收率高、靈敏度高、純化過(guò)程條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，是獲得高純度DHA最有效的方法。YAMAMURA等[40]從Schizochytrium sp.SR21油脂中提取DHA，使用工業(yè)高效液相色譜法( HPLC)，流動(dòng)相為甲醇/水(體積比98∶2)，得到了純度超過(guò)99% 的DHA乙酯。

3.6 脂肪酶催化反應(yīng)法

酶法的優(yōu)點(diǎn)是催化效率高、用量少、反應(yīng)條件溫和、DHA結(jié)構(gòu)不易變化、能重復(fù)利用，缺點(diǎn)是不能直接得到產(chǎn)品，需要反應(yīng)后將目標(biāo)產(chǎn)物分離出來(lái)。脂肪酶催化反應(yīng)法富集DHA的關(guān)鍵在于找到合適的脂肪酶。酶法主要包括:酶選擇性水解法、酶選擇性酯化法和酶選擇性酯交換法。酶選擇性水解法和酶選擇性酯交換法得到的甘油酯中EPA和DHA的含量一般不超過(guò)50%，并且EPA和DHA是混合在一起的，要獲得高純度的DHA產(chǎn)品，酶選擇性酯化法是一條有效途徑[41]。

依靠單一的方法較難獲得高純度DHA產(chǎn)品，實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)需要，將多種方法結(jié)合起來(lái)，通過(guò)建立合理的工藝路線，降低成本，制備出高純度DHA產(chǎn)品。孫兆敏等[42]以Schizochytrium sp.干粉為原料，將酶選擇性酯交換法與分子蒸餾聯(lián)用，得到了DHA含量高于80%的乙酯產(chǎn)品。

4 破囊壺菌DHA的產(chǎn)業(yè)化潛力

深海魚(yú)油是DHA的傳統(tǒng)和主要來(lái)源，主要是從沙丁魚(yú)、金槍魚(yú)等魚(yú)的頭部和眼窩脂肪中提取，DHA含量在12%左右，經(jīng)過(guò)濃縮處理后，含量可提高到20%以上[43]。我國(guó)的魚(yú)油大部分依賴(lài)進(jìn)口，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)魚(yú)油進(jìn)口高達(dá)65 540 t，同比增加了50.40%[44]。目前，從魚(yú)油中提取DHA面臨著不少問(wèn)題:①?gòu)?fù)雜的加工處理過(guò)程導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高;②魚(yú)油中的膽固醇含量較高;③魚(yú)腥味難以完全去除;④重金屬和持久性有機(jī)物帶來(lái)的污染問(wèn)題、⑤氫化處理工藝造成DHA的產(chǎn)量下降;⑥魚(yú)油產(chǎn)量存在季節(jié)性波動(dòng)，這些問(wèn)題都極大地影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。隨著漁業(yè)資源的日漸緊缺，從魚(yú)油中獲取DHA無(wú)論是數(shù)量上還是質(zhì)量上都將難以滿(mǎn)足社會(huì)的需求，所以尋求廉價(jià)的DHA提取途徑受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

DHA的另一來(lái)源是微藻。微藻油脂中DHA含量最高可達(dá)35%以上[42]。從藻油中提取DHA也面臨著一些問(wèn)題:①藻油的脂肪酸成分復(fù)雜，導(dǎo)致DHA的純化成本較高;②微藻在培養(yǎng)中易受污染，生長(zhǎng)速率也較慢。這些缺點(diǎn)導(dǎo)致微藻生產(chǎn)DHA在成本上沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，極大地阻礙了微藻生產(chǎn)DHA的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

海洋真菌是DHA商業(yè)開(kāi)發(fā)的潛在來(lái)源。目前，利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究主要集中在破囊壺菌。破囊壺菌生產(chǎn)DHA有如下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):①破囊壺菌生長(zhǎng)速率快，一般2～3 d就進(jìn)入平臺(tái)期，而發(fā)酵生產(chǎn)可以人為控制溫度、pH、溶解氧等參數(shù)，有利于實(shí)現(xiàn)DHA產(chǎn)量的穩(wěn)定化和規(guī)模化;②破囊壺菌的DHA含量高，脂肪酸組成簡(jiǎn)單，大大降低了DHA的純化成本;③破囊壺菌中的DHA主要以甘油三酯型存在，相比于乙酯型，甘油三酯型是DHA的天然存在形式，有口感好、易被人體消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，是保健品和藥品的最佳產(chǎn)品型式;④破囊壺菌DHA沒(méi)有魚(yú)腥味，氧化穩(wěn)定性更高;⑤破囊壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)不會(huì)受到重金屬和持久性有機(jī)物的污染，其產(chǎn)品對(duì)人體更健康。上述幾點(diǎn)表明，破囊壺菌是代替深海魚(yú)類(lèi)成為主要來(lái)源的最佳選擇，利用破囊壺菌生產(chǎn)DHA擁有巨大的產(chǎn)業(yè)化潛力。

5 展望

利用破囊壺菌生產(chǎn)DHA仍處于嘗試和探索階段，目前已經(jīng)篩選出不少適宜工業(yè)化的菌株，但發(fā)酵培養(yǎng)的規(guī)模還較小;此外，制備高純度DHA的成本仍然很高。因此，下一步的目標(biāo)是逐步擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)規(guī)模，并建立成本低廉的油脂提取和DHA純化的工藝路線。

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Perspective in the production and application of DHA from Thraustochytrids

WU Hai-long，CUI Yan，CHENG Jay

( School of Environment and Energy，Peking University，Shenzhen 518055，China)

Thraustochytrids have recently attracted much attention due to its high DHA content，simple fat composition and fast growth rates．In this review of the present research，developments in the fermentation process，DHA extraction and purification were introduced．The problems existed in the future application of DHA were also mentioned，which would be helpful for its industrialization．

Thraustochytrids; fermentation; lipid extraction; docosahexaenvic acid ( DHA) purification; industrialization

10．13995/j．cnki．11－1802/ts．201602044

碩士研究生(成家楊教授為通訊作者，E-mail: chengjy @ pkusz．edu．cn)。

海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目( No．201305022) ;中國(guó)博士后科學(xué)基金( No．2014M560855)。

2015－07－11，改回日期: 2015－09－07