岑　毅, 劉　威

(武漢大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

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基于熒光的流式細胞檢測與分選*

岑毅, 劉威

(武漢大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

摘要:利用微流控技術(shù)相關(guān)軟硬件實現(xiàn)了快速檢測的流式細胞術(shù)。使用玻璃基質(zhì)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片。將結(jié)腸癌HTC116細胞用羅丹明B染色，通過流動聚焦以液滴包裹，利用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)共聚焦檢測法檢測細胞,利用放大電路和濾波電路采集微弱光電信號。然后根據(jù)檢測結(jié)果，利用電潤濕方法(EWOD)將HTC116細胞分離出來。通過單片機RS—232串口將信號傳送到PC端，在屏幕上顯示檢測結(jié)果，并將數(shù)據(jù)存儲。該系統(tǒng)實現(xiàn)了快速流式細胞檢測、計數(shù)與分選。癌細胞的放大后的信號為900～1 300 mV,對于濃度為2×106/mL細胞樣品可以8 min檢測完畢。

關(guān)鍵詞:流式細胞術(shù)； 共聚集檢測； 電潤濕； 信號采集

0引言

流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)是 20 世紀 70 年代初發(fā)展起來的一項高新技術(shù) ,結(jié)合了微流控技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、生物與化學(xué)技術(shù)。流式細胞術(shù)用于實驗室研究各種細胞的結(jié)構(gòu)和功能，以及臨床上對疾病的監(jiān)測診斷。流式細胞分析中，細胞首先用熒光染料染色，或者是熒光染料標記的抗體特異性結(jié)合，然后單個細胞依次通過檢測通道，從而進行細胞分析和疾病診斷[1]。

利用流式細胞術(shù)可以實現(xiàn)精確的高通量檢測和分選。利用流動聚焦(flow focusing)法可以產(chǎn)生單分散的液滴，包裹住單個細胞，以單列通過檢測通道。檢測技術(shù)主要有光學(xué)檢測和電化學(xué)檢測方法。光學(xué)檢測靈敏度高，與樣品無接觸，設(shè)備簡單且易于與微流控芯片相集成。光學(xué)檢測方法可分為熒光檢測、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光檢測、拉曼光譜檢測等。激光誘導(dǎo)熒光( LIF) 可以精確控制激發(fā)光的參數(shù)，其敏感性更高，成為微流控技術(shù)中最主要的光學(xué)檢測方法之一[2]。

傳統(tǒng)的細胞分選方法有電場分選法[3]、聲表面波分選法[4]、流體動力學(xué)分選法[5]和微閥分選法[6]等。使用電場控制反應(yīng)速度快，對液滴無需標記，能降低溝道的復(fù)雜程度。Ahn B等人使用裸露的電極對液滴充電，然后利用靜電場對液滴分選[3]，充電電壓為80 V，分選電壓為110 V。郭峰等人使用靜電場對沒有預(yù)充電的液滴進行分選，利用了液滴自身由于其他原因所帶的電荷[7]，使用的電壓為300～1 200 V。傳統(tǒng)的電場分選方法所需的電壓較高[7]，經(jīng)常達到千伏以上，高電壓會引起絕緣層的擊穿、電化學(xué)反應(yīng)以及對生物樣品的損害。電潤濕(electro-wetting)方法，是一種無接觸的電場操控方法，操控電壓較低[8]。

本文以激光誘導(dǎo)熒光檢測和電潤濕分選方法為基礎(chǔ)，開發(fā)了熒光檢測和電潤濕分選的硬件電路，配合微流控平臺和相關(guān)的軟件，實現(xiàn)了對HTC116結(jié)腸癌細胞的快速檢測、計數(shù)與分選。

1系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

系統(tǒng)主要包括：1)微流控芯片與液流驅(qū)動系統(tǒng) ；2)激光光源與光束形成系統(tǒng)；3)熒光接收與放大系統(tǒng)；4)數(shù)據(jù)顯示與存儲系統(tǒng) ；5)細胞分選系統(tǒng)。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1　系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig 1　Structure diagram of system

1.1微流控芯片與液流驅(qū)動系統(tǒng)

將HTC116細胞磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)懸液與3 %海藻酸鈉溶液以1︰2的體積比混合，作為離散相，進行流動聚焦，得到均勻大小的液滴，液滴中包裹細胞。通過恒流泵將細胞懸液與連續(xù)相(油)通入芯片，利用流動聚焦法生成單分散的液滴，液滴中包裹細胞，并以另一路油相調(diào)節(jié)液滴移動速度。

1.2激光光源與光束形成系統(tǒng)

液滴依次單列通過光學(xué)檢測系統(tǒng)，激光器發(fā)出的激光聚焦到溝道中的一個點上，激發(fā)出癌細胞上的熒光。

采用共聚焦模式激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)，同側(cè)激光入射與熒光收集，其光路結(jié)構(gòu)如圖2所示。激光器發(fā)射波長532 nm的激光，功率100 mW，經(jīng)前置帶通濾光片(532±10)nm濾光，再通過分光濾光鏡和物鏡組1聚焦于微流控芯片的溝道。誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光經(jīng)帶通濾光片(590±10)nm濾光后，通過物鏡組2聚焦進入小孔，由光電倍增管將其轉(zhuǎn)換為微弱電流信號。

圖2　激光光源和熒光探測結(jié)構(gòu)Fig 2　Laser source and fluorescence detection structure

平臺移動聚焦是利用步進電機控制平臺水平方向和豎直方向移動。水平方向移動，使激光對準微流控芯片溝道中間位置；豎直方向移動，光電倍增管收集芯片反射的熒光，調(diào)節(jié)芯片與物鏡之間的距離，根據(jù)光強度判定激光是否聚焦在芯片溝道中。水平X,Y軸移動平臺行程各為50 mm，豎直Z軸移動平臺行程30 mm。每個軸兩端有用于保護的光電限位器，每個限位器的狀態(tài)接入單片機中斷I/O口。

1.3熒光信號放大系統(tǒng)

熒光接收系統(tǒng)是共聚焦式LIF檢測系統(tǒng)，使用濱松公司生產(chǎn)的側(cè)窗型光電倍增管R928(PMT)進行檢測，將光信號轉(zhuǎn)換為微弱電信號，再進行放大和A/D轉(zhuǎn)換。

光電倍增管接收熒光，產(chǎn)生微弱的電流，需要將電流放大。選用如圖3所示的電路，包含前置放大電路和低通濾波器。前置放大電路要求具有低噪聲，高精度的特性[9]。前置跨導(dǎo)放大電路將弱電流轉(zhuǎn)換為放大的電壓信號。選用精密JFET輸入型運放AD8627作為前置運算放大器。該運放的噪聲小，0.1～10 Hz噪聲為1.9 μV；輸入偏置電流小，輸入偏置電流IB典型值0.25 pA，最大值1 pA。為了減小電路中的噪聲，采用誤差小的貼片式金屬薄膜電阻器和溫度特性好的貼片電容器。前置放大電路中，反饋電阻器并聯(lián)上電容器C1，用于補償信號相位，避免產(chǎn)生自激震蕩。后級采用有源二階低通濾波器，可以實現(xiàn)低通濾波和放大[10]。

圖3　微弱光電流信號放大電路Fig 3　Amplifier circuit for weak photoelectric current signal

1.4數(shù)據(jù)顯示與存儲

信號處理系統(tǒng)是以Atmel公司的Atmega128單片機作為控制核心搭建控制系統(tǒng)，實現(xiàn)平臺移動、對焦、接收及上傳數(shù)據(jù)，并判斷是否對細胞進行分離。

數(shù)據(jù)通過RS—232串口傳送到PC端，用C#語言設(shè)計一個人機交互程序。PC端接收數(shù)據(jù)，并顯示在窗體中，可以直觀地區(qū)分有效信號與噪聲信號，并可存儲數(shù)據(jù)。

1.5細胞分選系統(tǒng)

細胞分選系統(tǒng)利用電潤濕效應(yīng)進行分選。如圖4，利用自激振蕩產(chǎn)生160 kHz的正弦波，峰—峰值可達350 V，由單片機定時控制固態(tài)繼電器接通90 ms，短暫接入交變電場，作用于分選電極上，將目標細胞分選進分支溝道。電阻器R2,R3給振蕩管Q1提供偏置，電容器C1將振蕩電壓進行正反饋，高頻變壓器的初級線圈是三端電感諧振線圈，中間抽頭接電源。變壓器次級線圈是高匝數(shù)高壓輸出，用于細胞分選電極。

圖4　自激振蕩電路Fig 4　Self-oscillation circuit

細胞分選利用電潤濕效應(yīng)，如圖5，在兩電極間加上交變電場，兩個電極間會產(chǎn)生一個勢阱。當(dāng)一個導(dǎo)電液滴處于兩個電極上方時，由于絕緣層的存在，形成了包括兩個串聯(lián)的平板電容的電路。靜電場引起的液滴的勢能為

相應(yīng)的靜電場力為

圖5　微溝道中的電潤濕原理圖Fig 5　Principle of electro-wetting in micro-channel

2實驗

2.1試劑與細胞樣品

細胞培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(美國Hyclone公司)，植物油(中國北亞藥用油公司)，PDMS(美國GE—東芝有機硅公司)，PBS緩沖液(美國Hyclone公司)，Trypsin-EDTA(美國Gibco公司)，羅丹明(BCRhB,上海試劑三廠)。實驗中獲得去離子水使用超純水凈化系統(tǒng)(Direct—Q3，美國Millipore公司)。HCT116結(jié)腸癌細胞由武漢中南醫(yī)院提供。

HCT116細胞在DMEM中培養(yǎng)，其中添加10 %的胎牛血清，1 %的青霉素和鏈霉素等質(zhì)量混合物，在5 %的CO2氣氛中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃。細胞分裂增殖后，HCT116使用胰酶細胞消化液(美國Gibco公司)將細胞團分散，離心，去除上清液，加入PBS溶液冷藏待用。

將PBS細胞懸液離心，使用0.4 %的羅丹明B溶液500 μL在暗室染色30 min。用0.9 %NaCl溶液清洗離心3次，用0.9 %NaCl稀釋到需要的濃度，再與3 %的海藻酸鈉溶液以1︰2的體積混合，作為實驗用的細胞懸液。

2.2實驗操作

實驗使用恒流泵(TS2—60，中國蘭格公司)通入連續(xù)相和分散相液體，使用倒置顯微鏡(IX71，Olympus)進行觀測，并使用CCD相機記錄液滴的運動情況。將細胞懸液作為分散相通入，將植物油作為連續(xù)相通入，形成穩(wěn)定的包裹細胞的單分散液滴。

打開激光光源，調(diào)節(jié)平臺移動，使激光聚焦在溝道中心。打開PC端串口，接收放大的熒光信號，在屏幕上顯示數(shù)據(jù)。使用濃度為2×106/mL細胞懸液，可以8 min檢測完畢。

2.3熒光檢測結(jié)果

如圖6，在沒有癌細胞通過時，電路中的噪聲和細胞懸液中的雜質(zhì)會引起較小的信號波動。而有癌細胞通過時，則會產(chǎn)生較高的峰。噪聲信號幅值一般不超過500 mV。癌細胞中熒光信號則會達到900 mV以上，小于1 300 mV。連接串口后，進行信號采樣，將信號傳輸?shù)缴衔粰C，顯示到界面圖中，并能將數(shù)據(jù)以文本文檔存儲。

圖6　HTC116細胞熒光檢測效果Fig 6　Results of fluorescence detection on HTC116 cell

2.4分選效果

在三叉路的溝道中，使用電潤濕對液滴進行分選。當(dāng)熒光信號強度超過900 mV時，單片機判定液滴包裹癌細胞，接通繼電器，進行液滴捕獲分選。使用的芯片參數(shù)為：

溝道高度80 μm，中間溝道寬度為200 μm，分支溝道的寬度為150 μm。當(dāng)液滴進入待分選溝道時，利用連續(xù)相將液滴調(diào)節(jié)到適當(dāng)間距。芯片上共有三個電極，當(dāng)液滴到達叉路交匯處時，在某一分支溝道兩側(cè)的電極加交變電壓，液滴由于受到電潤濕作用力，向指定的叉路運動。圖7(a),(b),(c)是分選的示意圖。圖7(a)中右邊電極懸空不加電場，則液滴進入中間分支溝道；圖7(b)中驅(qū)動電極，則液滴進入上邊分支溝道；圖7(c)中驅(qū)動電極，則液滴進入另一分支溝道。實驗中用電潤濕方法進行不含細胞的1 %NaCl液滴的分選，圖7(d)中將一個液滴分選到上邊分支溝道；圖7(e)中將一個液滴分選到下邊分支溝道。所加的交變電壓有效值為60 V，作用時間為40 ms。

圖7　電潤濕分選Fig 7　Electro-wetting for sorting

3結(jié)論

本文利用激光誘導(dǎo)熒光檢測方法，結(jié)合軟硬件協(xié)同設(shè)計，實現(xiàn)了對HTC116細胞快速檢測、計數(shù)和分選的流式細胞術(shù)。本方法利用共聚焦檢測，檢測與計數(shù)結(jié)果準確；外圍信號放大與分選電路小型化，簡化了分選系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)；使用電潤濕效應(yīng)，在較低的電壓下實現(xiàn)對細胞的分選。使用這種芯片可以在較低的電壓下進行液滴的捕獲和分選。

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Flow cytometry for detection and sorting based on fluorescence*

CEN Yi, LIU Wei

(School of Physics and Technology,Wuhan University,Wuhan 430072,China)

Abstract:Flow cytometry is implemented with combination of microfluidic,and its related software and hardware.Microfluidic chip is made of polydimethylsiloxane(PDMS)on substrate of slide glass.The flow focusing is used to form droplets which contain stained colorectal HTC116 cells,then laser induced fluorescence(LIF)confocal detection method is used.Amplifier and filtering circuits are utilized to detect weak photoelectric current signal.According to detection results,droplets which contain HTC116 cells are sorted by electro-wetting on dielectric (EWOD).Signals are transmitted from micro control unit (MCU) to PC by RS—232 serial port,displayed on screen and stored.Fast detection,count and sorting for cells are realized by the system.The amplified signal of HTC116 are at range of 900～1 300 mV,and detection can be completed in 8min for sample cell with concentration of 2×106/mL.

Key words:flow cytometry; confocal detection; electro-wetting; signal acquisition

DOI:10.13873/J.1000—9787(2016)03—0154—03

收稿日期：2015—06—28

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81272443)；國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項目(J1210061)

中圖分類號:TN 405

文獻標識碼:B

文章編號:1000—9787(2016)03—0154—03

作者簡介:

岑毅(1990-)，男，湖北棗陽人，碩士研究生，主要從事微流控與微納加工研究。