解沛燕朱龍佼許文濤，2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 食品安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

適配體在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

解沛燕1朱龍佼1許文濤1，2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 食品安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

適配體建立在仿生學(xué)基礎(chǔ)上，是在體外從單鏈核酸隨機(jī)序列庫中篩選出的對(duì)某種靶物質(zhì)具有高親和度的寡聚核苷酸（DNA或RNA）片段。相較于食源性致病菌的常規(guī)檢測(cè)手段，適配體具備特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好及易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，因此在該領(lǐng)域得到了關(guān)注和應(yīng)用。但前人對(duì)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合的原理認(rèn)識(shí)尚不夠深入，對(duì)食源性致病菌的適配體篩選及應(yīng)用總結(jié)還存在許多不足。結(jié)合食源性致病菌的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，介紹了該類物質(zhì)的適配體篩選特點(diǎn)和檢測(cè)領(lǐng)域中的最新研究進(jìn)展，提出了目前存在的問題及發(fā)展趨勢(shì)。

適配體；食源性致病菌；傳感器；檢測(cè)

食源性疾病是全球食品安全問題之首［1］。自1993年至今，食源性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)，每年約數(shù)10億例發(fā)生，每天有數(shù)百萬人感染，僅食物引起的腹瀉性疾病每年就導(dǎo)致220萬人死亡，WHO將控制食品污染和食源性疾病列為優(yōu)先重點(diǎn)戰(zhàn)略工作領(lǐng)域［2］。一向以食品安全監(jiān)管嚴(yán)格著稱的美國(guó)每年發(fā)生的食源性疾病達(dá)7 600萬人次，住院32.5萬人次，約5 000人死亡，年均發(fā)生食品安全事件350起，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1 520億美元［3］。其中，由食源性致病菌導(dǎo)致的食源性疾病占44%。

食源性致病菌是指能夠污染食品并通過飲食傳播，引起人類疾病的病原菌，通常指的是細(xì)菌。它們?cè)谑称分猩L(zhǎng)代謝會(huì)引起食品的腐敗和變質(zhì)，有些病原菌會(huì)產(chǎn)生特定的有毒物質(zhì)，直接或間接地導(dǎo)致人患病。常見的細(xì)菌類食源性致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌、致病性大腸桿菌（特別是出血性大腸桿菌O157∶H7）、致病性弧菌（包括：霍亂弧菌、副溶血性弧菌）等［4］。

在全球，每年食源性致病菌（如沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌O157和弧菌等）的檢測(cè)量約2.2 4億個(gè)，花費(fèi)約14億美元［3］。由衛(wèi)生部、工業(yè)和信息化部、商務(wù)部、工商總局、質(zhì)檢總局、糧食局和食品藥品監(jiān)管局聯(lián)合制訂的《2015年國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃》中，對(duì)食源性疾病監(jiān)測(cè)以及致病菌的檢測(cè)制定了全面而詳細(xì)的監(jiān)控計(jì)劃［5］。目前，我國(guó)檢測(cè)食源性致病菌大多采用常規(guī)檢測(cè)方法，存在耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)范圍小等問題，而適配體在該領(lǐng)域的運(yùn)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)手段存在的諸多不足。

1 食源性致病菌的常規(guī)檢測(cè)方法

目前，食源性致病菌的常規(guī)檢測(cè)方法主要有平板分離法、化學(xué)分析法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)檢測(cè)法等。

1.1 平板分離法

平板分離法是根據(jù) 食源性致病菌的生理生長(zhǎng)特性存在差異對(duì)其進(jìn)行鑒定的方法，通常包括増菌、分離、生化分析及血清學(xué)鑒定等步驟。該方法原理易懂、操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好，我國(guó)將其定為食源性致病菌的常規(guī)檢測(cè)手段。然而，平板分離法的前期増菌和分離步驟通常需要1-2 d，且后續(xù)生化檢測(cè)繁瑣，整個(gè)周期要3-5 d，耗時(shí)較長(zhǎng)，無法滿足對(duì)食源性致病菌快速檢測(cè)的需求。

1.2 化學(xué)分析法

化學(xué)分析法是根據(jù)不同的食源性致病菌在自身組分及代謝產(chǎn)物上存在差異，往往有屬于該類菌的標(biāo)志性化學(xué)組成，利用氣相色譜或高效液相色譜分析樣品中所包含的化學(xué)成分，達(dá)到檢測(cè)食源性致病菌的目的。該方法操作靈敏度高，結(jié)果可靠，但對(duì)樣品的前處理要求較為苛刻，并且需要使用昂貴的大型儀器設(shè)備，不適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)。

1.3 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法是利用不同的食源性致病菌在核酸層面上存在的差異來進(jìn)行檢測(cè)分析。電泳技術(shù)、分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)以及DNA序列測(cè)序分析技術(shù)等搭配使用，可以對(duì)樣品中食源性致病菌進(jìn)行定性定量分析。其中，應(yīng)用最廣泛的是PCR技術(shù)。該技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)程序簡(jiǎn)單。但不同種類的PCR技術(shù)自身也存在一定的缺陷，例如，普通PCR僅能用于單一致病菌的檢測(cè)，而通過擴(kuò)增食源性致病菌中的信使 RNA（mRNA）來檢測(cè)分析逆轉(zhuǎn)錄 PCR只能夠檢測(cè)活細(xì)菌細(xì)胞。

1.4 免疫學(xué)檢測(cè)法

免疫學(xué)檢測(cè)法是以全菌或菌的某一部分，如菌毛蛋白、脂多糖及細(xì)菌毒素等為抗原，利用相應(yīng)的抗體與其特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)。該類方法主要以抗體為識(shí)別元件，通過酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，進(jìn)行定性、定量分析。此法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，是目前我國(guó)基層檢測(cè)單位應(yīng)用最多的快檢方法。由于抗體屬于蛋白類物質(zhì)，通常在動(dòng)物體內(nèi)篩選，制備成本較高，并且檢測(cè)及儲(chǔ)存對(duì)環(huán)境的要求較高，導(dǎo)致使用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(cè)食源性致病菌時(shí)存在一定的局限性。

適配體的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了以往方法檢測(cè)食源性致病菌時(shí)的不足。與平板培養(yǎng)法相比，適配體在檢測(cè)時(shí)能從復(fù)雜環(huán)境中找到靶物質(zhì)，檢測(cè)周期短；與儀器分析法相比，樣品的前處理簡(jiǎn)便；與抗體相比，適配體在體外篩選獲得，制備周期短且成本較低。

2 適配體簡(jiǎn)介

2.1 適配體的起源

1990年，Tuerk 和 Gold 和 Ellington 和 Szostak發(fā)現(xiàn)了一類能與蛋白的單鏈核酸序列，兩者的結(jié)合特異性及親和度極高，他們將這類核酸序列命名為適配體（Aptamer）——由拉丁文“aptus”（意為“合適”）及德文“meros”（意為部分、分離）兩者結(jié)合衍生而來［6］。在此之后，涌現(xiàn)出大量針對(duì)不同靶物質(zhì)的適配體研究，人們通過適配體與其他材料的搭建，發(fā)明出各種生物傳感器，應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域。

2.2 適配體的特點(diǎn)

適配體是能特異性識(shí)別某種靶物質(zhì)且具有高度親和力的核酸序列（DNA或RNA），通常含有15-40個(gè)堿基，其分子量大致為5-25 kD［6］。追根溯源，適配體是在仿生學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展應(yīng)用的，如RNA適配體，其實(shí)質(zhì)是對(duì)非編碼RNA的一種模仿。與抗體等檢測(cè)元件相比，適配體具有以下4個(gè)顯著的特點(diǎn)：（1）篩選周期短 篩選適配體不需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在體外即可獲得目標(biāo)序列。最常見的適配體篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）通常在8-15輪的篩選后得到與靶物質(zhì)結(jié)合親和性和特異性良好的適配體序列，整個(gè)周期在1-2個(gè)月左右。而最近誕生的Non-SELEX技術(shù)篩選周期更短，與毛細(xì)管電泳儀共同使用時(shí)可將篩選周期控制在1 d左右。（2）高親和性和高特異性 適配體是在容量約為1013-1015的核酸文庫中進(jìn)行5-13輪的陽性篩選，最終得到的適配體與靶物質(zhì)共同孵育時(shí)，其解離常數(shù)可達(dá) nmol 甚至 pmol 水平。由此可見，適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合能力極強(qiáng)。同時(shí)，適配體也具有高特異性，以食源性致病菌為例，研究者通常會(huì)選擇菌上某個(gè)特異性組分，如標(biāo)志性蛋白、致病毒素等作為篩選靶物質(zhì)，從根本上保證了篩選出的適配體具有特異性，當(dāng)靶物質(zhì)是全菌時(shí)，研究者會(huì)在陽性篩選結(jié)束后選擇3-5種與該菌結(jié)構(gòu)或致病性相似的菌種進(jìn)行陰性篩選，使篩選出的適配體具有極高的特異性。（3）適用范圍廣 由于適配體包含15-40個(gè)隨機(jī)堿基序列，用于篩選適配體的文庫容量極大，因此幾乎所有的靶物質(zhì)都能從文庫中找到能與其特異性結(jié)合的適配體序列。隨著研究者的不斷探索，適配體已經(jīng)應(yīng)用于食品中危害因子檢測(cè)、醫(yī)學(xué)藥物研發(fā)、疾病診斷和治療等眾多研究領(lǐng)域。以檢測(cè)食品中的危害因子為例，適配體在重金屬［7-9］、農(nóng)藥殘留［10-12］、獸藥殘留［13，14］以及食源性致病菌［15-28］等的檢測(cè)中都有突出作用。（4）對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求低作為核酸類物質(zhì)，適配體能耐高溫、耐酸堿性，并且易于儲(chǔ)存。與常規(guī)檢測(cè)方法相比，適配體在使用時(shí)對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求低。再者，適配體具有標(biāo)記穩(wěn)定性，可在序列末端標(biāo)記巰基、生物素等基團(tuán)，因而廣泛用于各類生物傳感器的搭建。

3 適配體的篩選

3.1 篩選技術(shù)

目前，用于適配體的篩選技術(shù)有很多，如親和層析SELEX、毛細(xì)管電泳SELEX（Capillary electrophoresis SELEX）、均衡混合物的非均衡毛細(xì)管電泳SELEX（Non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures SELEX）、全細(xì)胞SELEX（whole cell-SELEX）等方法。根據(jù)篩選過程中是否有序列擴(kuò)增富集，可以將現(xiàn)有的篩選技術(shù)分為SELEX篩選和Non-SELEX篩選兩大類。

3.1.1 SELEX篩選 大多數(shù)的適配體篩選技術(shù)屬于指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（s ystematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），主要包括（圖1）：建立文庫、與靶物質(zhì)孵育、洗脫分離、擴(kuò)增富集等步驟［29］。

適配體的篩選文庫一般由含有15-40個(gè)隨機(jī)堿基的序列組成，容量約為1013-1015，兩端為固定序列，便于PCR擴(kuò)增。在適配體文庫與靶物質(zhì)孵育階段，研究者會(huì)根據(jù)靶物質(zhì)的特點(diǎn)選用合適的結(jié)合緩沖液，這也是篩選過程中需要優(yōu)化的條件之一。

分子量不同的靶物質(zhì)，其洗脫分離步驟操作差異較大。其中，大分子物質(zhì)的常用分離方法有：（1）硝酸纖維素膜印跡法［30-35］：可將靶物質(zhì)固定在硝酸纖維素膜上，隨后通過分子印跡分析得到能與靶物質(zhì)結(jié)合的隨機(jī)單鏈?！斑m配體”概念的提出者、SELEX方法的創(chuàng)始者Tuerk等［30］最早應(yīng)用硝酸纖維素膜篩選得到噬菌體 T4 DNA 聚合酶的適配體，使得該方法在適配體篩選，特別是蛋白類靶物質(zhì)的篩選中得到廣泛應(yīng)用。Savory［32］在篩選小樹肝臟上某種蛋白的適配體時(shí)，借助硝酸纖維素膜完成適配體的洗脫分離步驟，該研究建立了復(fù)雜機(jī)制中靶物質(zhì)的適配體篩選模型。（2）離心沉淀法［36，37］：能結(jié)合上靶物質(zhì)的隨機(jī)單鏈可隨靶物質(zhì)一同被離心沉淀下來，該方法具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，通常用于大分子靶物質(zhì)，如全菌，適配體的篩選。Hari等［36］在篩選鼠傷寒沙門氏菌適配體時(shí)，以全菌作為靶物質(zhì)，與核酸序列文庫室溫下共同孵育45 min后，將混合物在1 500×g下離心10 min，去除未與靶物質(zhì)結(jié)合的DNA單鏈。經(jīng)過8輪陽性篩選及2輪陰性篩選后，研究者挑選出1條能與鼠傷寒沙門氏菌特異性結(jié)合的適配體單鏈。（3）微孔板篩選技術(shù)［38-40］：將靶物質(zhì)加入微孔板內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間孵育后加入核酸文庫序列，能與靶物質(zhì)結(jié)合的隨機(jī)單鏈可留在微孔板上。該方法利用聚苯乙烯材料特有的吸附作用固定靶物質(zhì)，穩(wěn)定性較好，多用于以菌的表面大分子為靶物質(zhì)的適配體篩選中。Han等［39］篩選金黃色葡萄球菌適配體時(shí)，以菌表面的磷壁酸為靶物質(zhì)，將其包被在96孔板上，加入RNA序列文庫后室溫下孵育20 min，用緩沖液沖洗后，能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的RNA單鏈留在微孔板中，最后分離出的適配體單鏈也與金黃色葡萄球菌結(jié)合。

小分子物質(zhì)的分離方法：（1）磁珠分離法［41-43］：小分子靶物質(zhì)可以固定在磁珠上，與適配體序列文庫共同孵育后在外加磁場(chǎng)的作用下可以實(shí)現(xiàn)分離，而后通過加熱或加堿等方法使適配體序列與靶物質(zhì)分開。Mann等［41］首次以分子量很小的乙醇胺（Mr = 61.08）為靶物質(zhì)，將其固定在磁珠上。加入核酸序列文庫后振蕩孵育30 min，利用磁性材料的分離富集效應(yīng)去除未與乙醇胺結(jié)合的核酸序列，而后加入含有尿素及EDTA的緩沖液提取結(jié)合在靶物質(zhì)上的核酸序列，進(jìn)入下一步擴(kuò)增富集，最終篩選出6條性能良好的適配體。（2）柱層 析分離法［44-49］：將靶物質(zhì)結(jié)合在樹脂層析柱上，適配體序列文庫與靶物質(zhì)孵育后，能特異性結(jié)合的序列可以留在層析柱上，達(dá)到分離的目的。Cruz-Aguado等［44］將靶物質(zhì)伏馬毒素B1固定在凝膠樹脂親和層析柱上，注入含有核酸序列文庫的溶液，用結(jié)合緩沖液反復(fù)沖洗層析柱，成功分離出與伏馬毒素B1結(jié)合解離常數(shù)為100 ± 30 nmol/L的適配體序列。

3.1.2 Non-SELEX篩選 Non-S EL E X 篩 選 技 術(shù) 是 相較 于 S E LEX篩選技術(shù)提出的。傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)在經(jīng)過洗脫分離步驟后，要使用PCR等技術(shù)富集能與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸序列，擴(kuò)增出的產(chǎn)物將進(jìn)入下一輪陽性篩選過程，從而提高適配體序列在核酸序列文庫中所占有的比例，最終篩選出解離常數(shù)低的適配體序列。與SELEX不同的是，Non-SELEX無需進(jìn)行PCR等核酸序列擴(kuò)增步驟，經(jīng)過2-3次分離、分析篩選步驟后直接得到適配體序列（圖2）。

圖1 SELEX技術(shù)篩選適配體流程圖

Berezovski等［50］首次提出Non-SELEX技術(shù)的概念，并使用該技術(shù)篩選h-RAS蛋白適配體。他們將平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳（non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，NECCM）引入適配體的篩選中，以h-RAS蛋白和適配體文庫的平衡混合物為樣品，利用h-RAS蛋白和核酸序列兩者結(jié)合后出現(xiàn)特異性峰形，進(jìn)而針對(duì)這種非線性擬合對(duì)反應(yīng)的解離速率常數(shù)進(jìn)行求解，經(jīng)過3輪分離、分析后得到能特異性結(jié)合h-RAS蛋白的核酸序列。

隨后，Non-SELEX技術(shù)在適配體篩選中得到了發(fā)展和應(yīng)用［51-54］。Ashley等［51］利用非平衡毛細(xì)管電泳，以溶菌酶，胰蛋白酶原，糜蛋白酶原A和肌紅蛋白為靶標(biāo)進(jìn)行陰性篩選，經(jīng)過3輪Non-SELEX過程出了能特異性結(jié)合牛過氧化氫酶的適配體。Yu等［52］運(yùn)用數(shù)學(xué)模型分析了在不同條件，如蛋白濃度、分離效率不同對(duì)Non-SELEX篩選過程的影響，為后續(xù)研究者的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了參考依據(jù)。

與篩選周期通常為1-3個(gè)月的SELEX篩選技術(shù)相比，Non-SELEX篩選技術(shù)可在幾天甚至幾小時(shí)內(nèi)完成適配體篩選全過程，大大縮短了篩選周期。但由于后者需借助毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行篩選，篩選靶物質(zhì)結(jié)合核酸序列前后應(yīng)在電泳遷移率方面有明顯變化，因此具有一定的局限性，即Non-SELEX技術(shù)大多用于大分子物質(zhì)的適配體篩選。

圖2 SELEX技術(shù)與Non-SELEX技術(shù)篩選適配體流程對(duì)比示意圖

3.2 篩選靶物質(zhì)

食源性致病菌的篩選靶物質(zhì)可以分為3大類：全細(xì)胞、表面組分以及毒素。參照我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品中致病菌限量》（GB 29921-2013），本文介紹了國(guó)標(biāo)中規(guī)定的食源性致病菌的致病特點(diǎn)，并總結(jié)了目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中篩選出的食源性致病菌適配體序列（表1）。

以全細(xì)胞作為篩選靶物質(zhì)的研究大多集中在適配體應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的起步階段，但隨著研究的不斷深入，致病菌上特異性組分和毒素成為了選擇的熱門。相較于用整個(gè)致病菌為靶物質(zhì)，后者具有一定的優(yōu)勢(shì)：（1）可不做或少做陰性篩選，實(shí)驗(yàn)周期得到縮短；（2）以整個(gè)細(xì)菌作為篩選靶物質(zhì)會(huì)污染操作環(huán)境的可能性較大，會(huì)帶來一定的安全隱患，選擇某個(gè)組分為靶物質(zhì)則大大降低了這種風(fēng)險(xiǎn)；（3）以致病菌上的某個(gè)特異性部分為靶物質(zhì)篩選出的適配體可用于整個(gè)致病菌的檢測(cè)，且清楚地了解與致病菌的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)基于適配體的生物傳感器的搭建十 分有利。

3.2.1 全細(xì)胞 作為大分子物質(zhì)，全細(xì)胞的表面復(fù)雜且結(jié)構(gòu)同源性較高，因此在完成陽性篩選后，通常會(huì)選擇3-6種與靶致病菌具有相似結(jié)構(gòu)或能導(dǎo)致相似疾病的細(xì)菌進(jìn)行陰性篩選，確保篩選出的適配體能夠特異性地識(shí)別靶致病菌。Cao等［26］在篩選金黃色葡萄球菌適配體時(shí)，將經(jīng)過11輪陽性篩選后留下的適配體序列與表皮葡萄球菌、嗜熱鏈球菌以及大腸桿菌DH 5共同孵育，反向篩選適配體。

3.2.2 表面組分 篩選適配體的靶物質(zhì)也可以是致病菌表面的某個(gè)特異的功能性部分，如脂多糖、蛋白等。 Li等［17］在篩選腸毒素大腸桿菌K88適配體時(shí)，以能吸附宿主腸道黏膜上皮細(xì)胞，從而一起宿主腸道疾病的菌毛蛋白為靶物質(zhì)；Bruno等［18］在篩選大腸桿菌O111∶B4適配體時(shí)，以菌膜上具有抗原性的內(nèi)毒素脂多糖為靶物質(zhì)。同樣地，在篩選原生生物、病毒等的適配體時(shí)，大多也會(huì)選擇使用該類病原微生物上的特異性蛋白作為靶物質(zhì)，如針對(duì)甲、乙、丙型肝炎，已經(jīng)篩選出以核心蛋白、3C蛋白酶、囊膜糖蛋白E2、NS3螺旋酶為靶標(biāo)的核酸適配體。

3.2.3 毒素 真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和動(dòng)物都有害，而用于適配體篩選的毒素通常指的是真菌毒素，如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素及玉米赤霉烯酮等。2008年，Cruz-Aguado和Penner首先通過免疫親和柱篩選得到了與OTA高親和識(shí)別的DNA適配體，并且成功設(shè)計(jì)了以O(shè)TA適配體為識(shí)別模式的熒光偏振檢測(cè)方法［43］，這也是OTA適配體在分析檢測(cè)上的第一次應(yīng)用。王文鳳等［55］借助磁珠篩選得到了黃曲霉毒素B1和B2的適配體，隨后將適配體搭載納米金顆粒，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的檢測(cè)。

表1 食源性致病菌適配體匯總表

4 適配體的性能鑒定

研究者通常對(duì)篩選出的適配體進(jìn)行兩方面的性能鑒定：適配體與靶物質(zhì)結(jié)合的親和性以及特異性。

4.1 親和性

親和性是指適配體與靶物質(zhì)結(jié)合力的大小，通常用解離常數(shù)進(jìn)行表征。在自然狀態(tài)下，適配體呈現(xiàn)多種不確定的空間構(gòu)象，當(dāng)加入靶物質(zhì)存在時(shí)，適配體會(huì)改變自身構(gòu)象，通過范德華力、氫鍵、鹽橋、靜電吸附等作用力嵌入在靶物質(zhì)表面的結(jié)合位點(diǎn)［4］，實(shí)現(xiàn)兩者結(jié)合，其解離常數(shù)可達(dá)nmol 甚至pmol 水平。由此可見，適配體與靶物質(zhì)的親和性很高。

4.2 特異性

特異性是適配體與靶物質(zhì)及非靶物質(zhì)比較，結(jié)合力的強(qiáng)弱是否存在明顯差異。就食源性致病菌而言，通常使用與靶物質(zhì)有相似結(jié)構(gòu)和相同致病性的病原菌或病原菌結(jié)構(gòu)（如鞭毛蛋白等）進(jìn)行特異性分析。解離常數(shù)也是評(píng)價(jià)適配體特異性的指標(biāo)，當(dāng)與靶物質(zhì)孵育時(shí)，Kd值極低，而與其他物質(zhì)孵育時(shí)，Kd值較高，兩者相差1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，則該適配體序列與靶物質(zhì)結(jié)合的特異性較高。

4.3 親和性與特異性的關(guān)系

適配體與靶物質(zhì)的親和性與特異性是必要不充分的關(guān)系。核酸序列對(duì)靶物質(zhì)的親和性要求該序列很容易與靶物質(zhì)結(jié)合；而核酸序列的特異性則要求該序列能且僅能與靶物質(zhì)結(jié)合。通常情況下，篩選得到的適配體能從復(fù)雜基質(zhì)中特異地與靶物質(zhì)結(jié)合，則兩者之間相互作用力一定很強(qiáng)。反之則不成立，經(jīng)過多輪陽性篩選得到的適配體通常與靶物質(zhì)具有較好的親和性，但由于兩者間的結(jié)合位點(diǎn)可能不是靶物質(zhì)特有的組分，陽性篩選出的適配體序列不一定具有與靶物質(zhì)較好的特異性，這一特點(diǎn)在以全細(xì)胞為靶物質(zhì)的適配體篩選中尤為突出，因此全細(xì)胞篩選一般配合陰性篩選。

5 適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合表征

5.1 靶物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)

研究篩選出的適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)有助于優(yōu)化檢測(cè)體系。段諾等［28］在以副溶血性弧菌為靶物質(zhì)篩選得到適配體后，使用提取試劑盒提取了副溶血性弧菌表面的外膜蛋白和脂多糖兩類組分，比對(duì)解離常數(shù)和瓊脂糖凝膠電泳圖，分析了該適配體對(duì)膜外兩種物質(zhì)的結(jié)合情況，最終得出篩選出的適配體與副溶血性弧菌的結(jié)合位點(diǎn)在外膜蛋白上的結(jié)論。針對(duì)不同靶物質(zhì)的適配體篩選研究有很多，但對(duì)篩選出來的適配體與靶物質(zhì)，尤其是以菌種上某個(gè)特異性組分作為靶物質(zhì)，結(jié)合位點(diǎn)研究的較少。出現(xiàn)這種情況的可能的原因有如下兩點(diǎn)：（1）適配體序列與靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)通常會(huì)折疊纏繞改變構(gòu)象，而這一過程可能會(huì)受到靶物質(zhì)上某些物質(zhì)的作用，機(jī)理復(fù)雜；（2）靶物質(zhì)作為一個(gè)復(fù)雜的大分子物質(zhì)，其表面能與核酸序列結(jié)合的位點(diǎn)較多，探究?jī)烧呓Y(jié)合的具體作用位點(diǎn)必須將靶物質(zhì)進(jìn)行切割分離，難度較大。

5.2 適配體的功能片段

研究者在探究適配體序列上能與靶物質(zhì)結(jié)合的功能片段時(shí)，通常會(huì)根據(jù)適配體序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，找到保守序列，即篩選出的核酸序列中共有的片段，再根據(jù)莖環(huán)、支撐臂等結(jié)構(gòu)將其分解為若干部分，探討各部分與靶物質(zhì)的結(jié)合情況，從而確定該適配體序列的功能片段。

Lee等［15］在篩選大腸桿菌O157∶H7的RNA適配體時(shí)，選取與靶物質(zhì)結(jié)合率最高的適配體序列，將其分解為3個(gè)部分，而后用3個(gè)序列片段及全序列分別與靶物質(zhì)進(jìn)行孵育，用Kd值評(píng)價(jià)兩者結(jié)合的親和性。結(jié)果表明，保守序列部分與靶物質(zhì)結(jié)合的親和性最佳，此結(jié)果能很好地反映適配體與靶物質(zhì)結(jié)合的有效片段，后續(xù)研究者在使用適配體檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7時(shí)可直接合成功能序列，既能提高檢測(cè)效率，又可以節(jié)約成本。

6 適配體檢測(cè)應(yīng)用

6.1 菌種的樣品前處理

在檢測(cè)之前，需要對(duì)樣品中的菌種進(jìn)行前處理，即選擇合適的培養(yǎng)基擴(kuò)增菌種使其達(dá)到對(duì)數(shù)期，通過離心去除雜質(zhì)，加入篩選適配體時(shí)用到的結(jié)合液重懸，使菌種在數(shù)量和質(zhì)量上都處于良好的待檢狀態(tài)［56］。

以菌上某個(gè)特異性組分，如膜外蛋白、脂多糖等作為待檢物質(zhì)時(shí)，可在菌種擴(kuò)增完成后使用對(duì)應(yīng)組分的提取試劑盒進(jìn)行提取［28］。

6.2 適配體光學(xué)傳感器

基于適配體的光學(xué)傳感器是利用適配體檢測(cè)食源性致病菌中應(yīng)用最廣泛的模型，其優(yōu)勢(shì)在于光學(xué)元件種類繁多且適配體易于修飾，兩者結(jié)合還可以搭建可視化顏色改變的生物傳感器，這對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)來說至關(guān)重要。常見的有比色傳感器［16，56，57］、化學(xué)發(fā)光傳感器［58-61］、熒光傳感器［62-66］、表面等離子共振傳感器［67-69］以及表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器［70-72］。各種傳感器模型間是相輔相成的，研究者會(huì)同時(shí)引入多種材料，如納米材料與熒光材料并用等，從而提高反應(yīng)體系的靈敏度，降低檢測(cè)限。

6.2.1 比色傳感器 適配體搭載可發(fā)生顏色變化的新型納米材料，構(gòu)成比色傳感器。新性納米材料在溶液中處于分散狀態(tài)，當(dāng)靶物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，適配體與之結(jié)合，從而拉近粒子間的距離產(chǎn)生色差。研究者以顏色變化為信號(hào)，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)。

Wu 等［16］利用聚二乙炔（polydiacetylene，PDA）納米球在不同狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生顏色變化來檢測(cè)大腸桿菌。10，12-二十五碳二炔酸在紫外燈下照射可形成PDA納米球，經(jīng)過氨基修飾的大腸桿菌O157: H7脂多糖特異性結(jié)合的適配體可以與羧基化的PDA形成肽鍵，從而將兩者結(jié)合在一起。PDA納米球在分散狀態(tài)下呈現(xiàn)藍(lán)色，修飾完適配體后仍舊保持分散狀態(tài)，不發(fā)生顏色變化。當(dāng)大腸桿菌O157:H7存在時(shí)，適配體會(huì)迅速改變自身構(gòu)象與之結(jié)合，從而導(dǎo)致PDA納米球出現(xiàn)聚集，呈現(xiàn)出紅色（圖3）。當(dāng)大腸桿菌O157:H7存在時(shí)，該體系可產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化，具有較大的優(yōu)勢(shì)，比色反應(yīng)可在2 h內(nèi)完成，借助紫外可見分光光度計(jì)可實(shí)現(xiàn)定量分析。但由于反應(yīng)體系中使用的材料單一，方法的靈敏度較差，其檢測(cè)區(qū)間為104-108CFU/mL。

圖3 PDA搭載適配體檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的原理示意圖［16］

DNA酶也是常見的搭建比色傳感器的元件。DNA酶具有生物催化作用，而血紅素與富含G堿基的適配體結(jié)合后形成的超分子復(fù)合物具有類似過氧化物酶活性，可以催化過H2O2化ABTS的反應(yīng)，產(chǎn)物APTS+是一種有色物質(zhì)，可利用其作為傳感信號(hào)，搭載適配體序列組成比色傳感器。

Teller等［57］運(yùn)用DNA酶比色發(fā)光傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)AMP和溶菌酶的檢測(cè)。研究者設(shè)計(jì)了兩條DNA雜交鏈，其中一條為“識(shí)別序列”，同時(shí)包括靶物質(zhì)適配體和血紅素適配體，另一條為“阻礙序列”，與“識(shí)別序列”中的兩段適配體序列分別有9個(gè)堿基互補(bǔ)。當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，“識(shí)別序列”中與其對(duì)應(yīng)的適配體序列會(huì)結(jié)合上去，從而打開雙鏈，另一端的血紅素適配體形成G4結(jié)構(gòu)，催化H2O2化 ABTS的顯色反應(yīng)（圖4）。該方法原理簡(jiǎn)單易懂，操作步驟較少，建立了一種可以推廣的DNA酶比色傳感器模型。但其方法中需要設(shè)計(jì)兩條 含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA雜交鏈，因此對(duì)適配體序列長(zhǎng)度的有一定要求。

6.2.2 化學(xué)發(fā)光傳感器 化學(xué)發(fā)光是物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過程中伴隨的一種光輻射現(xiàn)象。因其具有靈敏度高、檢測(cè)區(qū)間寬及裝置簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，化學(xué)發(fā)光被廣泛用于蛋白、毒素等分子的檢測(cè)。在適配體序列上標(biāo)記化學(xué)發(fā)光因子［58，59］，或引入DNA酶催化魯米諾與H2O2反應(yīng)［60，61］，是目前最常見的化學(xué)發(fā)光傳感器體系。

Mun等［61］首次以適配體代替酶聯(lián)抗體，用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)黃曲霉毒素B1。研究者在黃曲霉毒素B1適配體的末端連接了類辣根 過氧酶的DNA序列，當(dāng)待檢樣品中存在 黃曲霉 毒 素 B1時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)性地與適配體結(jié)合，固定在 9 6 孔板上的黃曲霉毒素B1-卵蛋白失去DNA序列，在 孔 中加入H2O2和魯米諾后不再出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光（圖 5）。該 方法用于玉米樣品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.11 ng/mL。與酶聯(lián)抗體相比，適配體競(jìng)爭(zhēng)法大大降低了檢測(cè)限。

圖4 DNA酶比色傳感器檢測(cè)AMP、溶菌酶示意圖［57］

圖5 DNA酶化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)黃曲霉毒素B1示意圖［61］

6.2.3 熒光傳感器 熒光適配體生物傳感器主要是用熒光基團(tuán)標(biāo)記核酸適配體，基于目標(biāo)分子與適配體作用后產(chǎn)生的熒光偏振或熒光強(qiáng)度的改變來檢測(cè)食源性致病菌［62-66］；或者將熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)分別標(biāo)記在核酸適配體的兩端，加入靶物質(zhì)后引起適配體自身構(gòu)象改變，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)上的差異［57］。

段穎芬等［62］搭建檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的熒光傳感器時(shí)，以氧化石墨烯為平臺(tái)，將熒光染料標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌適配體作為分子識(shí)別探針，加入納米材料氧化石墨烯后，熒光探針會(huì)吸附在其表面導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌存在時(shí)，適配體與靶物質(zhì)結(jié)合使熒光信號(hào)再度恢復(fù)（圖6）。根據(jù)熒光信號(hào)恢復(fù)的強(qiáng)弱可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測(cè)。該方法的淬滅效率高、背景值低，其檢測(cè)限為102CFU/mL，在檢測(cè)食源性致病菌的熒光傳感器中屬于檢測(cè)限較低的體系。由此可見，納米材料的引入大大提高了反應(yīng)的靈敏性。該方法的淬滅效率高、背景值低，其檢測(cè)限為102CFU/mL，在檢測(cè)食源性致病菌的熒光傳感器中屬于檢測(cè)限較低的體系，由此可見納米材料的引入大大提高了反應(yīng)的靈敏性。

圖6 氧化石墨烯搭載熒光標(biāo)記適配體檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的原理示意圖［62］

6.2.4 表面等離子共振傳感器 表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，由于共振致使電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。將適配體修飾在等離子共振裝置表面，靶物質(zhì)的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致等離子共振裝置的折射率發(fā)生位移。

Tombelli 等［68］使用SPR適配體傳感器來檢測(cè)艾滋病病毒HIV-1Tat蛋白。使用生物素鏈霉親和素將適配體固定在芯片表面，流動(dòng)注射不同濃度的HIV-1Tat蛋白時(shí)，檢測(cè)折射角的信號(hào)變化，檢出限為0.12 mg/L。Lei等［69］在構(gòu)建SPR傳感器檢測(cè)沙門氏菌時(shí)，在鏈霉親和素的適配體末端加入與沙門氏菌侵襲蛋白A基因互補(bǔ)的核酸序列，將其作為信號(hào)放大體系引入SPR傳感器中（圖7），該方法的檢測(cè)限可達(dá)到60 CFU /mL。SPR傳感器不需任何標(biāo)記物，可用于生物分子的無損檢測(cè)。

圖7 SPR傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的原理示意圖［69］

6.2.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜傳感器 拉曼光譜是光子與分子相互碰撞發(fā)生方向和能量改變，出現(xiàn)散射光頻率變化的聯(lián)合散射光譜。拉曼散射效應(yīng)是一個(gè)非常弱的過程，研究者將分子吸附在粗糙表面，如金屬和納米粒子，形成表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced raman spectroscopy，SERS），可用于分子水平的檢測(cè)［70-72］。

Zhang等［70］利用SERS傳感器同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。研究者將特異性識(shí)別兩種菌的適配體固定在Fe3O4磁性納米粒子上，形成捕獲探針。拉曼分子巰基乙酸（MBA）與鼠傷寒沙門氏菌適配體、拉曼分子5，5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸）（DNTB）與金黃色葡萄球菌適配體分別修飾在金納米粒子表面，形成信號(hào)探針（圖8）。當(dāng)反應(yīng)體系存在兩種菌時(shí)，捕獲探針中的適配體可特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合，加入信號(hào)探針形成夾心結(jié)構(gòu)。兩種拉曼分子可形成不同的表面增強(qiáng)拉曼光譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)和鑒定。該方法對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)限為15 CFU/mL，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為30 CFU/mL，具有簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，引入多種拉曼分子，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。

6.3 適配體電化學(xué)傳感器

基于適配體的電化學(xué)傳感器起步較晚，但由于優(yōu)勢(shì)明顯，在近幾年得到了迅速發(fā)展，常見的有電極修飾傳感器［73-75］及納米管傳感器［76-80］。

6.3.1 電極修飾傳感器 電極修飾傳感器由固定了適配體的電極和電化學(xué)活性傳感元件構(gòu)成。在加入待檢樣品后，適配體與靶物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)改變，通過檢測(cè)電流、電阻等的變化定性定量檢測(cè)靶物質(zhì)。Luo等［74］將大腸桿菌O111適配體與捕獲探針相連，固定在金電極表面，當(dāng)大腸桿菌O111存在時(shí)，適配體脫離捕獲探針，與靶物質(zhì)結(jié)合。識(shí)別探針與裸露的捕獲探針連接留在金電極表面，加入識(shí)別元件鏈霉抗堿性磷酸酶后引起電勢(shì)改變（圖9）。該方法可用于牛奶中大腸桿菌O111的檢測(cè)，其檢測(cè)限為305 CFU/mL，3.5 h可完成檢測(cè)分析。

6.3.2 納米管傳感器 納米管電化學(xué)傳感器與電極修飾傳感器原理相似，是將適配體修飾在納米管內(nèi)壁上，通電后記錄初始電勢(shì)，當(dāng)靶物質(zhì)通過納米管時(shí)會(huì)引起電勢(shì)信號(hào)的改變。常用于電化學(xué)檢測(cè)的納米管有硅納米孔［76］及單壁碳納米管［77-80］。Gustavo等［77］利用單壁碳納米管同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7及單增李斯特菌兩種菌（圖10）。研究者將大腸桿菌O157∶H7及單增李斯特菌的適配體分別修飾在單壁碳納米管壁內(nèi)部，當(dāng)兩種菌或其中一種存在于樣品中時(shí)，與其對(duì)應(yīng)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合，通電的單壁碳納米管會(huì)產(chǎn)生電勢(shì)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種菌的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。該方法的檢測(cè)區(qū)間為2-103CFU/ mL，靈敏度較高。但受到單壁碳納米管內(nèi)徑大小的限制，其檢測(cè)上限較低，即當(dāng)樣品中的靶物質(zhì)濃度較高時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性的試驗(yàn)結(jié)果。

圖8 SERS傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的原理示意圖［70］

圖9 電極修飾傳感器檢測(cè)大腸桿菌O111原理示意圖［74］

圖10 單壁碳納米管傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157:H7原理示意圖［77］

6.4 適配體壓電晶體傳感器

壓電晶體是非中心對(duì)稱晶體，在機(jī)械力作用下可產(chǎn)生形變，使帶電質(zhì)點(diǎn)發(fā)生相對(duì)位移，從而在晶體表面出現(xiàn)正、負(fù)束縛電荷，極軸兩端產(chǎn)生的電勢(shì)差可作為檢測(cè)信號(hào)。其中，石英晶體微天平（quartz crystal mierobalance，QCM）是最常見的壓電晶體傳感［68，58］。Ozalp等［81］將特異性識(shí)別致病菌的適配體修飾在QCM傳感器上，當(dāng)樣品中出現(xiàn)靶物質(zhì)時(shí)，兩者的結(jié)合可導(dǎo)致QCM傳感器發(fā)生形變，出現(xiàn)電勢(shì)差（圖11）。研究者利用這一原理檢測(cè)了牛奶中沙門氏菌的含量，方法的檢測(cè)限為100 CFU/ mL。該方法裝置簡(jiǎn)單，每個(gè)晶體能重復(fù)使用多次，可用于實(shí)際樣品的批量檢測(cè)。

圖11 石英晶體微天平傳感器檢測(cè)細(xì)菌原理示意圖［81］

7 結(jié)語

適配體對(duì)靶物質(zhì)可特異性識(shí)別且結(jié)合力很強(qiáng)，同時(shí)適配體還具有分子小、易合成、易修飾、相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，作為一類分子識(shí)別元件易于搭載各種傳感元件組建不同類型的生物傳感器，滿足當(dāng)下對(duì)食品中可能存在的食源性致病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求。

但是，目前適配體的發(fā)展還存在著一些局限性：（1）針對(duì)不同食源性致病菌，尤其是真菌類物質(zhì)，適配體種類有限；（2）缺乏對(duì)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)系統(tǒng)研究；（3）同時(shí)檢測(cè)多種食源性致病菌的生物傳感器模型較少。

針對(duì)目前存在的不足，適配體檢測(cè)食源性致病菌可以從以下3個(gè)方面進(jìn)行深入研究：（1）篩選更多種類的食源性致病菌適配體；（2）借助生物信息學(xué)手段，精準(zhǔn)定位適配體在靶物質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)；（3）建立能檢測(cè)食源性致病菌的高通量、高特異性、高靈敏度的適配體傳感器。此外，適配體與磁珠等結(jié)合可以抓取復(fù)雜機(jī)制中的靶物質(zhì)，也為實(shí)際樣品中食源性致病菌的分離提取提供了新的思路。

［1］徐小英. 我國(guó)食物（食品）質(zhì)量安全存在的主要問題及應(yīng)對(duì)措施［J］. 首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2013, 34（6）：76-85.

［2］劉士敬. 食源性疾病的流行病學(xué)［J］. 中國(guó)社區(qū)醫(yī)師, 2008, 24（4）：9-10.

［3］Tim, Lawruk. 食源性致病菌的檢測(cè)現(xiàn)狀與突破［J］. 食品安全導(dǎo)刊, 2015（z1）：44-45.

［4］GB29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品中致病菌限量》［S］

［5］李寧, 楊大進(jìn), 郭云昌, 等. 我國(guó)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)制度與落實(shí)現(xiàn)狀分析［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2011, 11（3）：5-8.

［6］Banerjee J, Nilsen-Hamilton M. Aptamers：multifunctional molecules for biomedical research［J］. Journal of Molecular Medicine, 2013, 91（12）：1333-1342.

［7］Chen B, Wang Z, Hu D, et al. Determination of nanomolar levels of mercury（II）by exploiting the silver stain enhancement of the aggregation of aptamer-functionalized gold nanoparticles［J］. analytical letters, 2014, 47（5）：795-806.

［8］Wang X, Guo XG. Ultrasensitive Pb2+detection based on fluorescence resonance energy transfer（FRET）between quantum dots and gold nanoparticles. ［J］. Analyst, 2009, 134（7）：1348-1354.

［9］Wu S, Duan N, Shi Z, et al. Dual fluorescence resonance energy transfer assay between tunable upconversion nanoparticles and controlled gold nanoparticles for the simultaneous detection of Pb2+and Hg2+［J］. Talanta, 2014, 128：327-336.

［10］Wang L. Selection of DNA aptamers that bind to fourorganophosphorus pesticides［J］. Biotechnology Letters, 2012, 34（5）：869-874.

［11］Jiang He, Yuan Liu, Mingtao Fan, et al. Isolation and identification of the DNA aptamer target to acetamiprid［J］. J Agric Food Chem, 2011, 59（5）：1582-1586.

［12］Kang BK, Kim JH, Kim S, et al. Aptamer-modified anodized aluminum oxide-based capacitive sensor for the detection of bisphenol A［J］. Applied Physics Letters, 2011, 98（7）：073703.

［13］倪姮佳. 恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶核酸適配體的篩選及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的研究［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

［14］Liu L. Development of an immunochromatographic strip test for rapid detection of ciprofloxacin in milk samples［J］. Sensors, 2014, 14（9）：16785-16798.

［15］Lee YJ, Han SR, Maeng JS, et al. In vitro selection of Escherichia coli O157∶H7-specific RNA aptamer［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 417（1）：414-420.

［16］Wu W, Zhang J, Zheng M, et al. An aptamer-based biosensor for colorimetric detection of Escherichia coli O157∶H7［J］. PLoS One, 2012, 7（11）：e48999.

［17］Li H, Ding X, Peng Z, et al. Aptamer selection for the detection of Escherichia coli K88［J］. Canadian Journal of Microbiology, 2011, 57（6）：453-459.

［18］Bruno JG, Carrillo MP, Phillips T. In vitro antibacterial effects of antilipopolysaccharide DNA aptamer-C1qrs complexes［J］. Folia Microbiologica, 2008, 53（4）：295-302.

［19］Kim SE. Harnessing aptamers for electrochemical detection of endotoxin［J］. Analytical Biochemistry, 2012, 424（1）：12-20.

［20］Bruno JG. A novel screening method for competitive FRET-aptamers applied to E. coli assay development［J］. Mccarthy, 2010, 20（6）：1211-1223.

［21］Savory N, Nzakizwanayo J, Abe K, et al. Selection of DNA aptamers against uropathogenic Escherichia coli NSM59 by quantitative PCR controlled Cell-SELEX. ［J］. J Microbiol Methods, 2014, 104：94-100.

［22］Janagama JH, HP Dwivedi. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars［J］. Mol Cell Probes, 2009, 23（1）：20-28.

［23］Pan Q, Zhang XL, Wu HY, et al. Aptamers that preferentially bind type IVB pili and inhibit human monocytic-cell invasion by Salmonella enterica serovar typhi［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49（10）：4052-4060.

［24］Liu GQ, Yu XF, Xue F, et al. Screening and preliminary application of a DNA aptamer for rapid detection of Salmonella O8［J］. Microchimica Acta, 2012, 178（1-2）：237-244.

［25］Hyeon JY, Chon JW, Choi IS, et al. Development of RNA aptamers for detection of Salmonella enteritidis［J］. Journal of Microbiological Methods, 2012, 89（1）：79-82.

［26］Cao X, Li S, Chen L, et al. Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus［J］. Nucleic Acids Research, 2009, 37（14）：4621-4628.

［27］Suh SH, Dwivedi HP, Choi SJ, et al. Selection and characterization of DNA aptamers specific for Listeria species［J］. Analytical Biochemistry, 2014, 459（18）：39-45.

［28］Duan N, Wu S, Chen X, et al. Selection and identification of a DNA aptamer targeted to Vibrio parahemolyticus［J］. J Agric Food Chem, 2012, 60（16）：4034-4038.

［29］K?rkk?inen RM, Drasbek MR, McDowall I, et al. Aptamers for safety and quality assurance in the food industry：detection of pathogens［J］. International Journal of Food Science and Technology, 2011, 46（3）：445-454.

［30］Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase［J］. Science, 1990, 249（4968）：505-510.

［31］Ogihara K, Savory N, Abe K, et al. DNA aptamers against the Cry j 2 allergen of Japanese cedar pollen for biosensing applications［J］. Biosen Bioelectron, 2015, 63：159-165.

［32］Savory N, Goto S, Yoshida W, et al. Two-dimensional electrophoresis-based selection of aptamers against an unidentified protein in a tissue sample［J］. Analytical Letters, 2013, 46（18）：2954-2963.

［33］Xi Z, Huang R, Li Z, et al. Selection of HBsAg-specific DNA aptamers based on carboxylated magnetic nanoparticles and their application in the rapid and simple detection of hepatitis B virus infection［J］. ACS Appl Mater & Interfaces, 2015, 21：11215-23.

［34］Ashley J, Ji K, Li SF. Selection of cholesterol esterase aptamers using a dual-partitioning approach［J］. Electrophoresis, 2015, 36（20）：2616-2621.

［35］Hijiri H, Koji S, Kazunori I. Selection of DNA aptamers against VEGF165 using a protein competitor and the aptamer blotting method［J］. Biotechnol Lett, 2008, 30：829-834.

［36］ Dwivedi HP, Smiley RD, Jaykus LA. Selection of DNA aptamers for capture and detection of Salmonella typhimurium using a wholecell SELEX approach in conjunction with cell sorting［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97（8）：3677-3686.

［37］ Duan N, Ding X, He L, et al. Selection, identification and application of a DNA aptamer against Listeria monocytogenes［J］. Food Control, 2013, 33（1）：239-243.

［38］Liu XM, Zhang DJ, Cao GJ, et al. RNA aptamers specific for bovine thrombin［J］. Mol Recognit, 2003, 16：23-27.

［39］Han SR, Lee SW. In vitro selection of RNA aptamer specific to Staphylococcus aureus［J］. Ann Microbiol, 2014, 2：883-885.

［40］Huge BJ, Flaherty RJ, Dada OO, et al. Capillary electrophoresis coupled with automated fraction collection［J］. Talanta, 2014, 130：288-293.

［41］Mann D, Reinemann C, Stoltenburg R, et al. In vitro selection of DNA aptamers binding ethanolamine［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 338：1928-1934.

［42］Huang Y, Chen X, Xia Y, et al. Selection, identification and application of a DNA aptamer against Staphylococcus aureus enterotoxin A［J］. Analytical Methods, 2014, 6（3）：690-697.

［43］Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, 383（1）：83-91.

［44］Cruz-Aguado JA, Penner G. Determination of ochratoxin a with a DNA aptamer［J］. J Agric Food Chem, 2008, 22：10456-10461.

［45］McKeague M, Bradley CR, Girolamo AD, et al. Screening and initial binding assessment of fumonisin B1 aptamers［J］. International Journal of Molecular Sciences, 2010, 11（12）：4864-4881.

［46］Liu M, Kagahara T, Abe H, et al. In vitro selection of RNA aptamer to hemin［C］//Nucleic Acids Symposium Series. Oxford University Press, 2008, 52（1）：513-514.

［47］Liu M, Kagahara T, Abe H, et al. Direct in vitro selection of heminbinding DNA aptamer with peroxidase activity［J］. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 2009, 82（1）：99-104.

［48］Vianini E, Palumbo M, Gatto B. In vitro selection of DNA aptamers that bind L-tyrosinamide［J］. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2001, 9（10）：2543-2548.

［49］Zhang H, Hamasaki A, Toshiro E, et al. Automated in vitro selection to obtain functional oligonucleotides［C］//Nucleic acids symposium series. Oxford University Press, 2000, 44（1）：219-220.

［50］Berezovski M, Musheev M, Drabovich A, et al. Non-SELEX Selection of Aptamers［J］. Journal of the American Chemical Society Jacs, 2006, 128（3）：1410-1411.

［51］Ashley J, Ji K, Li SF. Selection of bovine catalase aptamers using non SELEX［J］. Electrophoresis, 2012, 33（17）：2783-2789.

［52］Yu X, Yu Y. A mathematical analysis of the selective enrichment of NECEEM-based non-SELEX［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 173（8）：2019-2027.

［53］Tok J, Lai J, Leung T, et al. Selection of aptamers for signal transduction proteins by capillary electrophoresis［J］. Electrophoresis, 2010, 31（12）：2055-2062.

［54］Yufa R, Krylova SM, Bruce C, et al. Emulsion PCR significantly improves nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures-based aptamer selection：allowing for efficient and rapid selection of aptamer to unmodified ABH2 protein［J］. Analytical Chemistry, 2014, 87（2）：1411-1419.

［55］王文鳳. 真菌毒素寡核苷酸適配體的篩選與應(yīng)用［D］.無錫：江南大學(xué), 2012.

［56］Wu H, Li M, Wang Y, et al. Aptasensors for rapid detection of Escherichia coli O157∶H7 and Salmonella typhimurium［J］. Nanoscale Research Letters, 2012, 7（47）：765-781.

［57］Teller C, Shimron S, Willner I, et al. Aptamer-DNAzyme hairpins for amplified biosensing［J］. Analytical Chemistry, 2009, 81（21）：9114-9119.

［58］Cao ZJ, Peng QW, Qiu X, et al. Highly sensitive chemiluminescence technology for protein detection using aptamer-based rolling circle amplification platform［J］. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2011, 1（3）：159-165.

［59］Song Y, Yang X, Li Z, et al. Label-free chemiluminescent ATP aptasensor based on graphene oxide and an instantaneous derivatization of guanine bases［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 51：232-237.

［60］ Shim WB, Mun H, Joung HA, et al. Chemiluminescence competitive aptamer assay for the detection of aflatoxin B1 in corn samples［J］. Food Control, 2014, 36（1）：30-35.

［61］Mun H, Jo EJ, Li T, et al. Homogeneous assay of target moleculesbased on chemiluminescence resonance energy transfer（CRET）using DNAzyme-linked aptamers［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 58：308-313.

［62］ 段穎芬. 鼠傷寒沙門氏菌適配體的篩選及應(yīng)用研究［D］. 長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué), 2014.

［63］Kellenberger CA, Wilson SC, Sales-Lee J, et al. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP［J］. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135（13）：4906-4909.

［64］Duan N, Wu S, Dai S, et al. Simultaneous detection of pathogenic bacteria using an aptamer based biosensor and dual fluorescence resonance energy transfer from quantum dots to carbon nanoparticles［J］. Microchimica Acta, 2014, 182（5-6）：917-923.

［65］Kim LH, Yu HW, Kim YH, et al. Potential of fluorophore labeled aptamers for Pseudomonas aeruginosa detection in drinking water［J］. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2013, 56（2）：165-171.

［66］Le L, Dong X, Xinkai P, et al. Aptamer biosensor for Streptococcus hemolyticus detection based on fluorescence quenching by gold nanoparticles［J］. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6（45）：7230-7236.

［67］Di Primo C, Dausse E, Toulmé JJ. Surface plasmon resonance investigation of RNA aptamer-RNA ligand interactions［M］// Therapeutic Oligonucleotides. Humana Press, 2011：279-300.

［68］Tombelli S, Minunni M, Luzi E, et al. Aptamer-based biosensors for the detection of HIV-1 Tat protein［J］. Bioelectrochemistry, 2005, 67（2）：135-141.

［69］Lei P, Tang H, Ding S, et al. Determination of the invA gene of Salmonella using surface plasmon resonance along with streptavidin aptamer amplification［J］. Microchimica Acta, 2015, 182（1-2）：289-296.

［70］Zhang H, Ma X, Liu Y, et al. Gold nanoparticles enhanced SERS aptasensor for the simultaneous detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 74：872-877.

［71］Negri P, Kage A, Nitsche A, et al. Detection of viral nucleoprotein binding to anti-influenza aptamers via SERS［J］. Chemical Communications, 2011, 47（30）：8635-8637.

［72］Ravindranath SP, Wang Y, Irudayaraj J. SERS driven crossplatform based multiplex pathogen detection［J］. Sensors and Actuators B：Chemical, 2011, 152（2）：183-190.

［73］Cheng AKH, Sen D, Yu HZ. Design and testing of aptamer-based electrochemical biosensors for proteins and small molecules［J］. Bioelectrochemistry, 2009, 77（1）：1-12.

［74］Luo C, Lei Y, Yan L, et al. A rapid and sensitive aptamer-based electrochemical biosensor for direct detection of Escherichia coli O111［J］. Electroanalysis, 2012, 24（5）：1186-1191.

［75］Labib M, Zamay AS, Kolovskaya OS, et al. Aptamer-based viability impedimetric sensor for bacteria［J］. Analytical Chemistry, 2012, 84（21）：8966-8969.

［76］Urmann K, Walter JG, Scheper T, et al. Label-free optical biosensors based on aptamer-functionalized porous silicon scaffolds［J］. Analytical Chemistry, 2015, 87（3）：1999-2006.

［77］Zelada-Guillén GA, Riu J, Düzgün A, Rius FX.Immediate detection of living bacteria at ultralow concentrations using a carbon nanotube based potentiometric aptasensor［J］. Angew Chem Int Ed Engl, 2009, 48（40）：7334-7337.

［78］ Zelada-Guillén GA, Sebastián-Avila JL, Blondeau P, et al. Label-free detection of Staphylococcus aureus in skin using realtime potentiometric biosensors based on carbon nanotubes and aptamers［J］. Biosens Bioelectron, 2012, 1：226-232.

［79］So HM, Park DW, Jeon EK, et al. Detection and titer estimation of Escherichia coli using aptamer-functionalized single-walled carbonnanotube field-effect transistors［J］. Small, 2008, 2：197-201.

［80］Zelada-Guillén GA, Blondeau P, Rius FX, et al. Carbon nanotubebased aptasensors for the rapid and ultrasensitive detection of bacteria［J］. Methods, 2013, 63（3）：233-238.

［81］Ozalp VC, Bayramoglu G, Erdem Z, et al. Pathogen detection in complex samples by quartz crystal microbalance sensor coupled to aptamer functionalized core-shell type magnetic separation［J］. Analytica Chimica Acta, 2015, 853：533-540.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Application Progress of Aptamers in the Detection of Food-borne Pathogenic Bacteria

XIE Pei-yan1ZHU Long-jiao1XU Wen-tao1，2
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. Laboratory of Food Safety Detection and Risk Assessment，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）

Aptamers are artificial DNA/RNA oligonucleotides binding target ligands with high affinities，and they are selected from the libraries of single-strand nucleic acid random sequence in vitro by SELEX. Compared with the traditional methods，application of aptamers has the obvious advantages of high specificity，chemical stability and simplicity of modification in the detection of food-borne pathogenic bacteria，thus it draws attentions and applications in this field. However，the combination principle of aptamers to the target has not been understood clearly yet，and summaries on the selection of aptamers against food-borne pathogenic bacteria and its application are still deficient. Combined with the characteristics of food-borne pathogenic bacteria，this article describes the selection characteristics of aptamers against them，and the latest progress in the detection field. Finally，the existing problems and development trend are proposed.

aptamer；food-borne pathogens；biosensor；detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.006

2015-07-06

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃，2012AA101606），北京市科技新星計(jì)劃（XX2014B069）

解沛燕，女，碩士，研究方向：食品工程；E-mail：495366514@qq.com

許文濤，男，副教授，博士生導(dǎo)師，食品安全分子檢測(cè)及分子毒理、轉(zhuǎn)基因生物安全；E-mail：xuwentao1111@sina.com