馬芳芳+蔣明義

摘要：為深入研究ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及篩選該信號途徑中相關(guān)重要蛋白的相互作用，利用Gateway技術(shù)，以外源ABA處理的玉米葉片為材料首先構(gòu)建了cDNA初級文庫，初級文庫再通過LR重組的方式最終構(gòu)建成以pDEST22為目的載體的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)質(zhì)量鑒定，該文庫的滴度為3.9×106 CFU/mL，文庫總?cè)萘窟_(dá)到1.17×107 CFU，平均插入cDNA片段長度大于800 bp，重組率大于95%。結(jié)果表明所獲酵母雙雜交文庫質(zhì)量較高，符合文庫構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)，保證了文庫的覆蓋度，為進(jìn)一步開展互作蛋白篩選的后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ABA；玉米；酵母雙雜交；cDNA文庫；滴度；重組率；互作蛋白

中圖分類號： S513.01；Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0058-04

脫落酸（ABA）是一種重要的植物激素，它在植物生長發(fā)育的各個方面，包括種子發(fā)育、萌發(fā)和休眠、營養(yǎng)生長及對各種生物、非生物脅迫的響應(yīng)等方面起作用[1-2]。水分脅迫下（包括干旱、鹽漬），植物體通過迅速積累ABA以促進(jìn)氣孔關(guān)閉以及調(diào)節(jié)眾多基因的表達(dá)，從而使植株對逆境環(huán)境做出適應(yīng)反應(yīng)[3-6]。大量研究表明，ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，許多重要的中間組分如胞內(nèi)鈣離子、鈣調(diào)素、磷酸肌醇、cADPR、H+、活性氧、一氧化氮以及蛋白可逆磷酸化等都在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用[7]。然而ABA參與的許多信號途徑的詳細(xì)過程特別是具體的分子作用機(jī)理仍有待闡明，鑒定參與ABA信號途徑的細(xì)胞組分，并對其功能進(jìn)行闡明分析，將有助于我們提高對ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種用來研究蛋白質(zhì)間相互作用的簡便、快速而有效的方法[8]，該方法由Fields和Song于1989年首先建立，至今被廣泛應(yīng)用于生物研究的各個領(lǐng)域[9-10]。它的一個很重要的功能就是發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)以及發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能，即從cDNA文庫中篩選出與已知蛋白相互作用的未知蛋白，進(jìn)而為探索該蛋白的相關(guān)特性及功能奠定基礎(chǔ)[11-15]。所以，高質(zhì)量酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建是利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行大規(guī)?；プ鞯鞍缀Y選的前提和保障[16]。近年來，針對許多重要農(nóng)作物如水稻[17]、小麥[18]、大麥[19]、玉米[20]等，眾多學(xué)者構(gòu)建了以不同組織、器官、細(xì)胞類型或分化時期為材料的酵母雙雜交cDNA文庫，為相關(guān)作物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。然而國內(nèi)外關(guān)于外源ABA處理的玉米cDNA文庫的相關(guān)研究還未見報(bào)道，本研究以施用外源ABA的玉米為材料，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫，旨在有效地分離與已知蛋白相互作用的靶蛋白，以期為深入研究ABA信號網(wǎng)絡(luò)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 以玉米（Zea mays L.）雜交種農(nóng)大108為材料，將玉米種子浸泡12 h后，25 ℃催芽，挑取發(fā)芽一致的種子播于含有營養(yǎng)液的沙土中培養(yǎng)[晝/夜溫度28 ℃/22 ℃，光照度200 μmol/（m2·s），相對濕度75%，晝/夜光周期14 h/10 h]。當(dāng)幼苗的第2片真葉完全展開時，用鋒利的刀片將玉米幼苗從莖基部快速切割下來，放在純水中2 h以消除傷害脅迫[21]，然后用100 μmol/L外源ABA進(jìn)行處理[溫度25 ℃、光強(qiáng)200 μmol/（m2·s）]，在不同的處理時間點(diǎn)（0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h），分別剪取第2片葉，迅速置于液氮中冷凍，將最終所得材料混合均勻，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌DH10B、文庫載體pDONR222（用于構(gòu)建初級文庫）、pDEST22（用于構(gòu)建酵母雙雜交文庫）均購自Invitrogen公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol Reagent、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit、1 kb Plus DNA Ladder、UltraPureTMPhenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol （體積比25 ∶24 ∶1） 購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、卡那霉素為Sigma公司產(chǎn)品；Taq DNA Polymerase、DNA Marker Ⅲ、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.1.4 引物 M13 Forward，5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′； M13 Reverse，5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′； pDEST22 Forward，5′-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3′； pDEST22 Reverse，5′-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3′。所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建

1.2.1 玉米葉片總RNA的提取和mRNA的純化 取玉米葉片，在預(yù)冷的研缽中將其用液氮研磨成細(xì)粉，用Trizol提取其總RNA，具體過程參照說明書進(jìn)行。得到的總RNA經(jīng)過質(zhì)量及純度檢測之后，用于下一步的mRNA純化操作，具體的純化過程參照FastTrack2.0 Kit說明書進(jìn)行。得到的mRNA經(jīng)質(zhì)量及純度檢測之后，用于下一步的文庫構(gòu)建操作。

1.2.2 cDNA初級文庫的構(gòu)建 參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書，按以下步驟進(jìn)行：首先將上步純化得到的mRNA進(jìn)行cDNA第1鏈的合成；然后進(jìn)行cDNA第2鏈的合成及純化；cDNA與三框重組接頭attB1 Adapter連接后進(jìn)行cDNA的分級分離及收集；利用Gateway技術(shù)將收集得到的cDNA與入門文庫載體質(zhì)粒pDONR222混合進(jìn)行BP重組反應(yīng)；重組反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Proteinase K處理以及純化之后，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B；加入1 mL SOC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h，即為cDNA初級文庫菌液；加甘油至終濃度20%，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建 參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書，將上述得到的cDNA初級文庫菌液接種于含有卡那霉素抗性的肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)；第2天中抽質(zhì)粒并檢測吸光度；將中抽得到的質(zhì)粒稀釋到終濃度300 ng/μL，取出其中1 μL，利用Gateway技術(shù)將其與酵母雙雜交文庫載體質(zhì)粒pDEST22（含GAL4 Transcriptional-Activation Domain）混合進(jìn)行LR重組反應(yīng)；重組反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Proteinase K處理以及純化之后，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B；加入3 mL SOC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h，即為酵母雙雜交cDNA文庫菌液；加甘油至終濃度20%，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 文庫質(zhì)量的鑒定

1.2.4.1 庫容量的鑒定 分別從“1.2.2”節(jié)和“1.2.3”節(jié)得到的轉(zhuǎn)化后文庫細(xì)菌原液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，從中吸出50 μL涂布于含有相應(yīng)抗性的LB平板上（初級文庫鑒定平板使用卡那霉素抗性、酵母雙雜交文庫鑒定平板使用氨芐青霉素抗性），37 ℃培養(yǎng)12～16 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）=文庫滴度×文庫總體積，計(jì)算出文庫的滴度以及總?cè)萘俊?/p>

1.2.4.2 重組率和插入片段長度鑒定 從平板上隨機(jī)挑取24個單克隆進(jìn)行菌落PCR，初級文庫菌落PCR使用的引物Primer 1和引物Primer 2分別是M13 Forward和M13 Reverse，酵母雙雜交文庫菌落PCR使用的引物Primer 1和引物Primer 2分別是pDEST22 Forward和pDEST22 Reverse，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，鑒定插入片段大小和陽性克隆重組率。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米葉片總RNA和純化的mRNA質(zhì)量分析

利用Trizol Reagent提取了外源ABA處理的玉米葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28S和18S條帶明亮清晰，亮度比約2 ∶1，表明該總RNA完整性好且基本上未發(fā)生降解（圖1）。經(jīng)總RNA紫外分析測定，結(jié)果顯示D260 nm/D280 nm為1.95，表明總RNA純度好，符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作?？俁NA樣品經(jīng)過分離純化后得到了mRNA，電泳圖結(jié)果可見其在較大范圍內(nèi)呈涂布狀分布（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符，說明純度較高，完整性較好。

2.2 cDNA初級文庫的質(zhì)量鑒定

2.2.1 庫容量測定 從cDNA初級文庫原始菌液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，吸出50 μL涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后計(jì)菌落數(shù)，結(jié)果為643個（圖3），菌液量為1 mL。根據(jù)公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）=文庫滴度×菌液總體積，計(jì)算得出：cDNA初級文庫的滴度=643×1 000/0.05=1.28×107 CFU/mL；cDNA初級文庫的總?cè)萘?1.28×107 CFU/mL×1 mL=1.28×107 CFU。

2.2.2 重組率和插入片段大小測定 從平板上隨機(jī)挑取24個單克隆進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳圖，可以看出所有克隆的PCR結(jié)果都呈陽性，重組率達(dá)100%，插入cDNA片段長度大小不等，主要分布在500～3 000 bp范圍內(nèi)，多態(tài)性較好，且平均插入片段長度大于1 000 bp（圖4）。

2.3 酵母雙雜交文庫cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

2.3.1 庫容量測定 從酵母雙雜交cDNA文庫原始菌液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，吸出50 μL涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后計(jì)菌落數(shù)，結(jié)果為195個（圖5），菌液量為3 mL。根據(jù)公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）=文庫滴度×菌液總體積，計(jì)算得出：酵母雙雜交文庫的滴度=195×1 000/0.05=3.9×106 CFU/mL；酵母雙雜交文庫的總?cè)萘?3.9×106 CFU/mL×3 mL=1.17×107 CFU。

2.3.2 重組率和插入片段大小測定 從平板上隨機(jī)挑取24個單克隆進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，從電泳圖中可以看出24個克隆中有23個為陽性結(jié)果，重組率大于95%，cDNA插入片段長度大小不等，主要分布在500～3 000 bp范圍內(nèi)，多態(tài)性較好，且平均插入片段長度大于800 bp（圖6）。

3 討論

一個高質(zhì)量酵母雙雜交 cDNA 文庫的獲得，能夠?yàn)槲覀冞M(jìn)行大規(guī)?；プ鞯鞍椎暮Y選提供前提和保障，對于我們研究相關(guān)生物的功能蛋白質(zhì)組學(xué)具有重要意義。目前很多生物種類的cDNA文庫已經(jīng)獲得，并且在此基礎(chǔ)上獲得了大量的信息[17-20]，然而關(guān)于外源ABA處理的玉米cDNA文庫的相關(guān)研究還未見報(bào)道。已有的研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白激酶如MAPK[22]、CCaMK[23-25]、CDPK[26]等在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程中發(fā)揮著重要的作用，我們擬利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與這些蛋白相互作用的靶蛋白，進(jìn)而探究該蛋白在ABA信號途徑中的具體作用機(jī)制，因此，外源ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的建立就成為了不可或缺的重要基礎(chǔ)工具。

RNA質(zhì)量的好壞直接影響文庫質(zhì)量的高低，本研究中提取的玉米葉片總RNA純度高、完整性好且基本上未發(fā)生降解，經(jīng)分離純化后得到的mRNA在較大范圍內(nèi)呈涂布狀分布，具有較高的純度和完整性，可用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。本研究在構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫的過程中使用了Gateway技術(shù)，一種基于已研究的非常清楚的λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠高效而快速地將DNA定向重組進(jìn)入不同的載體系統(tǒng)中，進(jìn)而應(yīng)用于蛋白的表達(dá)與功能分析[27-29]。由于在載體構(gòu)建時無需經(jīng)歷限制性內(nèi)切酶的酶切和酶連等過程，并且通過引入3種不同的接頭使得插入片段能夠包含3種不同的讀碼方式，這樣既降低了嵌合克隆出現(xiàn)的概率、保證了插入片段的序列完整性，同時又克服了由于插入片段中非編碼區(qū)帶有終止密碼子而造成的蛋白提前終止翻譯，有效地提高了文庫的完整性和覆蓋性[30]。

通常一個高質(zhì)量的cDNA文庫，其庫容量應(yīng)至少大于 1×106 CFU，這樣才能保證cDNA種類的完整性以及文庫的代表性。本試驗(yàn)對構(gòu)建的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的分析結(jié)果表明，庫容量為1.17×107 CFU，保證了文庫的覆蓋度。而平均插入cDNA片段長度則體現(xiàn)了文庫遺傳信息的完整性，如果大部分克隆插入了全長cDNA序列，則說明文庫的完整性好。本試驗(yàn)構(gòu)建的文庫重組率大于95%，平均插入cDNA 片段長度大于800 bp，說明該文庫達(dá)到了高質(zhì)量文庫的標(biāo)準(zhǔn)，可以用來進(jìn)行后續(xù)的大規(guī)?；プ鞯鞍椎暮Y選試驗(yàn)。

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