謝笑笑　顧興芳Yuling aBi　苗　晗　張圣平*　閆滋福*（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南鄭州 45000；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 0008；Wageningen University，The Netherlands）

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黃瓜CsaDMR6-2基因的克隆及特征分析

謝笑笑1顧興芳2Yuling aBi3苗晗2張圣平2*閆滋福1*
（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南鄭州 450002；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3Wageningen University，The Netherlands）

摘 要：通過系統(tǒng)進(jìn)化樹和黃瓜霜霉病主效QTL分析，確定了與擬南芥抗霜霉病突變基因DMR6同源性較高的CsaDMR6-2基因?yàn)辄S瓜霜霉病感病候選基因。以15份不同遺傳背景的抗病和感病黃瓜自交系為材料克隆了CsDMR6-2基因，經(jīng)過與已知功能的擬南芥基因DMR6、DLO1和DLO2的氨基酸進(jìn)行多序列比對、蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果顯示：歐洲溫室型的抗病材料K15和K58的CsaDMR6-2的CDS序列在856 bp處有1個堿基的突變，引起相應(yīng)氨基酸由絲氨酸（TCA）變成丙氨酸（GCA），進(jìn)而引起其部分蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的變化；CsaDMR6-2與擬南芥的DMR6、DLO1和DLO2基因具有很高的同源性，且同屬于一類氧化酶，兩者具有相同的結(jié)構(gòu)域，而抗病材料的變異位點(diǎn)均發(fā)生在催化區(qū)。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究CsaDMR6-2的基因功能和利用感病基因獲得霜霉病持久廣譜抗性打下了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃瓜；CsaDMR6-2；感病基因；同源克??；霜霉病抗性

謝笑笑，女，碩士研究生，專業(yè)方向：黃瓜遺傳育種與分子生物學(xué)研究，E-mail：xiaoxiao.xie@foxmail.com

黃瓜霜霉病是由霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）引起的，俗稱跑馬干、黑毛等，是世界范圍內(nèi)黃瓜產(chǎn)區(qū)主要葉部病害之一（Thomas，1986；Lebeda，1992；曹清河 等，2007），已在70多個國家發(fā)生為害（王麗娟 等，2010）。近年來，國內(nèi)外研究者對黃瓜霜霉病進(jìn)行了比較深入的研究，發(fā)現(xiàn)了多個黃瓜霜霉病抗性主效QTL位點(diǎn)。丁國華（2004）采用抗病基因類似序列（resistance gene analog，RGA）克隆和標(biāo)記基因方法，成功獲得了15個RGA片段。李金鑫等（2008）以東農(nóng)129（抗霜霉病黃瓜）為試驗(yàn)材料，利用差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDRT-PCR），研究黃瓜接種霜霉病菌前后基因表達(dá)的差異，成功鑒定出4個抗病相關(guān)基因。白智龍等（2008）利用S94和S06構(gòu)建永久群體衍生的224個F6：7家系，在第1和第6連鎖群上檢測出黃瓜霜霉病抗性的3個QTLs位點(diǎn)；Zhang等（2013）利用K8 與K18為抗感親本構(gòu)建的F2群體及F2：3家系，分別在1號、5號、6號染色體上定位到5個QTLs；Pang 等（2013）以抗霜霉病漸滲系IL52與感病品種長春密刺為親本得到的276個F2單株為作圖群體，在第5號染色體上檢測到2個與霜霉病抗性相關(guān)的QTLs。日本學(xué)者Yoshioka 等（2014）利用CS-PMR1和日本栽培種 Santou 構(gòu)建的RIL群體，在1號、5號、6號染色體上找到多個QTLs，其中包括1個主效QTL。但目前還未見霜霉病抗性基因被克隆的報道（Panstruga & Dodds，2009）。

綜合前人的研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜霜霉病抗性均由隱性基因控制（Zhang et al.，2013）。由此推測黃瓜霜霉病抗性可能是由感病基因的缺失或突變導(dǎo)致的。感病基因（S）是指一些在植物防御過程中起消極作用的基因，與抗病基因（R）相對，它在原生功能上與R基因一樣，是植物正常代謝所必須的基因，只有在病原物侵染植物后它們才表現(xiàn)出截然對立的次生功能（Eckardt，2002）。與R相比，在植物免疫系統(tǒng)里S基因更可能提供持久抗病的類型。1997年第1個植物感病基因大麥MLO（Mildew Resistance Locus O）基因被發(fā)現(xiàn)（Büschges et al.，1997）。之后研究工作者相繼在擬南芥、番茄、豌豆、葡萄、辣椒等作物中也發(fā)現(xiàn)MLO基因（Consonni et al.，2006；Bai et al.，2008；Feechan et al.，2008；Pavan et al.，2011；Kim & Hwang，2012）?，F(xiàn)已在雙子葉和單子葉植物中發(fā)現(xiàn)30多個MLO同源基因（Panstruga，2005），且有學(xué)者以黃瓜、甜瓜和西瓜基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法對MLO 基因家族進(jìn)行鑒定與分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃瓜、甜瓜和西瓜基因組中共含有42 個MLO 基因家族成員，每一個物種均含有14 個成員，且保守性強(qiáng)（徐堅 等，2014）。除MLO外，在擬南芥等植物上還發(fā)現(xiàn)與白粉病感病有關(guān)的基因PMR4、PMR5 和PMR6（Vogel et al.，2002；Nishimura et al.，2003；Vogel et al.，2004；Ellinger et al.，2013）。在番茄中發(fā)現(xiàn)PMR4同源基因SlPMR4表達(dá)量下調(diào)的時候，其感染白粉病的能力會降低（Huibers et al.，2013）。在擬南芥上發(fā)現(xiàn)的基因DMR1（Downy mildew resistance gene 1）、DMR6（Downy mildew resistance gene 6）、DLO1（DMR6-like Oxygenase 1）與霜霉病感病性相關(guān)，它們的突變體都能對霜霉病產(chǎn)生不同強(qiáng)度的抗性（Zeilmaker et al.，2015）。 圖位克隆擬南芥的DMR6基因，發(fā)現(xiàn)其編碼一種未知功能的 2-oxoglutarate（2OG）-Fe（Ⅱ）oxygenase，經(jīng)EMS誘變，dmr6在基因序列的691 bp處發(fā)生1個堿基的突變（G-A），相應(yīng)的密碼子從色氨酸變?yōu)榱私K止密碼子（第141氨基酸），致使后面的催化區(qū)域無法翻譯，而使dmr6變成了無效的等位基因，使擬南芥dmr6突變體對霜霉病菌產(chǎn)生抗性（van Damme et al.，2008）。對于黃瓜霜霉病的研究，雖然發(fā)現(xiàn)了多個抗性主效QTL位點(diǎn)，但對感病基因的研究還很少。

本試驗(yàn)擬通過對擬南芥DMR6的氨基酸序列與黃瓜的同源序列比對，尋找黃瓜霜霉病的S基因，分析其基因結(jié)構(gòu)，以期為基因功能分析及抗霜霉病育種實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及抗病性鑒定

以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃瓜課題組提供的15份不同遺傳背景的黃瓜純合自交系為試驗(yàn)材料。其中包括12份抗霜霉病材料K5、K7、K8、K15、K18、K19、K38、K58、K70、K71、K78 和YRP1；3份感霜霉病材料K10、K45和YRP2。種子經(jīng)0.3% 的雙氧水處理后置于28 ℃人工培養(yǎng)箱中催芽，胚根伸出約3 mm后播于30孔穴盤中，在人工氣候箱（RXZ智能型，寧波江南儀器廠）內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：14 h 光照/10 h 黑暗，白天25 ℃/夜間18 ℃。待幼苗長到2～3片真葉時，取下幼葉用錫箔紙包裹，寫上編號，迅速放入液氮冷凍，后放于-80 ℃冰箱備用。

2014年7月將上述抗、感霜霉病材料在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所病理組可控溫室里進(jìn)行霜霉病苗期人工接種鑒定。接種條件：10 h 光照/ 14 h 黑暗，白天22 ℃/夜間18 ℃。接種鑒定方法、病情調(diào)查方法及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)均參考“中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1857.2—2010第1部分：黃瓜霜霉病鑒定技術(shù)規(guī)程”。接種7 d 后開始進(jìn)行病情調(diào)查，計算病情指數(shù)。

1.2 DNA 及RNA 的提取

采用改良的CTAB法提取DNA，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒〔購于寶生物工程（大連）有限公司〕提取黃瓜葉片總RNA。NanoDrop?ND-1000（NanoDrop Technologies，Inc.，USA）檢測RNA的濃度及純度。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。

1.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及確定候選基因

為尋找同源基因，利用擬南芥抗霜霉病基因DMR6（基因編號：AT5G24530.1）的氨基酸序列分別在擬南芥基因組網(wǎng)站（http：//www.arabidopsis. org/Blast/index.jsp）和黃瓜基因組網(wǎng)站（http：//www. icugi.org/cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi）（Huang et al.，2009）上進(jìn)行Blast。將從黃瓜基因組上獲得的同源性較高基因的氨基酸序列與擬南芥DMR6基因的氨基酸序列一起用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Tamura et al.，2011）。 根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果再結(jié)合黃瓜霜霉病主效QTL位點(diǎn)，確定候選基因，然后將該候選基因的氨基酸序列在擬南芥基因組網(wǎng)站再次進(jìn)行Blast，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.4 cDNA合成及目的基因克隆

利用TaKaRa Master Mix PrimeScriptTMRT〔寶生物工程（大連）有限公司〕合成 cDNA第一條鏈。根據(jù)目的基因cDNA序列用Primer Primier 6.0設(shè)計引物，上游引物序列：5′-ATGTCCGCTTCCGGC-3′；下游引物序列：5′-TTAAATCCTAAACAAATCTAA ACATCTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度1 044 bp。擴(kuò)增體系為：3 μL cDNA，10 μL mix（Promega），7 μL超凈水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段，PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行切膠純化測序。測序上游引物：CsaDMR6-2_35_F為5′-CCACACCAAGTTGCT TGTCA-3′，CsaDMR6-2_231_F為5′-AACGCGACGG TTTCTTTCT-3′，CsaDMR6-2_713_F為5′-TCTCCT CCAAGACCAAGTCC-3′；下游引物：CsaDMR6-2_ 125_R為5′-GGAGTTTGGACGGTCAGAGA-3′，CsaDMR6-2_580_R為5′-AGCCCCAAGCTCTCAGAA AT-3′。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 序列比對及功能分析

序列拼接利用 Sequencher軟件完成。利用在線網(wǎng)站 http：//www.bio-soft.net/sms/index.html將測序結(jié)果翻譯成氨基酸序列，并利用 ClustalX 2.1進(jìn)行氨基酸的序列比對。

將擬南芥DMR6與目的基因的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blastp分析預(yù)測保守域結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行比較?；虻牡鞍踪|(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)在網(wǎng)站phyre2（http：//www.sbg.bio.i c.ac.uk/phyre2/html/page. cgi？id=index）上進(jìn)行預(yù)測，并進(jìn)行比較尋找差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析確定黃瓜霜霉病感病候選基因CsaDMR6-2

圖1 黃瓜與擬南芥DMR6同源基因進(jìn)化樹分析

將擬南芥抗霜霉病基因DMR6（AT5G24530.1）氨基酸序列在黃瓜基因組網(wǎng)站上進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)了5個同源性較高的基因，分別是：Csa4M091870.1、Csa5M146870.1、Csa7M378370.1、Csa7M375860.1 和Csa7M375850.1。從擬南芥基因組網(wǎng)站上Blast到的同源基因中挑選出8個同源性較高的基因：AT4G10490.1、AT4G10500.1、AT2G36690.1、AT2G44800.1、AT5G05600.1、AT3G60290.1、AT3G11180.2和AT3G11180.1。用MEGA 5.0軟件采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。從進(jìn)化樹可知：黃瓜7號染色體上的2個基因：Csa7M375850.1和Csa7M375860.1屬于同一分支，且與擬南芥DMR6同源性最高，但至今并未有黃瓜7號染色體上存在霜霉病QTL位點(diǎn)的報道。此外同源性較高的還有Csa4M091870.1和Csa5M146870.1基因，分別命名為CsaDMR6-1、CsaDMR6-2 （Schouten et al.，2014）。CsaDMR6-1已經(jīng)被克隆，該基因在擬南芥dmr6-1突變體中過表達(dá)，可使其很大程度地恢復(fù)感病能力，但該基因位于4號染色體，周圍并未有抗黃瓜霜霉病QTL的發(fā)現(xiàn)（Zeilmaker，2012）。而位于5號染色體上部的2 個dm_5.1（Pang et al.，2013）和dm5.1（Yoshioka et al.，2014）與CsaDMR6-2連鎖，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃瓜課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，在黃瓜5號染色體上有3個霜霉病QTL位點(diǎn)dm5.1、dm5.2和dm5.3，也與CsaDMR6-2在染色體上的物理位置較近，推測CsaDMR6-2為霜霉病感病基因的候選基因。利用CsaDMR6-2氨基酸序列在擬南芥基因組網(wǎng)站上進(jìn)行Blast，結(jié)果顯示，擬南芥DMR6（AT5G24530.1）與其同源性較高，再次驗(yàn)證兩者具有較高的同源性。

2.2 黃瓜CsaDMR6-2的基因結(jié)構(gòu)與氨基酸序列分析

通過同源克隆得到黃瓜CsaDMR6-2的CDS （coding domain sequence）序列。CsaDMR6-2的基因組序列為2 704 bp，CDS 序列全長1 044 bp，含有4個外顯子，編碼347個氨基酸。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，CsaDMR6-2與擬南芥的DMR6 基因結(jié)構(gòu)相似（圖2：b-1，b-2）。AtDMR6的CDS序列為1 026 bp，編碼341個氨基酸，兩者包含2個相同的結(jié)構(gòu)域，其中2OG-FeⅡ_Oxy是催化域。

圖2 15份材料CsaDMR6-2氨基酸序列比對（部分）及CsaDMR6-2和AtDMR6的基因結(jié)構(gòu)彩色圖版見《中國蔬菜》網(wǎng)站：www.cnveg.org，下圖同。

克隆15份抗感材料的CsaDMR6-2基因，結(jié)果顯示，抗性材料中僅歐洲類型K15和K58在CDS 第856 bp處存在1個堿基的差異：T突變?yōu)镚，將該突變體命名為Csadmr6-2。該突變引起氨基酸序列上第286個氨基酸由絲氨酸（密碼子為TCA，簡寫為S）變?yōu)楸彼幔艽a子為GCA，簡寫為A）。而且這2個突變位點(diǎn)，正好位于CsaDMR6-2基因具有功能作用的2OG-FeⅡ_Oxy催化域內(nèi)。在15份材料中除歐洲溫室型材料K15和K58的CsaDMR6-2有此突變外，其他類型的抗病品種及感病對照品種均無此突變（表1）。進(jìn)一步對15份材料的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2-a。

表1 試驗(yàn)材料類型、測序結(jié)果及霜霉病抗性

圖3 CsaDMR6-2 與 Csadmr6-2 蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果a：虛線內(nèi)表示二者在二級結(jié)構(gòu)上的差異，圓環(huán)處是氨基酸突變處；表示α螺旋，表示β折疊，表示無規(guī)則卷曲；b：二者在三級結(jié)構(gòu)上的差異，以箭頭表示。圖片3和4為Csadmr6-2的三級結(jié)構(gòu)；圖片5和6為CsaDMR6-2的三級結(jié)構(gòu)。

2.3 蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對CsaDMR6-2 與 Csadmr6-2蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測及比較（圖3）。二者在蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)上存在部分差異，特別是在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)上突變處（圖3-a圓環(huán)標(biāo)明處）前后有4處明顯差異，包括1個α螺旋、3個β折疊。這些二級結(jié)構(gòu)的差異在三級結(jié)構(gòu)上仍有體現(xiàn)（圖3-b箭頭處）。圖4表示了CsaDMR6-2與AtDLO1、AtDLO2、AtDMR6的氨基酸序列比對結(jié)果。各基因的氨基酸序列長度基本一致，從同源性上看，擬南芥DMR6與CsaDMR6-2的同源性高于其與AtDLO1、AtDLO2的同源性。圖4中下劃部分為結(jié)構(gòu)域：2OG-FeⅡ_Oxy，“△”上面為Csadmr6-2變異的位置。

3 討論

前人已發(fā)現(xiàn)多個黃瓜霜霉病的抗性主效QTL位點(diǎn)，主要分布于5號染色體上，但發(fā)現(xiàn)的連鎖標(biāo)記與性狀連鎖不夠緊密，不利于分子標(biāo)記輔助育種，加之遺傳基礎(chǔ)狹窄和缺乏必要的基因組信息，目前還未見黃瓜霜霉病相關(guān)基因被克隆的報道。長期以來，人們關(guān)于植物抗病育種研究多是致力于尋找抗病基因。但是大量研究表明，R基因產(chǎn)生的抗性不持久（Panstruga & Dodds，2009）。近年來，對于S基因的研究為植物抗病育種開辟了新的道路（Pavan et al.，2010）。S基因編碼一類受病原菌控制的蛋白質(zhì)，以促進(jìn)病原菌的繁殖使植物感病。因此，去除或使S基因的功能喪失會使病原菌的感病能力降低、喪失（Gust et al.，2010），這種植物免疫類型可能更持久（Gawehns et al.，2012）。Pavan等（2010）提出一種新穎的育種方法：使植物感病基因的功能喪失，進(jìn)而使其產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。已有學(xué)者在黃瓜和番茄中發(fā)現(xiàn)DMR6同源基因，它們可使擬南芥dmr6突變體恢復(fù)部分感病能力，說明黃瓜、番茄中的DMR6-like基因促進(jìn)其感染霜霉?。╖eilmaker，2012）。

本試驗(yàn)第一次通過同源克隆的方法在多份具有不同遺傳背景且霜霉病抗性不同的材料中，根據(jù)擬南芥AtDMR6基因在黃瓜上同源克隆CsaDMR6-2基因，并獲得全長cDNA序列。本試驗(yàn)結(jié)果顯示僅歐洲溫室型材料在該基因的CDS序列上有1個堿基的突變，并引起相應(yīng)氨基酸的變化，而其他生態(tài)類型材料則不具有該突變位點(diǎn)。進(jìn)一步比較CsaDMR6-2與擬南芥DMR6基因保守域，發(fā)現(xiàn)兩者具有相同的兩個結(jié)構(gòu)域：DIOX_N和2OG-FeⅡ_ Oxy，屬于2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶，且歐洲溫室型材料中該基因的突變部位發(fā)生在2OG-FeⅡ_Oxy結(jié)構(gòu)域中。CsaDMR6-2與已知功能AtDLO1、AtDLO2、AtDMR6氨基酸序列比對，也發(fā)現(xiàn)它們具有很高的同源性。由此推測CsaDMR6-2很可能是歐洲類型黃瓜感染霜霉病的相關(guān)基因。

從黃瓜霜霉病抗病基因的研究可以發(fā)現(xiàn)：不同的試驗(yàn)材料所定位到的抗病QTL不完全相同。到目前為止，有6個QTLs分別可解釋大于20%的變異（Schouten et al.，2014）。此外黃瓜霜霉病菌是否存在生理小種分化問題一直沒有定論，但關(guān)于其具有小種分化現(xiàn)象的報道國外已有許多（Palti & Cohen，1980；Thomas，1986；Lebeda，1992；Shetty et al.，2002）。由此可以推測，不同生態(tài)類型、不同遺傳背景的黃瓜可能擁有不同的霜霉病感病基因。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12份抗病材料中，只有歐洲溫室型黃瓜的CDS序列發(fā)生了堿基突變，其他10份抗病材料中該基因的CDS不存在堿基突變，推測原因?yàn)椴煌瑏碓春皖愋偷目共〔牧暇哂胁煌倪z傳背景和不同的抗病或感病基因，CsaDMR6-2可能不是霜霉病唯一的S基因。

利用感病基因進(jìn)行同源克隆的方法，將有助于加速黃瓜霜霉病抗性的研究，并可通過S基因沉默產(chǎn)生具有持久廣譜抗性的黃瓜霜霉病新材料，為抗霜霉病育種奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)的CsaDMR6-2作為霜霉病感病基因的候選基因，是通過與已發(fā)現(xiàn)和證實(shí)的擬南芥的DMS-基因AtDMR6氨基酸序列比對獲得的，它們具有較高的同源性，并且位于黃瓜霜霉病抗性QTL位點(diǎn)主要所在的5號染色體上。但要確認(rèn)它是霜霉病的S基因需要進(jìn)一步進(jìn)行該基因的功能驗(yàn)證，利用基因編輯技術(shù)研究該候選基因的功能。后續(xù)可以選用更多的歐洲類型抗感霜霉病材料同源克隆CsaDMR6-2基因，并進(jìn)行基因序列比對、表達(dá)分析、過表達(dá)及RNAi等研究來進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能。此外本試驗(yàn)在黃瓜7號染色體上還發(fā)現(xiàn)2個基因：Csa7M378370.1和Csa7M375860.1與擬南芥DMR6同源性較高，而目前還未有7號染色體上存在霜霉病抗病QTL位點(diǎn)的報道，因此也可作為今后研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆出15份來源不同的黃瓜霜霉病抗病材料及感病材料的CsaDMR6-2基因的cDNA全長，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，歐洲溫室型材料K15和K58在CDS序列856 bp處有1個堿基的差異，且進(jìn)一步引起第286個氨基酸的變化。經(jīng)過蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，該變化引起部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。將CsaDMR6-2與擬南芥DMR6基因保守域比較，與已知功能的AtDLO1，AtDLO2和AtDMR6氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)它們具有很高的同源性，都屬于同一類氧化酶。結(jié)合同源比對、進(jìn)化樹分析和黃瓜霜霉病抗性QTL位點(diǎn)分析，CsaDMR6-2可作為主要的黃瓜霜霉病感病基因的候選基因。

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Cloning and Characteristic Analysis of Gene CsaDMR6-2 in Cucumber

XIE Xiao-xiao1，GU Xin-fang2，Yuling Bai3，MIAO Han2，ZHANG Sheng-ping2*，YAN Zi-fu1*
（1Horticultural College，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，Henan，China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；3Wageningen University，The Netherlands）

Abstract：The objective of the current study was to exploit susceptible gene （S-gene） for DM in cucumber，which will be provided as target S-gene for editing and functional analysis，leading to a new way of breeding for durable and broad-spectrum resistance to DM in cucumber. A total of 15 cucumber inbred lines of different genetic background of DM resistance （DMR） was used to identify and clone the homologs of DMR6，a DM S-gene in Arabidopsis，with the analysis of systematic evolutionary tree and major QTLs of cucumber DMR. A highly homologue candidate S-gene CsaDMR6-2 was identified. The alignment of the amino acid sequences and the prediction of secondary and tertiary protein structures between CsaDMR6-2 and Arabidopsis genes DMR6，DLO1 and DLO2 of known functions indicated that one base-pair mutation was found at 856 bp of CDS sequence of CsaDMR6-2 from K15 and K58 of European type with DMR，leading to the change of amino acids from serine （TCA） into alanine （GCA），which resulted in some changes of their protein secondary and tertiary structures. The results also indicated that CsaDMR6-2 and Arabidopsis genes DMR6，DLO1 and DLO2 have very high homologue in sequences. They are in the same group of oxidases，having the same domain and the same mutation location happened in catalytic region from the DMR genotype. The current study provided support to further function analysis of CsaDMR6-2 and the utilization of S gene for durable and broad-spectrum resistance to DM in cucumber.

Key words：Cucumber；CsaDMR6-2；Susceptible gene；Homologue gene cloning；Downy mildew resistance（DMR）

*通訊作者（

Corresponding authors）：閆滋福，男，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：黃瓜遺傳育種研究，E-mail：zifu.yan@qq.com；張圣平，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：黃瓜遺傳育種研究，E-mail：zhangshengping@caas.cn

收稿日期：2015-12-10；接受日期：2016-03-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272187），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目，國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS-25）