陳寶玲　甘桂云　王先?！∮谇僦ァ↓埌菜?（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 50004；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西南寧50007；桂林市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，廣西桂林5400）

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126份番茄材料的抗性基因分子標(biāo)記檢測

陳寶玲1甘桂云2王先裕1于琴芝3龍安四1*
（1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004；2廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西南寧530007；3桂林市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，廣西桂林541001）

摘 要：利用分子標(biāo)記技術(shù)，對56份大、中果型番茄進(jìn)行煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、葉霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1 8個(gè)抗性基因的檢測，對70份小果型番茄進(jìn)行Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 5個(gè)抗性基因的檢測。共獲得含煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a的材料71份；在番茄黃化曲葉病毒病的3個(gè)抗性基因方面，含純合抗性基因Ty-1的材料7份，雜合16份；含雜合抗性基因Ty-2的材料1份；含純合抗性基因Ty-3的材料5份，雜合7份。真菌性病害方面，含葉霉病抗性基因Cf-9的材料101份；含純合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份，雜合6份；含枯萎病抗性基因I-2的材料68份；含根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1的材料45份。供試番茄材料中，DHG-27同時(shí)含有7個(gè)抗性基因；含有6個(gè)抗性基因的材料有5份，分別為：DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4；含有5個(gè)抗性基因的有HG-3、XHG-35 2份材料。

關(guān)鍵詞：番茄；分子標(biāo)記；抗性基因檢測

陳寶玲，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：chenbl1990721@163.com

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，因其美味多汁、營養(yǎng)豐富，一直深受人們的喜愛，但是由于連年種植造成嚴(yán)重的連作障礙，番茄病害已達(dá)40多種（杜永臣 等，1999）。廣西地區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重的有晚疫病、葉霉病、枯萎病、煙草花葉病毒病、番茄黃化曲葉病毒病、番茄根結(jié)線蟲病等。選用番茄抗病品種是解決病害問題的根本途徑之一（孔凡慧 等，2015）。趙楊等（2012）指出，目前我國針對番茄主要病害尚缺乏免疫和高抗品種，可能的原因是育成的番茄品種缺乏相關(guān)抗病基因。抗病性鑒定是抗病育種的首要工作，常規(guī)鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易受環(huán)境及人為主觀因素影響，且難以對多個(gè)抗性同時(shí)進(jìn)行鑒定，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，可以在苗期進(jìn)行大量的抗病性鑒定，不受時(shí)間地域限制，顯著加速育種進(jìn)程（吳媛媛 等，2009）。本試驗(yàn)利用分子標(biāo)記技術(shù)，對126份番茄材料進(jìn)行抗性基因檢測，以便追蹤目標(biāo)基因，在育種中實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇，為今后番茄聚合抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院番茄課題組從國內(nèi)外收集的126份番茄材料，經(jīng)多代分離自交純化的高代自交系（表1），每一代都嚴(yán)格篩選單株留種，于2015年3月種植在廣西武鳴試驗(yàn)基地。其中56份大、中果型番茄進(jìn)行煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、葉霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1共6種病害8個(gè)抗性基因的PCR檢測；70份小果型番茄檢測Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 共5種病害的5個(gè)抗性基因。

1.2 DNA的提取及試驗(yàn)試劑

DNA提取采用改良的CTAB法（陳昆松 等，2004），取新鮮嫩葉作為樣品提取番茄基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，將提取的DNA用TE稀釋至400 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)使用的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、CTAB等分子試劑均購自Transgene公司。試驗(yàn)引物序列（表2）由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 126份番茄材料的類型及來源

1.3 抗性基因檢測及PCR反應(yīng)體系

葉霉病抗性基因Cf-9、煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a、根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1的檢測參照孫亞林（2008）開發(fā)的標(biāo)記（表2）。PCR反應(yīng)體系25 μL：2.5 μL 10× Buffer with Mg2+，0.5 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物各0.5 μL（100 μmol·L-1），0.5 μL DNA 模板（100 ng·μL-1），0.5 U Taq DNA聚合酶，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，適宜Tm值退火1 min，72 ℃延伸80 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

參照Matthew等（2010）、Merk和Foolad （2012）利用標(biāo)記位點(diǎn)dTG328設(shè)計(jì)的CAPS引物檢測番茄抗晚疫病Ph-3基因（表2）。PCR反應(yīng)體系20 μL：2 μL 10×Buffer with Mg2+，0.4 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物各0.4 μL（100 μmol·L-1），1 μL DNA 模板（200 ng·μL-1），0.3 U Taq DNA聚合酶，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。酶切反應(yīng)體系25 μL：2.5 μL BstNI Buffer，0.3 μL BstN I內(nèi)切酶，2.2 μL ddH2O，20 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，37 ℃酶切2 h。

表2 用于分子標(biāo)記的引物信息

枯萎病抗性基因I-2的檢測參照徐薪惟（2012）開發(fā)的SNP標(biāo)記（表2），PCR反應(yīng)體系25 μL：2.0 μL 10× Buffer with Mg2+，2.5 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物各1.0 μL（10 μmol·L-1），0.5 μL DNA 模板（100 ng·μL-1），0.5 U Taq DNA聚合酶，ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1的檢測參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組葛乃蓬等（2014）開發(fā)的雙重SNP標(biāo)記（表2），PCR反應(yīng)體系20 μL：2.0 μL 10× Buffer with Mg2+，0.4 μL dNTPs（2.5 mM），正反向引物（100 μmol·L-1）各0.4 μL，正反向引物（100 μmol·L-1）各0.2 μL，1.0 μL DNA 模板（200 ng·μL-1），0.2 U Taq DNA聚合酶，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3的檢測參照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供的引物進(jìn)行（未列出）。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×Go Taq GreenMaster Mix 5 μL，正反向引物（100 μmol·L-1）各0.25 μL，DNA模板（200 ng·μL-1）0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，擴(kuò)增產(chǎn)物16 ℃保存。

上述PCR及酶切產(chǎn)物在含有核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳40 min，120 V恒定電壓，最終結(jié)果在ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)上顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a的檢測

圖1為部分材料Tm-2a的PCR擴(kuò)增結(jié)果。含Tm-2a基因的材料可以擴(kuò)增出472 bp的特異性片段，不含該抗性基因的材料則無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)檢測，126份材料中，71份含有抗性基因Tm-2a，55份不含抗性基因。

圖1 煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a檢測結(jié)果M：Marker；CK1：陽性對照；CK2：陰性對照；1～22：不同番茄材料，下圖同。

2.2 番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的檢測

經(jīng)Ty-1引物雙重SNP擴(kuò)增（圖2），含純合抗性基因的材料擴(kuò)增出938 bp的特異性片段，含雜合抗性基因的材料擴(kuò)增出948 bp和1 343 bp的特異性片段，不含抗性基因的材料擴(kuò)增出1 343 bp的片段。經(jīng)檢測，126份材料中，含純合抗性基因Ty-1的有7份，雜合的16份，103份材料不含Ty-1基因。

經(jīng)Ty-2引物擴(kuò)增（圖3），含抗性基因的材料擴(kuò)增出300 bp的特異性片段，不含抗性基因的材料擴(kuò)增出600 bp的片段。經(jīng)檢測，56份大、中果型材料中，均不含純合抗性基因Ty-2，僅DHG-34含有雜合抗性基因。經(jīng)Ty-3引物擴(kuò)增（圖4），含純合抗性基因的材料擴(kuò)增出500 bp的特異性片段，含雜合抗性基因的材料擴(kuò)增出500 bp和300 bp的特異性片段，不含抗性基因的材料擴(kuò)增出300 bp的片段。經(jīng)檢測，56份大、中果型材料中，含Ty-3純合抗性基因的有5份，雜合的7份，無抗性基因的材料44份。

2.3 葉霉病抗性基因Cf-9的檢測

經(jīng)Cf-9引物擴(kuò)增（圖5），含抗性基因的材料擴(kuò)增出415 bp的特異性片段，不含抗性基因的材料則無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)檢測，126份材料中，有101份含有抗性基因Cf-9，25份不含抗性基因。

2.4 晚疫病抗性基因Ph-3的檢測

經(jīng)Ph-3引物擴(kuò)增（圖6），所有材料均可擴(kuò)增出400 bp的特異性片段，經(jīng)BstN I酶切后，含純合抗病基因的材料擴(kuò)增出250 bp和150 bp的特異性片段，含雜合抗病基因的材料擴(kuò)增出150、250 bp 和400 bp的特異性片段，不含抗病基因的材料不存在酶切位點(diǎn)，呈現(xiàn)400 bp的片段。經(jīng)檢測，56份大、中果型番茄材料中，含純合抗性基因Ph-3的材料有1份，材料編號為DHG-11；含雜合抗性基因Ph-3的有6份，其余不含抗性基因。

2.5 枯萎病抗性基因I-2的檢測

經(jīng)I-2引物擴(kuò)增（圖7），含抗病基因的材料擴(kuò)增出1 300 bp的特異性片段，不含抗病基因的材料則無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)檢測，126份材料中，68份含有抗性基因I-2，58份不含抗性基因。

圖2 番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1檢測結(jié)果

圖3 番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2檢測結(jié)果

圖4 番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測結(jié)果

圖5 葉霉病抗性基因Cf-9檢測結(jié)果

2.6 根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1檢測

圖6 晚疫病抗性基因Ph-3檢測結(jié)果

圖7 枯萎病抗性基因I-2檢測結(jié)果

圖8 根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1檢測結(jié)果

表3 大、中果型番茄材料抗性基因檢測結(jié)果

經(jīng)Mi-1引物擴(kuò)增（圖8），含抗性基因的材料擴(kuò)增出1 353 bp和556 bp的特異性片段，不含抗性基因的材料擴(kuò)增出1 287 bp的特異性片段。經(jīng)檢測，全部供試材料中，45份材料含有抗性基因Mi-1，81份不含抗性基因。

以上的試驗(yàn)結(jié)果表明（表3、4），126份供試材料中，含煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a的材料有71份。在番茄黃化曲葉病毒病的3個(gè)抗性基因方面，含純合抗性基因Ty-1的材料7份，雜合16份；僅1份材料含雜合抗性基因Ty-2；含純合抗性基因Ty-3的材料5份，雜合7份。在真菌性病害方面，含葉霉病抗性基因Cf-9的材料最多，有101份；含純合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份，雜合6份；含枯萎病抗性基因I-2的材料68份；含根結(jié)線蟲病抗性基因Mi-1的材料共45份。供試番茄材料中，DHG-27同時(shí)含有7個(gè)抗性基因；含有6個(gè)抗性基因的材料有5份，分別為：DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4；含有5個(gè)抗性基因的有HG-3、XHG-35 2份材料。

表4 小果型番茄材料抗性基因檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從126份不同類型的番茄材料中篩選出多份兼抗多種病害的材料。其中含有抗性基因Tm-2a、Cf-9、I-2、Mi-1的材料較多，為今后培育多抗聚合番茄材料提供更多選擇。

多份材料番茄黃化曲葉病毒病Ty-1和Ty-3抗性基因的檢測結(jié)果一致，這可能與Ty-1和Ty-3基因都位于6號染色體有關(guān)。付蓉蓉等（2011）認(rèn)為，同時(shí)含有純合抗性基因Ty-1和Ty-3的番茄材料具有更高更穩(wěn)定的抗性。曹永翔和張喜春（2007）指出，Cf-9抗性基因?qū)χ袊壳暗?個(gè)葉霉病優(yōu)勢生理小種具有較強(qiáng)抗性。含有Cf-9抗性基因的供試材料最多，對防御葉霉病有巨大優(yōu)勢。雖然國內(nèi)外學(xué)者在番茄晚疫病抗病性鑒定方面取得了一定成果，但目前生產(chǎn)中還沒有真正被應(yīng)用的抗病品種（趙楊 等，2012）。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，含有晚疫病純合抗性基因的材料只有DHG-11，后期試驗(yàn)應(yīng)充分合理利用此材料。吳媛媛等（2010）報(bào)道，I-2基因可同時(shí)抗枯萎病生理小種1和生理小種2，在番茄抗枯萎病育種中應(yīng)重視含有該基因的材料。曹永翔和張喜春（2007）還指出，Mi-1基因可抗南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪洼根結(jié)線蟲3種主要線蟲，含有Mi-1基因的材料對番茄連作嚴(yán)重、根結(jié)線蟲病高發(fā)地區(qū)具有重要意義。

分子標(biāo)記技術(shù)以抗病基因研究為基礎(chǔ)，具有操作簡便、用時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行高通量的抗病篩選，這對縮短抗病育種年限及減少工作量具有重要意義。培育兼抗多種病害的番茄品種是防治番茄病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法。本試驗(yàn)對126份番茄材料進(jìn)行抗性基因的分子標(biāo)記輔助選擇，發(fā)現(xiàn)多數(shù)材料具有多種抗性基因。下一步試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行更多材料的相關(guān)抗性基因檢測，盡可能檢測更多的抗性基因，同時(shí)對部分雜合抗病基因材料進(jìn)一步篩選純化。

孫亞林（2008）指出，在育種過程中運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇對基因型進(jìn)行選擇時(shí)，所用標(biāo)記大多與目標(biāo)基因具有一定的遺傳距離，分子標(biāo)記會與目標(biāo)基因發(fā)生連鎖互換，從而在檢測過程中出現(xiàn)假陽性，影響最后的選擇效果。因此為了驗(yàn)證分子標(biāo)記技術(shù)的準(zhǔn)確性，在后期的試驗(yàn)中，應(yīng)對材料進(jìn)行室內(nèi)及田間接種鑒定，進(jìn)一步確定材料對病害的抗感程度，并且對農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀測統(tǒng)計(jì)，從而篩選出抗多種病害且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的番茄材料，同時(shí)應(yīng)繼續(xù)收集番茄種質(zhì)資源，為今后培育品質(zhì)優(yōu)良、兼抗多種病害的番茄品種奠定基礎(chǔ)。

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Molecular Marker Detection of Resistant Genes from 126 Tomato Varieties

CHEN Bao-ling1，GAN Gui-yun2，WANG Xian-yu1，YU Qin-zhi3，LONG An-si1*
（1Agronomy College of Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China；2Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China；3Guilin City Cash Crops Technology Extention Station，Guilin 541001，Guangxi，China）

Abstract：Molecular marker technolocy was used to test 8 resistant genes from 56 tomato materials with large and middle fruit types including Tobacco mosaic virus disease resistant gene Tm-2a，Tomato yellow leaf curl virus disease resistant genes Ty-1、Ty-2、Ty-3，leaf mould resistant gene Cf-9，late blight resistant gene homozygous Ph-3，fusarium wilt resistant genes I-2，and root knot nematode resistant gene of Mi-1. Besides，5 resistant genes including Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 from 70 tomato materials of small fruit types were also tested. 71 materials with resistant gene Tm-2a，7 materials with pure resistant gene Ty-1，16 materials with heterozygosisbook=41,ebook=46resistant gene Ty-1，1 material with heterozygosis resistant gene Ty-2，5 materials with pure resistant gene Ty-3，7 materials with heterozygosis resistant gene Ty-3，101 materials with resistant gene Cf-9，1 material with pure resistant gene Ph-3，6 materials with heterozygosis resistant gene Ph-3，68 materials with resistant gene I-2，45 materials with resistant gene Mi-1.Among them，DHG-27 contains 7 resistant genes. There were 5 materials （DHG-11，DHG-20，DHG-34，ZHG-8，HG-4）containing 6 resistant genes. There were 2 materials（HG-3 and XHG-35）containing 5 resistant genes.

Key words：Tomato；Molecular marker；Resistant gene detection

*通訊作者（

Corresponding author）：龍安四，男，農(nóng)藝師，專業(yè)方向：園藝方面的試驗(yàn)和栽培技術(shù)研究，E-mail：longansi2005@163.com

收稿日期：2015-11-06；接受日期：2016-04-19

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻14121006-5-2、桂科合14123001-3、桂科攻13254002-2），國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系桂林綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（CARS-25-G-37），百色國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)建設(shè)示范項(xiàng)目（桂科能 1598022-1-1）