屈青松 彭萬(wàn)里 翟立明 劉 曉 林榕姍（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東農(nóng)業(yè)微生物菌種資源保藏中心，山東泰安 271018）

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馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及種群多樣性分析

屈青松 彭萬(wàn)里 翟立明 劉 曉 林榕姍*
（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東農(nóng)業(yè)微生物菌種資源保藏中心，山東泰安 271018）

摘 要：為了分離鑒定馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)相同種植地點(diǎn)的3個(gè)不同品種馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；從不同品種馬鈴薯中分離純化菌株，進(jìn)行基因序列分析和生理生化鑒定；取相同部位馬鈴薯組織進(jìn)行PCR-DGGE操作，并對(duì)DGGE圖譜上的條帶進(jìn)行差異性分析。最終分離得到9株內(nèi)生細(xì)菌，鑒定1-1、1-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis sp.），1-3為類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.），1-4為韓國(guó)假單胞菌（Pseudomonas koreensis sp.），1-5、1-6、2-3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens sp.），2-2為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.），3-6為副球菌（Paracoccus sp.）。DGGE圖譜表明不同品種的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌既有差異性又有相似性。最終結(jié)果表明3個(gè)品種馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌具有較豐富的種群多樣性，且差異性明顯，品種可能是影響馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；DGGE；內(nèi)生細(xì)菌；鑒定

屈青松，男，本科生，專業(yè)方向：生物科學(xué)，E-mail：quqingsong@ outlook.com

植物內(nèi)生菌是指在植物生活史的一定階段或全部階段存在于健康植物內(nèi)部組織的微生物類群，而被感染的寄主植物不會(huì)表現(xiàn)明顯感染癥狀（Herre et al.，2007；陳雪英 等，2008；李瑞 等，2009）。內(nèi)生菌要從嚴(yán)格消毒的組織和汁液中分離，或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增微生物DNA來(lái)證明其存在（Stone et al，2000；石晶盈 等，2006）。內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物體內(nèi)，分布于植物的葉、莖、花、果實(shí)、種子等器官、組織或細(xì)胞間隙之中。部分內(nèi)生細(xì)菌的次生代謝物中有時(shí)含有與宿主植物相同或相似的活性成分（Fisher et al.，1993；何勁 等，2006）。

由于內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期生長(zhǎng)于寄主內(nèi)部，并與之協(xié)同進(jìn)化，故具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抵抗病蟲害的能力，部分內(nèi)生細(xì)菌還有增加寄主對(duì)環(huán)境脅迫的抗性作用（Munif et al.，2001）。研究表明馬鈴薯的塊莖中具有豐富的內(nèi)生菌資源（文才藝 等，2004），因此研究馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的分類及其生物多樣性對(duì)后續(xù)的研究有很大的指導(dǎo)意義。

一些不可培養(yǎng)的微生物可通過(guò)擴(kuò)增出其DNA分子的手段證明其存在，變性梯度凝膠電泳（DGGE）就是一種常用的非培養(yǎng)手段研究微生物種群的方法，根據(jù)DNA在不同濃度變性劑中變性行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化的原理，將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開(kāi)，從而對(duì)微生物群落進(jìn)行分析（張一 等，2012）。根據(jù)DGGE圖譜中條帶的數(shù)量、亮度和位置可反映出樣品中微生物群落的部分信息，從而可用來(lái)對(duì)環(huán)境樣品中的微生物多樣性進(jìn)行定性、半定性分析（劉敏 等，2000）。

前人關(guān)于馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的篩選多是建立在富集、篩選的傳統(tǒng)方法上，這樣會(huì)忽略掉馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌中的大部分不可培養(yǎng)的菌株（Stenberg，1999），而利用分子生物學(xué)的方法可以克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，更快速、更準(zhǔn)確地檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌的種群數(shù)目。

本試驗(yàn)以泰山1號(hào)、中薯5號(hào)、荷蘭15號(hào)3個(gè)馬鈴薯品種為研究對(duì)象，從其塊莖中篩選內(nèi)生細(xì)菌，并鑒定其所屬種群；同時(shí)對(duì)這3個(gè)馬鈴薯品種的相同位置塊莖進(jìn)行了PCR-DGGE分析，分析塊莖中內(nèi)生細(xì)菌的生物多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種分別為：泰山1號(hào)（編號(hào)1，泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物研究所選育）、中薯5號(hào)（編號(hào)2，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育）、荷蘭15號(hào)（編號(hào)3，荷蘭費(fèi)烏瑞它系列品種），均由泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)作物研究所種植，于2015年1月采集，長(zhǎng)勢(shì)良好。所用引物參考林榕姍（2012）設(shè)計(jì)（表1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 擴(kuò)增引物

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2015年1～9月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山東農(nóng)業(yè)微生物菌種資源保藏中心進(jìn)行。

1.2.1 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 參照Ying等（2011）和Kumar等（2013）的方法，分別對(duì)3個(gè)品種的馬鈴薯進(jìn)行表面消毒，用干凈的打孔器對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行打孔，取距離馬鈴薯表皮0.5～1.0 cm處塊莖進(jìn)行研磨，將研磨液用無(wú)菌水稀釋至1×10-2、1×10-3、1×10-43個(gè)梯度，稀釋后的懸液分別取100 μL涂布于869培養(yǎng)基（蛋白胨10 g、酵母膏10 g、NaCl 5 g、葡萄糖1 g、CaCl20.261 g、瓊脂20 g、水1 L、pH 7.0。）、LB培養(yǎng)基，每個(gè)梯度懸液涂布3個(gè)平行，將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。挑取單菌落于培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，觀察純化后的菌落形態(tài)；并參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法進(jìn)行革蘭氏染色，選取不同種的菌落再次純化，并制作斜面及甘油管保藏。

1.2.2 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的鑒定 ① 16S rRNA 序列分析：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA）提取分離、純化后的菌株DNA。以所提取DNA為模板，使用P1/P2引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×buffer 5 μL，MgCl23 μL，dNTP 4 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶（TAKARA）0.2 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將擴(kuò)增得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA 6.06軟件進(jìn)行ClustalW分析，并以Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrat （1 000次重復(fù)）進(jìn)行檢驗(yàn)。② 菌株生理生化特征、菌落特征和細(xì)胞形態(tài)測(cè)定：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版分類系統(tǒng)及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法對(duì)所純化菌株的生理生化特征、形態(tài)特征等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 馬鈴薯塊莖總DNA的提取 取3個(gè)品種馬鈴薯相同位置塊莖，方法同1.2.1，利用E.Z.N.A.Soil DNA Kit和E.Z.A.N. Cycle-Pure Kit（OMEGA）提取并純化馬鈴薯塊莖總DNA。

1.2.4 PCR-DGGE分析 ① PCR擴(kuò)增及定量：以提取所得馬鈴薯塊莖總DNA 為模板，使用 GC-357F/517R 引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×buffer 5 μL，MgCl23 μL，dNTP 4 μL，DNA模板1 μL，引物各2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，24個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用E.Z.A.N.Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化，純化后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?DGGE電泳：嚴(yán)格按照Bio-Rad的DGGE說(shuō)明手冊(cè)步驟操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的篩選

從3個(gè)不同品種馬鈴薯塊莖中共分離得到18株內(nèi)生菌，其中6株菌篩選自泰山1號(hào)，分別編號(hào)1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6；6株菌篩選自中薯5號(hào)，分別編號(hào)2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6；6株菌篩選自荷蘭15號(hào)，分別編號(hào)3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6。經(jīng)形態(tài)學(xué)的觀察排除重復(fù)菌株和放線菌，共得到9株內(nèi)生細(xì)菌分別為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、2-2、2-3、3-6，通過(guò)革蘭氏染色結(jié)果可知（圖1），1-1、1-2、1-5、1-6、2-3為革蘭氏陽(yáng)性菌，1-3、1-4、2-2、3-6為革蘭氏陰性菌。

2.2 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌菌株的鑒定

2.2.1 16S rRNA序列分析結(jié)果 對(duì)9株馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌所提取的DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，各條帶均較清晰，且無(wú)特異性條帶，說(shuō)明這9株菌株的基因組DNA濃度較高，純度較好。以所提取的9株菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分別得到這9株菌株的16S rRNA片段，DNA長(zhǎng)度均在1 300～1 500 bp之間，將9株菌株的序列上傳至GenBank，獲得GenBank登錄號(hào)分別如下，1-1：KT781674、1-2：KT831431、1-3：KT831432、1-4：KU041145、1-5：KT831433、1-6：KT831434、2-2：KT831435、2-3：KT831436、3-6：KT831437。

圖1 9株馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的革蘭氏染色顯微圖（光學(xué)顯微鏡，100倍×10倍）彩色圖片參見(jiàn)《中國(guó)蔬菜》網(wǎng)站：www.cnveg.org。

對(duì)這9株菌株的16S rRNA 進(jìn)行Blast分析，均在GenBank中找到相似性在95%以上模式菌株，下載這些相似性較高的序列，用MEGA 6.06軟件進(jìn)行多重比對(duì)，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可知，1-1、1-2、1-5、1-6、2-3之間的相似性較高，且與Bacillus subtilis sp.和Bacillus amyloliquefaciens sp.親緣關(guān)系較近；1-3與Paenibacillus sp.親緣關(guān)系較近；1-4 與Pseudomonas koreensis sp.親緣關(guān)系較近；2-2 與Ochrobactrum ciceri sp.親緣關(guān)系較近；3-6與Paracoccus chinensis sp.親緣關(guān)系較近。

2.2.2 生理生化特征鑒定結(jié)果 根據(jù)生理生化鑒定與形態(tài)觀察（表2），結(jié)合16S rRNA 基因鑒定結(jié)果，鑒定1-1、1-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis sp.），1-3為類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.），1-4為韓國(guó)假單胞菌（Pseudomonas koreensis sp.），1-5、1-6、2-3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens sp.），2-2為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.），3-6為副球菌（Paracoccus sp.）

2.3 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的DGGE指紋圖譜分析結(jié)果

依據(jù)DGGE圖譜分析可知（圖3），馬鈴薯塊莖的內(nèi)生細(xì)菌種類較多，且不同馬鈴薯品種之間存在差異性。采用Quantity One 分析軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，并生成系統(tǒng)樹（UPGMA）發(fā)現(xiàn)，相同種植地區(qū)不同品種的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌在DGGE圖譜中電泳的條帶數(shù)目、亮度、遷移率均存在明顯的差異。由系統(tǒng)樹可知（圖4），相同地區(qū)不同品種的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)的差異性較大。

圖2 基于16S rDNA序列的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹括號(hào)中的代碼表示GenBank登錄號(hào)。

表2 9株內(nèi)生細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞特征

其中P1、P2的條帶數(shù)目相對(duì)較多，說(shuō)明泰山1號(hào)、中薯5號(hào)的內(nèi)生細(xì)菌的菌落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，P3條帶數(shù)目較少并且亮度較弱，說(shuō)明荷蘭15號(hào)的內(nèi)生細(xì)菌的菌落結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。除P1、P2、P3中的共有條帶外，p1-6、p1-10為P1特有條帶；p2-1為P2特有條帶。這些條帶的分布特征也可以說(shuō)明相同種植地區(qū)不同品種的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌有較大的群落差異。

圖3 3個(gè)馬鈴薯品種內(nèi)生細(xì)菌的DGGE分析P1、P2、P3分別代表泰山1號(hào)、中薯5號(hào)、荷蘭15號(hào)馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的DGGE條帶。

3 結(jié)論與討論

3.1 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌細(xì)菌株

利用生理生化鑒定可以將微生物的不同類群分開(kāi)。將16S rDNA基因序列同源性分析與生理生化試驗(yàn)相結(jié)合是一種能夠比較快速精確分離細(xì)菌的方法。本試驗(yàn)中系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析有較好的相關(guān)性。

16S rRNA 基因序列分析表明，菌株1-1、1-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis sp.），1-5、1-6、2-3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens sp.），這5株內(nèi)生細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬。因?yàn)檠挎邨U菌在分離中的內(nèi)生細(xì)菌有較大比重，所以初步將芽孢桿菌確定為3種馬鈴薯的優(yōu)勢(shì)菌株。此外1-3為類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）、1-4為韓國(guó)假單胞菌（Pseudomonas koreensis sp.）、3-6為副球菌（Paracoccus sp.）這3類菌株均為植物內(nèi)生菌的常見(jiàn)菌株。2-2為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.），雖然關(guān)于蒼白桿菌的植物內(nèi)生菌相關(guān)報(bào)道較少，但也有人在植物根部分離到蒼白桿菌（劉杰 等，2011；劉芳 等，2014）。

芽孢桿菌是一種有較高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的細(xì)菌，具有繁殖速度快、生命力強(qiáng)、體積大等特征（Stenberg，1999）。特別是在抑菌方面有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，能夠較好地抑制有害菌、病原菌等有害微生物的的生長(zhǎng)繁殖，在生防菌肥的工業(yè)化生產(chǎn)中已經(jīng)被投入使用。芽孢桿菌還能產(chǎn)生豐富的代謝生成物，從而被農(nóng)作物利用促進(jìn)作物生長(zhǎng)（張霞 等，2007）。本試驗(yàn)所篩選到的內(nèi)生菌種類在應(yīng)用上有較高的價(jià)值，后續(xù)的研究仍待開(kāi)展。

3.2 DGGE

關(guān)于內(nèi)生菌的分離鑒定方法一般都是依賴于傳統(tǒng)的平板分離，這種方法簡(jiǎn)單易行，較為普遍，但其分離得到的菌株都為可培養(yǎng)的細(xì)菌，而無(wú)法分離不可培養(yǎng)的內(nèi)生菌。近年來(lái)關(guān)于利用非培養(yǎng)方法研究微生物種群變得普遍起來(lái)。而DGGE又是一種常用的非培養(yǎng)手段研究微生物種群的方法，本試驗(yàn)根據(jù)電泳所得DGGE圖譜的條帶數(shù)量和亮度對(duì)馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究。但是DGGE方法還是有一定的局限性，包括DNA模板長(zhǎng)度過(guò)短、PCR擴(kuò)增的偏向性、無(wú)法獲得菌株等制約因素的存在。

本試驗(yàn)對(duì)相同地點(diǎn)種植的不同品種馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果表明相同地區(qū)種植的不同品種的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)差異性較大（圖4）。由于這3種不同品種的馬鈴薯生長(zhǎng)于相同的地點(diǎn)，所以也受到相似的外部環(huán)境因素的影響，在排除外部因素的影響后，推測(cè)造成這種內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因是馬鈴薯品種這一內(nèi)因的差異。不同品種馬鈴薯的生長(zhǎng)代謝不同造就了馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌所生長(zhǎng)的外環(huán)境的差異，這是造成內(nèi)生菌群落差異的根本原因。

而這些不同品種馬鈴薯的內(nèi)生細(xì)菌中還有一些共有菌株，這說(shuō)明不同品種馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌除了差異性之外還有共有性，一些生態(tài)幅較廣的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)不同環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，從而造成了這種結(jié)果。

此外，在DGGE圖譜中條帶p1-11、p2-10、p3-8條為P1、P2、P3的共有條帶，相比于其他條帶也更亮，而本試驗(yàn)所篩選出的內(nèi)生細(xì)菌中芽孢桿菌的數(shù)量占絕大部分，故推測(cè)該共有條帶所對(duì)應(yīng)的內(nèi)生細(xì)菌為本試驗(yàn)所篩選出的芽孢桿菌，是本試驗(yàn)所用樣品內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌株，但也不排除該條帶對(duì)應(yīng)不可培養(yǎng)內(nèi)生菌的可能性。

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Isolation and Identification of Endophytic Bacteria and Analysis of Population Diversity in Different Potato Varieties

QU Qing-song，PENG Wan-li，ZHAI Li-ming，LIU Xiao，LIN Rong-shan*
（College of Life Science，Shandong Agricultural University，Shandong Agricultural Resource Collection of Microorganisms，Tai'an 271018，Shandong，China）

Abstract：In order to isolate and identify endophytic bacteria in potato and analyze the community structure of 3 different potato varieties，this experiment isolated and purified strains from different potato varieties，and carried out gene sequence analysis and physiological and biochemical identification.The PCR-DGGE operation was performed on the same site in potato，and analyzed the bands on DGGE.Nine strains of endophytic bacteria were isolated，identified 1-1，1-2 as Bacillus subtilis sp.，1-3 as Paenibacillus sp.，1-4 as Pseudomonas koreensis sp.，1-5、1-6、2-3 as Bacillus amyloliquefaciens sp.，2-2 as Ochrobactrum sp.，3-6 as Paracoccus sp.The DGGE bands indicated that there were both differences and similarities in different potato varieties.The results showed that 3 potato varieties had rich population diversity，and their differences were also obvious.The species may be an important factor influencing the structure of endophytic bacteria community.

Key word：DGGE；Potato；Endophytic bacteria；Identification

*通訊作者（

Corresponding author）：林榕姍，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：資源與環(huán)境微生物，E-mail：lrs2680@163.com

收稿日期：2016-01-18；接受日期：2016-04-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410434084）