王　爽，鄧向東，閆國(guó)棟，馮彩峰，代鵬飛，高彤彤,林居純

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 611130)

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食品動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性分析及16S rRNA甲基化酶基因的檢測(cè)

王爽，鄧向東，閆國(guó)棟，馮彩峰，代鵬飛，高彤彤,林居純

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 611130)

[摘要]【目的】 對(duì)四川地區(qū)臨床分離的437株健康動(dòng)物源及82株患病動(dòng)物源大腸桿菌(E.coli)的耐藥性及其機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)?！痉椒ā?用3種氨基糖苷類藥物和11種非氨基糖苷類藥物對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(K-B紙片法)。選取至少耐1種氨基糖苷類藥的大腸桿菌作為供試菌，通過(guò)PCR檢測(cè)其16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和npmA；對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合試驗(yàn)；并用K-B紙片法分析臨床菌和接合子對(duì)抗生素的敏感性?！窘Y(jié)果】 437株健康動(dòng)物源和82株患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。健康動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、氯霉素、磺胺甲惡唑的耐藥率較高，分別為69.79%，50.8%和68.72%，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星比較敏感，敏感率分別為75.97%，67.73%和97.02%；其中有134株分離菌至少對(duì)1種氨基糖苷類藥物表現(xiàn)出耐藥性?；疾?dòng)物源大腸桿菌除對(duì)美羅培蘭耐藥率較低(為3.66%)外，對(duì)其余藥物的耐藥率在32.93%～100%，且都對(duì)至少1種氨基糖苷類藥物表現(xiàn)出耐藥性。多重耐藥分析表明，健康動(dòng)物源大腸桿菌主要分布于0～4耐，而患病動(dòng)物源大腸桿菌至少耐7種抗菌藥物，主要分布于10～14耐。在134株耐氨基糖苷類抗生素大腸桿菌中，檢測(cè)到5株含rmtB基因，檢測(cè)率為3.73%，未檢測(cè)到armA、rmtA、rmtC、rmtD、rmtE和npmA基因。在82株患病動(dòng)物源大腸桿菌中，檢測(cè)到1株含armA基因，10株含rmtB基因，檢出率分別為1.22%和12.2%，未檢測(cè)到rmtA、rmtC、rmtD、rmtE及npmA基因；接合試驗(yàn)的耐藥質(zhì)粒傳遞率為100%，受體菌接合頻率在(9.2×10-9)～(4.8×10-6)?！窘Y(jié)論】 四川地區(qū)健康動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)抗生素呈中低水平耐藥，多重耐藥以4耐及以下為主，占63.84%，主要由rmtB基因引起；而患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)抗生素則呈高水平耐藥，89.02%為10～14耐，主要由rmtB和armA基因引起。

[關(guān)鍵詞]大腸桿菌；16S rRNA甲基化酶；耐藥性

氨基糖苷類抗生素由于其高效、廣譜的特性以及具有濃度依賴性快速殺菌作用，臨床上一直用于治療革蘭陰性菌所致的嚴(yán)重感染，但隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用，大腸桿菌等革蘭氏陰性菌對(duì)其的耐藥性也迅速增強(qiáng)[1]。自2003年以來(lái)，16S rRNA甲基化酶在臨床菌中的發(fā)現(xiàn)，使革蘭氏陰性桿菌的核糖體16S rRNA甲基化酶逐漸成為氨基糖苷類抗生素耐藥新機(jī)制的研究熱點(diǎn)[2]。該類酶主要通過(guò)甲基化16S核糖體亞單位A位點(diǎn)的某個(gè)或某幾個(gè)堿基，使氨基糖苷類藥物不能與其作用靶點(diǎn)相結(jié)合，從而保護(hù)細(xì)菌的16S rRNA，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物產(chǎn)生高度耐藥性[3]。編碼16S rRNA甲基化酶的基因有rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA等[4-8]，其與質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列共同區(qū)等可移動(dòng)遺傳因子密切相關(guān)，可能通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化等質(zhì)粒轉(zhuǎn)移方式使該類酶的耐藥決定因子在不同地域間及遺傳上不相關(guān)的菌株之間進(jìn)行擴(kuò)散，從而在更廣泛的地區(qū)導(dǎo)致更多的臨床菌對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生高度耐藥性[3,6,9-11]。本研究以四川地區(qū)分離的437株健康動(dòng)物源和82株患病動(dòng)物源大腸桿菌作為受試菌株，測(cè)定其對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性及耐藥菌株的耐藥決定因子轉(zhuǎn)移情況，以闡明健康動(dòng)物源大腸桿菌和患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性差異，以及其16S rRNA甲基化酶和基因型的分布、轉(zhuǎn)移情況，為本地區(qū)大腸桿菌病的流行病學(xué)及臨床用藥提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株2012～2013年，從四川成都、雅安、蒲江、資陽(yáng)、滎經(jīng)、天全等不同養(yǎng)殖場(chǎng)臨床分離的437株健康動(dòng)物源和82株患病食品動(dòng)物源大腸桿菌，經(jīng)Vitek-60 微生物鑒定系統(tǒng)鑒定確認(rèn)為大腸桿菌，所涉及食品動(dòng)物源包括豬、牛、雞和鴨；大腸桿菌ATCC25922(作為藥敏質(zhì)控菌)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供；大腸桿菌J53AzR(對(duì)疊氮鈉耐藥，作為接合試驗(yàn)的受體菌)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2抗菌藥敏片氨基糖苷類藥物：慶大霉素(10 μg/片)，卡那霉素(30 μg/片)，阿米卡星(30 μg/片)。非氨基糖苷類藥物：阿莫西林/棒酸(阿莫西林20 μg/片，棒酸10 μg/片)，氯霉素(30 μg/片)，磺胺甲惡唑(30 μg/片)，美羅培蘭(10 μg/片)，氨芐西林(10 μg/片)，頭孢唑林(30 μg/片)，頭孢噻肟(30 μg/片)，頭孢曲松 (30 μg/片)，多西環(huán)素 (30 μg/片)，萘啶酸(30 μg/片)，環(huán)丙沙星(5 μg/片)，上述材料均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基和試劑麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；MH肉湯、MH瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖購(gòu)自基因公司(西班牙生產(chǎn)，上海Yito責(zé)任有限公司分裝)；冰乙酸、EDTA、Tris堿，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；DNA Marker DL2000、 2×TaqPCR MasterMix、goldView,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司。

1.1.4主要儀器微量可調(diào)加樣器(德國(guó)Eppendorf公司)，自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠，型號(hào)SYQ-LDZX-40BZ)，電熱恒溫干燥箱(重慶華茂儀器有限公司，型號(hào)DGF25012C)。PCR儀和電泳成套設(shè)備(北京市六一儀器廠)，WaterPro Plus超純水儀(LABCONCO公司)，GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)，高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司，型號(hào)2K15)。

1.1.5引物16S rRNA甲基化酶基因引物序列見表1，均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司(北京)合成。

表 1　16S rRNA甲基化酶基因的PCR引物序列

1.2臨床菌的藥物敏感性測(cè)定

以大腸桿菌ATCC25922作為藥敏質(zhì)控菌，采用美國(guó)臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的K-B紙片法測(cè)定臨床分離菌對(duì)氨基糖苷類代表藥物慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星及其他11種非氨基糖苷類藥物的敏感性。

1.3氨基糖苷類耐藥基因的PCR擴(kuò)增

采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA7種16S rRNA甲基化酶基因，以煮沸法提取的大腸桿菌全基因組DNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中模板1 μL，F(xiàn)引物0.5 μL，R引物0.5 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，加無(wú)菌雙蒸水至25 μL。rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和nPmA基因擴(kuò)增的熱循環(huán)參數(shù)為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。armA基因擴(kuò)增的熱循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性5 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)

取5 μL PCR產(chǎn)物在含有GoldView的1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，通過(guò)GelDoc2000凝膠成相系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。將陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Blast進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5接合試驗(yàn)

以擴(kuò)增出armA和rmtB基因的動(dòng)物源大腸桿菌為供體菌，以對(duì)疊氮鈉耐藥的大腸桿菌J53AzR為受體菌進(jìn)行試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供體菌、受體菌菌液各500 μL，接種于同一新鮮的4 mL LB肉湯中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)7～8 h，讓其接合。取上述混合菌液100 μL于胰蛋白胨大豆瓊脂平板上(含64 μg/mL阿米卡星和200 μg/mL疊氮鈉)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，在上述含藥平板上同時(shí)設(shè)置供體菌、受體菌對(duì)照；挑取在含藥平板上生長(zhǎng)的菌落，轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的含藥胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，可生長(zhǎng)的菌落即為疑似接合子。

1.6接合子的PCR鑒定

隨機(jī)挑取每個(gè)選擇性平板上的3～5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，試驗(yàn)方法同1.2節(jié)。

1.7接合頻率的計(jì)算

計(jì)數(shù)接合子、供體菌和受體菌菌落數(shù)，分別計(jì)算其平均值和供、受體菌的接合頻率，F(xiàn)c=T/A×100%，其中，F(xiàn)c為接合頻率，T為接合子平均菌落數(shù)；A為受體菌或供體菌平均菌落數(shù)。

1.8接合子和J53AzR的藥物敏感性測(cè)定

對(duì)接合子和J53AzR的藥物敏感性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法同1.2節(jié)。

2結(jié)果和分析

2.1大腸桿菌的藥物敏感性結(jié)果

供試大腸桿菌的藥物敏感性測(cè)定結(jié)果見表2。

表 2　437株健康動(dòng)物源性和82株患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)14種藥物的耐藥情況

注：“S”.敏感率；“I”.中介率；“R”.耐藥率。

Note：“S”.Susceptible ratio;“I”.Intermediate ratio;“R”.Resistant ratio.

從表2可看出，健康動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、氯霉素、磺胺甲惡唑耐藥性較高，耐藥率分別是69.79%，50.8%和68.72%，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星3種氨基糖苷類藥物比較敏感，敏感率分別為75.97%，67.73%和97.02%；有134株菌至少對(duì)1種氨基糖苷類藥物有耐藥性?；疾?dòng)物源大腸桿對(duì)萘啶酸、磺胺甲惡唑、卡那霉素耐藥率高達(dá)100%，對(duì)美羅培蘭耐藥率為3.66%，對(duì)其余藥物的耐藥率在32.93%～97.80%。結(jié)果表明，患病動(dòng)物源大腸桿菌較健康動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性稍嚴(yán)重，但總的來(lái)說(shuō)，大腸桿菌無(wú)論是健康動(dòng)物源還是患病動(dòng)物源其耐藥情況都不容樂(lè)觀。多重耐藥結(jié)果(表3)表明，健康動(dòng)物源大腸桿菌0耐至14耐均有分布，但以0～4耐為主，占63.84%；而患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物的多重耐藥性更為嚴(yán)重，至少耐7種抗菌藥物，89.02%為10～14耐。

表 3　437株健康動(dòng)物源和82株患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物的多重耐藥率

2.216S rRNA甲基化酶基因的檢測(cè)

采用PCR對(duì)7種16S rRNA甲基化酶基因進(jìn)行檢測(cè)，在437株健康動(dòng)物源大腸桿菌中，檢測(cè)到5株含rmtB基因，檢出率為1.14%，未檢測(cè)到armA、rmtA、rmtC、rmtD、rmtE和npmA基因。在82株患病動(dòng)物源大腸桿菌中，檢測(cè)到1株含armA基因和10株含rmtB基因，檢出率分別為1.22%和12.2%，未檢測(cè)到rmtA、rmtC、rmtD、rmtE及npmA基因。

2.3接合子的PCR鑒定結(jié)果

取疑似接合子DNA，用armA和rmtB特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，得到與目的片段長(zhǎng)度相符的條帶(圖1)。

圖 1　大腸桿菌rmtB和armA基因接合子PCR電泳檢測(cè)

2.4接合子頻率的測(cè)定

本試驗(yàn)中所有臨床陽(yáng)性菌都能通過(guò)接合方式將16S rRNA甲基化酶基因傳遞給J53AzR，傳遞率為100%。接合頻率計(jì)算結(jié)果顯示，armA陽(yáng)性菌的供體菌接合頻率為3.6×10-9，rmtB陽(yáng)性菌的供體菌接合頻率在(5.7×10-11)～(3.2×10-6)；armA陽(yáng)性菌的受體菌接合頻率為6.7×10-7，rmtB陽(yáng)性菌的受體菌接合頻率為(9.2×10-9)～(4.8×10-6)。

2.5接合子及原菌株對(duì)供測(cè)氨基糖苷類藥物的敏感性比較

接合子對(duì)3種氨基糖苷類代表藥物的敏感性略高于臨床陽(yáng)性菌，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于J53AzR，說(shuō)明16S rRNA甲基化酶基因在轉(zhuǎn)移到受體菌后使陰性受體菌對(duì)氨基糖苷類藥物及其他11種非氨基糖苷類藥物產(chǎn)生了較高的耐藥性。

3討論

四川地區(qū)臨床分離的大腸桿菌無(wú)論健康動(dòng)物源還是患病動(dòng)物源都有很高的耐藥性。437株健康動(dòng)物源大腸桿菌除對(duì)美羅培蘭(0.46%)和阿米卡星(2.98%)耐藥率較低外，對(duì)其他大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率在10.76%～69.79%。82株患病動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)萘啶酸、磺胺甲惡唑、卡那霉素耐藥率高達(dá)100%，對(duì)美羅培蘭的耐藥率為3.66%，對(duì)其余藥物的耐藥率在32.93%～97.8%，低于孫慧等[16]的相關(guān)報(bào)道，這可能與大腸桿菌的耐藥性存在地域差異性及菌種差異性有關(guān)。健康食品動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類3種代表藥物的敏感率整體高于其他的非氨基糖苷類藥物，而對(duì)患病動(dòng)物源大腸桿菌，氨基糖苷類藥物的優(yōu)勢(shì)則不明顯，存在很高的耐藥性，這可能是在頻繁使用此類藥物過(guò)程中，大腸桿菌對(duì)其的耐藥性有所增強(qiáng)。有關(guān)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制主要是細(xì)菌可以產(chǎn)生水解氨基糖苷類抗生素的酶，但這些酶并不能水解所有的氨基糖苷類抗生素，比如阿米卡星[17]。所以在本次研究中，大腸桿菌對(duì)阿米卡星的耐藥率較低，但仍有菌株對(duì)阿米卡星耐藥，尤其是患病動(dòng)物源大腸桿菌。由此可見，產(chǎn)生氨基糖苷類抗生素酶并不是細(xì)菌耐藥的唯一機(jī)制。目前研究認(rèn)為，由質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶是氨基糖苷類抗生素耐藥的新的機(jī)制，其能使藥物作用靶位16S rRNA G1405上的N-7位鳥苷變成甲基鳥苷或使A1408上的腺嘌呤N-1位甲基化，使細(xì)菌的30S核糖體16S rRNA與氨基糖苷類抗生素的親和力下降，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥性[17]。本研究從437株健康動(dòng)物源大腸桿菌中檢測(cè)出5株攜帶有rmtB基因，占1.14%；從82株患病動(dòng)物源大腸桿菌中檢測(cè)到1株含armA基因(占1.22%)和10株含rmtB基因(占12.2%)，低于陳玉霞等[18]的研究結(jié)果；檢測(cè)到armA基因的菌株也能檢測(cè)到rmtB基因，但未檢測(cè)到rmtA、rmtC、rmtD、rmtE及npmA基因，這與陳玉霞等[18]的研究結(jié)果相符。在四川地區(qū)，健康動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)阿米卡星的耐藥率為2.98%，患病動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥率為32.93%；患病動(dòng)物源大腸桿菌16S rRNA甲基化酶基因的檢測(cè)率遠(yuǎn)高于健康動(dòng)物源大腸桿菌，且檢測(cè)出16S rRNA甲基化酶基因的陽(yáng)性菌株都對(duì)阿米卡星耐藥，說(shuō)明16S rRNA甲基化酶可能是導(dǎo)致細(xì)菌耐阿米卡星的主要機(jī)制之一。

存在16S rRNA甲基化酶基因的陽(yáng)性菌株對(duì)測(cè)試藥物都表現(xiàn)出耐藥性。對(duì)阿米卡星耐藥的菌株對(duì)其他2種氨基糖苷類藥物也都表現(xiàn)出耐藥性，同時(shí)對(duì)其他非氨基糖苷類藥物也表現(xiàn)出較高的耐藥性，說(shuō)明16S rRNA甲基化酶基因不但對(duì)氨基糖苷類抗生素具有耐藥性，而且對(duì)非氨基糖苷類藥物也具有耐藥性，其對(duì)社會(huì)的危害性很嚴(yán)重。本試驗(yàn)中，所有臨床陽(yáng)性菌都能通過(guò)接合方式將16S rRNA甲基化酶基因傳遞給J53AzR，傳遞率為100%。在丁曉麗等[3]的報(bào)道中，armA基因不能通過(guò)質(zhì)粒接合傳遞給受體菌，這與本次研究結(jié)果不符，其原因可能與接合試驗(yàn)菌株數(shù)多少或接合介質(zhì)及接合時(shí)間等不同有關(guān)，但本試驗(yàn)接合頻率與丁曉麗的報(bào)道相符。接合子對(duì)氨基糖苷類抗生素的敏感性略高于臨床陽(yáng)性菌，但遠(yuǎn)低于陰性菌，且16S rRNA甲基化酶基因可以以水平的方式進(jìn)行傳播的特性應(yīng)引起社會(huì)的關(guān)注。

4結(jié)論

四川地區(qū)健康動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)抗生素呈低水平耐藥，多重耐藥性以4耐以下為主，占63.84%，主要由rmtB基因引起；而患病動(dòng)物源大腸桿菌則呈高水平耐藥，89.02%為10～14耐，主要由rmtB基因和armA基因引起。

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Analysis on resistance ofEscherichiacolifrom food of animal origin and detection of its 16S rRNA methylation enzymes

WANG Shuang,DENG Xiang-dong,YAN Guo-dong,FENG Cai-feng,DAI Peng-fei,GAO Tong-tong,LIN Ju-chun

(CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

Abstract:【Objective】 The resistance of 437 E.coli strains isolated from healthy animals and 82 E.coli strains separated from sick animals in Sichuan and the mechanism were investigated to provide basis for its clinical rational use.【Method】 Sensitivity test was conducted to examine the separated E.coli strains with three Aminoglycosides and 11 non-Aminoglycosides.The strains with resistant to at least one Aminoglycoside drug were selected and their 16S rRNA methylase genes (armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,rmtE and npmA) were detected by PCR.Plasmid conjugation experiment was also carried out to the positive strains and the drug susceptibility of clinical isolated bacteria and zygote to antimicrobial agents was executed by the Kirby-Bauer method.【Result】 A total of 437 strains of healthy animal origin and 82 strains of sicken animal origin showed resistance to 14 antibacterial drugs.The resistant rates of E.coli strains of healthy animal origin against ampicillin,chloramphenicol and sulfamethoxazole were higher than other tested drugs with the rates of 69.79%,50.8% and 68.72%,respectively.They were more sensitive to gentamycin,kanamycin and amikacin with sensitive rates of 75.97%,67.73% and 97.02%,respectively.There were 134 strains with resistance to at least one aminoglycoside drug.The resistant rates of sick animal derived E.coli to 14 antibacterial drugs were 32.93% to 100% except for meropenem (3.66%).They were all resistant to at least one aminoglycoside drug.Strains separated from health animal were resistant to 0 to 4 drugs at the same time but those from sick animal were resistant to 10 to 14 drugs.A total of 5 E.coli strains containing rmtB gene were detected among the 134 strains with detection rate of 3.73%,while armA, rmtA,rmtC,rmtD,rmtE,and npmA gene were not detected.One strain was detected to contain armA gene and 10 strains were detected to contain rmtB gene among the 82 strains from diseased animal,with detection rates of 1.22% and 12.2%,respectively.But rmtA,rmtC,rmtD,rmtE,and npmA gene were not detected.Trans-conjugation test showed that resistant plasmids pass rate was 100%,and conjugation frequency of each receptor cell was (9.2×10-9)-(4.8×10-6).【Conclusion】 In Sichuan,E.coli strains from healthy animals had low-level resistance and 63.84% were resistant to 4 or less antibiotics,which was mainly caused by rmtB.The E.coli separated from sick animals showed high-level resistance to antibiotics with 89.02% were resistant to 10-14 drugs,which was caused by rmtB and armA genes.

Key words:Escherichia coli;16S rRNA methylase;resistance

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.002

[收稿日期]2014-08-06

[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAK01B02)

[作者簡(jiǎn)介]王爽(1990-)，女，河南南陽(yáng)人，在讀碩士，主要從事食品動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性及其耐藥機(jī)制研究。E-mail：domina77@126.com[通信作者]林居純(1968-)，女，四川隆昌人，教授，博士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)及毒理學(xué)研究。E-mail：juchunlin@126.com

[中圖分類號(hào)]S859.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)03-0011-06