朱紅艷，邵詠妮，蔣璐璐，郭安鵲，潘 健，何 勇*

1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058 2. 浙江經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018 3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100

浸入式可見/近紅外光譜技術(shù)的藻種鑒別研究

朱紅艷1，邵詠妮1，蔣璐璐2，郭安鵲3，潘 健1，何 勇1*

1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058 2. 浙江經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018 3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100

對藻類的識別分類及其生化分析已成為海洋生物學(xué)的研究熱點之一。以普通小球藻、蛋白核小球藻、微綠球藻、萊茵衣藻為樣品，通過便攜式USB4000微型光纖光譜儀、Y形光纖和探針，鹵素光源構(gòu)建的光譜采集系統(tǒng)對不同濃度梯度的120個微藻樣本進(jìn)行浸入式可見/近紅外透射光譜的原位采集，比較去基線、卷積平滑等光譜預(yù)處理方法的效果，并基于連續(xù)投影算法(SPA)篩選特征波長，通過偏最小二乘法(PLS)、最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)和極限學(xué)習(xí)機(jī)(ELM)進(jìn)行建模，探討采用透射光譜原位快速鑒別四種不同藻種的可行性。結(jié)果表明：卷積平滑的處理效果較為理想，有效波長可用于代替原始光譜建立微藻種類判別分析模型。SPA-LV-SVM和SPA-ELM的預(yù)測效果顯著高于SPA-PLS，三者的平均預(yù)測正確率分別是80%，85%，65%。浸入式可見/近紅外光譜技術(shù)和便攜式光纖探針結(jié)合的藻種鑒別方法，有效實現(xiàn)了對四種微藻的鑒別，為藻種鑒別和藻種分類研究領(lǐng)域提供了一種新思路。

微藻；可見/近紅外透射光譜；藻種鑒別；極限學(xué)習(xí)機(jī)

引 言

微藻(microalgae)是一類可以將二氧化碳轉(zhuǎn)化為潛在的生物燃料、食品、飼料和高價值的生物活性分子并能進(jìn)行光合作用的真核微生物[1]。微藻具有生態(tài)和生物學(xué)價值，是一種重要的生物質(zhì)資源。微藻成為國際上很多研究項目的焦點[2-4]，這種興趣來自于微藻中含有豐富的營養(yǎng)及生理活性成分，具有預(yù)防心血管、癌癥等疾病的功效。目前，對藻類的識別分類及其生化分析已經(jīng)成為海洋生物學(xué)的研究熱點之一。

傳統(tǒng)的微藻鑒定方法主要依賴于顯微鏡對微藻形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察和一些藻體所固有的生理生化特性。以形態(tài)學(xué)的細(xì)微特征對藻進(jìn)行鑒定存在許多困難和爭議，于是人們開始把目光投向各類分子生物學(xué)技術(shù)。但通過序列分析獲得的結(jié)果和根據(jù)形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果有時存在一些偏差，而且物種遺傳多樣性對特異性探針的設(shè)計也產(chǎn)生了不利影響[5]。通過具有特征性的生理生化物質(zhì)的測定來鑒定微藻，是最近發(fā)展起來的一門科學(xué)，稱為化學(xué)分類法(chemotaxonomy)[6]。目前能夠用于化學(xué)分類的海洋浮游藻類“特征性化學(xué)成分”有脂肪酸、碳水化合物(糖類)、色素和氨基酸等。

可見/近紅外光譜可充分利用全譜段或多波長下的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性或定量分析。國內(nèi)外利用此技術(shù)進(jìn)行蘋果[7]、茶葉[8]、酸奶等品種的鑒別。而對藻種鑒別的研究還很少；據(jù)于該方法的快速、簡單和活體生物無損檢測的特點，探討通過便攜式USB4000微型光纖光譜儀、Y形光纖和探針，鹵素光源構(gòu)建的光譜采集系統(tǒng)對不同濃度梯度的微藻樣本進(jìn)行浸入式可見/近紅外透射光譜的原位采集，通過不同算法的建模，研究浸入式可見/近紅外光譜在藻種分類領(lǐng)域應(yīng)用的可行性，為以后更深入的研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 微藻及其培養(yǎng)

選用普通小球藻(Chlorellavulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)(購于中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫)和微綠球藻(Nannochloropsisoculata)(購于中國科學(xué)院海洋研究所)作為研究對象。四種微藻備受研究者青睞，其中小球藻是一類單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門、小球藻屬，廣泛分布于自然界，淡水水域中種類最多[9]。已有研究表明，小球藻含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產(chǎn)物[10]。萊茵衣藻屬于綠藻門、衣藻屬，是一類單細(xì)胞真核鞭毛藻類，廣布于水溝、洼地和含微量有機(jī)質(zhì)的小型水體中，早春晚秋最為繁盛。一些含蛋白質(zhì)較豐富的種類，可培養(yǎng)作飼料或食用[11]。微綠球藻屬于綠藻門、膠球藻科，具有易培養(yǎng)、繁殖迅速、營養(yǎng)豐富的特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較為廣泛。微綠球藻中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和多種微量元素[12]。

四種微藻對生物柴油的生產(chǎn)都是很好的選擇[2]，作為高產(chǎn)油微藻在實驗室條件下易培養(yǎng)，生長速度快，因形態(tài)和大小相似在顯微鏡下無法辨別開。微藻所用培養(yǎng)基根據(jù)藻種庫提供的標(biāo)準(zhǔn)來配制，普通小球藻、蛋白核小球藻和萊茵衣藻均為SE培養(yǎng)基培養(yǎng)，微綠球藻為f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)。將四種藻在相同的溫度、光照(25 ℃，2500 Lux-3500 Lux，周期為12 h晝12 h夜)下培養(yǎng)。

1.2 樣本制備

分別取培養(yǎng)的四種藻液10 mL于15 mL的離心管中，以相對濃度梯度為0.8的n次方來稀釋藻液，共10個濃度梯度。所含藻液分別是：10，10×0.8，10×0.82，10×0.83，10×0.84，10×0.85，10×0.86，10×0.87，10×0.88和10×0.89mL，即10，8.0，6.4，5.1，4.1，3.3，2.6，2.1，1.7和1.3 mL。之后，用蒸餾水稀釋，分別獲得10 mL樣品在10個濃度水平。每種微藻重新取樣共測三次，可采集到120個樣本(每種30個)的可見/近紅外透射光譜，隨機(jī)獲取80個樣本用作建模，其余40個樣本用于預(yù)測。

1.3 可見/近紅外光譜的采集

構(gòu)建的光譜采集系統(tǒng)如圖1所示，它由一個便攜式USB4000微型光纖光譜儀、用于傳輸和接收的Y形光纖、鹵素光源和一臺電腦組成。其中光纖一端連接有光纖探針。研究提出的浸入式光譜采集方法是指通過把光纖探針浸泡于藻液中固定的深度來相繼得到光譜數(shù)據(jù)。在環(huán)境溫度為23～26 ℃范圍內(nèi)采集光譜，光譜范圍是346～1 038 nm，每隔0.3 nm采集一次。平均測量次數(shù)為5次，積分時間為13 ms。采集光譜數(shù)據(jù)前應(yīng)通過蒸餾水來校準(zhǔn)，所得數(shù)據(jù)由電腦中的光譜采集軟件快速處理并保存。所采用的化學(xué)計量學(xué)算法和數(shù)字圖像處理技術(shù)主要由Unscrambler○R10.1(CAMO AS, Oslo, Norway)，MATLAB7.11(The Mathworks, Natick, USA)，OriginPro 8.5(OriginLab, Northampton, USA)軟件實現(xiàn)。

Fig.1 The spectral acquisition system for identification of microalgae species

1.4 化學(xué)計量學(xué)方法

通常完整的光譜可能包含數(shù)百個變量，因此減少不提供信息的變量是一個重要的方法和策略來獲得更好的預(yù)測和簡單而有效的模型。使用最佳波長比全波長在多變量分析中可能更有效。連續(xù)投影算法(SPA)是新發(fā)展的包含三個階段的一種算法[13]。用SPA后，信息變量擁有最少共線性，減少了數(shù)據(jù)冗余度。偏最小二乘法(PLS)是最常用的一種光譜建模算法，PLS能夠在矩陣分解過程中考慮光譜和物質(zhì)目標(biāo)特性，因此可以更好地選取光譜中有利于建模的信息，減少干擾組分因素。極限學(xué)習(xí)機(jī)(ELM)是黃廣斌教授于2004年針對SLFNs(即含單個隱藏層的前饋型神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))的監(jiān)督型學(xué)習(xí)算法提出來的一種簡單實用的新型算法[14]。它能夠有效克服傳統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練參數(shù)選取復(fù)雜、易陷入局部最優(yōu)等問題，并以其學(xué)習(xí)速度快、泛化能力強(qiáng)等優(yōu)點被廣泛關(guān)注[15]。Suykens提出的最小二乘支持向量機(jī)(LS-SVM)是對經(jīng)典支持向量機(jī)(SVM)的一種改進(jìn)。LS-SVM只需要對一個等式方程組求解對偶空間中的二次規(guī)劃問題，從而降低了計算的復(fù)雜性，并且加快了計算的速度[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同藻種的可見/近紅外光譜特征

四種微藻的可見/近紅外光譜圖平均曲線見圖2。圖中橫坐標(biāo)為光譜波長，采用藻種光譜波長范圍是346～1 038 nm，縱坐標(biāo)為透射率。由圖可知，4條曲線沒有明顯區(qū)別，且峰值均出現(xiàn)在450，650和690 nm附近，采用原始光譜很難將各個微藻種類分開。為消除光譜數(shù)據(jù)在采集時首端與末端產(chǎn)生的部分噪音，對圖2截取430～930 nm波段的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。參與鑒別的光譜數(shù)據(jù)陣從120×3 649減少到120×2 582。

Fig.2 Visible/Near infrared transmission spectroscopy of four different microalgae species

2.2 光譜預(yù)處理方法的比較

Table 1 Prediction results of identification of microalgae species with pretreatment methods

2.3 SPA選取有效波長

用SPA對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，被SPA選擇的特征變量會根據(jù)重要性進(jìn)行排列。用SPA選擇的最相關(guān)的變量被稱為有效波長(EWs)。從光譜中選擇出6個有效波長(512.8，688.48，442.23，432.27，713.46和929.4 nm)。所選擇的波長被認(rèn)為是模擬波長，可能和四種微藻中色素含量有關(guān)。選擇的有效波長(442.23，432.27和512.8 nm)可能和類胡蘿卜素的吸收有關(guān)，因為四種微藻中所含色素主要包括β-胡蘿卜素、海膽酮、玉米黃質(zhì)，這些色素已被證實在450和510 nm的范圍內(nèi)有很強(qiáng)的吸收譜帶[17]。出現(xiàn)稍微的偏移可能是因為：(1)不同藻種所含的色素含量不同；(2)同藻種不同個體的色素含量不同；(3)同一個體不同采集時間的色素含量變化影響采集的光譜變化。

另外，Workman等[18]已經(jīng)證實，在玉米黃質(zhì)分子中有兩個R—C—OH在513 nm處有特征峰，這在某種程度上可以解釋所選擇的有效波長512.8 nm。688.48 nm的有效波長可能是因為葉綠素a在675 nm處有特征峰有關(guān)，也可能是其顏色在可見光區(qū)。而713.46和929.4 nm可能對微藻中的某些物質(zhì)具有敏感性。因此，以上的波長分配表明SPA對四種微藻中相關(guān)變量的選擇是很有幫助的。

2.4 全波段和有效波長PLS結(jié)果比較

Table 2 PLS modeling results of full spectral and effective wavelengths

2.5 SPA-PLS，SPA-LV-SVM，SPA-ELM建模結(jié)果比較

通過用SPA選擇出的6個有效波長作為模型輸入值，輸出值為微藻的不同品種(將蛋白核小球藻、微綠球藻、普通小球藻、萊茵衣藻品種值分別設(shè)為1，2，3，4)。進(jìn)行的SPA-PLS模型是用化學(xué)計量學(xué)軟件Unscrambler進(jìn)行的分析，且計算結(jié)果是閾值為±0.2時的正確率。利用Matlab采用自編程序LV-SVM和ELM進(jìn)行比較。由表3可知，三者的平均預(yù)測正確率分別是65%，80%，85%，SPA-LV-SVM和SPA-ELM的預(yù)測效果顯著高于SPA-PLS。表中蛋白核小球藻和萊茵衣藻的預(yù)測正確率不如微綠球藻和普通小球藻。但用ELM的方法，4者的預(yù)測正確率均在80%以上。說明LV-SVM，ELM和SPA結(jié)合的方法能將四種微藻有效地辨別開。

3 結(jié) 論

以普通小球藻、蛋白核小球藻、微綠球藻和萊茵衣藻作為研究對象，通過自構(gòu)建的光譜采集系統(tǒng)獲取四種微藻的浸入式可見/近紅外透射光譜信息。用Unscrambler軟件處理相關(guān)的光譜數(shù)據(jù)，比較了不同預(yù)處理方法下PLS建模的藻種鑒別效果，卷積平滑的處理效果最好。用SPA選出的6個特征波長與微藻所含的色素有關(guān)。同時，SPA-PLS與Full-Spectral-PLS相比，不僅正確率有所提高，光譜變量也有99.78%的顯著降低。說明利用SPA來提取有效波長能夠極大地提高計算效率和簡化運算過程。采用Matlab自編程序LV-SVM，ELM和PLS進(jìn)行比較，SPA-LV-SVM和SPA-ELM的預(yù)測效果顯著高于SPA-PLS，能夠有效鑒別四種微藻。因此提出的SPA-LV-SVM和SPA-ELM組合算法為復(fù)雜體系的光譜非線性建模提供了一種有力的工具。

Table 3 Results of classification models using effective wavelengths for classifying microalgae

Note:C.P.：Chlorellapyrenoidosa, N.O.：Nannochloropsisoculata, C.V.：Chlorellavulgaris, C.R.：Chlamydomonasreinhardtii

研究所建立的浸入式可見/近紅外光譜技術(shù)藻種鑒別方法，有效實現(xiàn)了對四種微藻的鑒別，為藻種鑒別和藻種分類研究領(lǐng)域提供了一種新思路。與化學(xué)分類法相比，該法具有無需配制任何溶液以及化學(xué)測定、簡化的操作步驟、較短的檢測時間等優(yōu)點，同時也避免了由于操作人員操作不熟練或者主觀因素帶來的測量誤差，分類預(yù)測結(jié)果更為準(zhǔn)確。同時，可見/近紅外光譜和便攜式光纖探針結(jié)合的方法在微藻種類原位鑒別方面提供了一種新型、快速、無損的方式，應(yīng)用前景廣闊。

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*Corresponding author

Identification of Microalgae Species Using Visible/Near Infrared Transmission Spectroscopy

ZHU Hong-yan1, SHAO Yong-ni1, JIANG Lu-lu2, GUO An-que3, PAN Jian1, HE Yong1*

1. College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

2. Zhejiang Technology Institute of Economy, Hangzhou 310018, China 3. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

At present, the identification and classification of the microalgae and its biochemical analysis have become one of the hot spots on marine biology research. Four microalgae species, includingChlorellavulgaris,Chlorellapyrenoidosa,Nannochloropsisoculata,Chlamydomonasreinhardtii, were chosen as the experimental materials. Using an established spectral acquisition system,which consists of a portable USB 4000 spectrometer having transmitting and receiving fiber bundles connected by a fiber optic probe, a halogen light source, and a computer, the Vis/NIR transmission spectral data of 120 different samples of the microalgae with different concentration gradients were collected, and the spectral curves of fourmicroalgae species were pre-processed by different pre-treatment methods (baseline filtering, convolution smoothing, etc.). Based on the pre-treated effects, SPA was applied to select effective wavelengths (EWs), and the selected EWs were introduced as inputs to develop and compare PLS, Least Square Support Vector Machines (LS-SVM), Extreme Learning Machine (ELM)models, so as to explore the feasibility of using Vis/NIR transmission spectroscopy technology for the rapid identification of four microalgae species in situ. The results showed that: the effect of Savitzky-Golay smoothing was much better than the other pre-treatment methods. Six EWs selected in the spectraby SPA were possibly relevant to the content of carotenoids, chlorophyll in the microalgae. Moreover, the SPA-PLS model obtained better performance than the Full-Spectral-PLS model. The average prediction accuracy of three methods including SPA-LV-SVM, SPA-ELM, and SPA-PLS were 80%, 85% and 65%. The established method in this study may identify four microalgae species effectively, which provides a new way for the identification and classification of the microalgae species. The methodology using Vis/NIR spectroscopy with a portable optic probe would be applicable to a diverse range of microalgae species and proves to be a rapid, real-time, non-destructive, precise method for the physiological and biochemical detection for microalgae.

Microalgae; Visible/Near infrared (Vis/NIR) transmission spectroscopy; Species identification; Extreme Learning Machine(ELM)

Aug. 29, 2014; accepted Dec. 15, 2014)

2014-08-29，

2014-12-15

浙江省自然科學(xué)基金項目(LY14C130008)，教育部博士點基金項目(20130101120149)，國家自然科學(xué)基金項目(31072247)和浙江省教育廳科研項目(Y201327409)資助

朱紅艷，女，1992年生，浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院博士研究生 e-mail: hyzhu-zju@foxmail.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：yhe@zju.edu.cn

S931.1

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0075-05