陳昌金，楊雪梅，呂春燕，趙梓亦，袁　惠，辜海英，高　泓，陳奕名，陳　明

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，成都 610072；3.四川省成都市第五人民醫(yī)院病理科　611130，4.四川省成都市樹德中學(xué)光華校區(qū)　610091)

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損傷性腎勻漿體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效果及可能機(jī)制的研究*

陳昌金1，楊雪梅2，呂春燕3，趙梓亦1，袁惠1，辜海英1，高泓1，陳奕名4，陳明2

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，成都 610072；3.四川省成都市第五人民醫(yī)院病理科611130，4.四川省成都市樹德中學(xué)光華校區(qū)610091)

[摘要]目的利用損傷性腎勻漿體外模擬急性腎損傷的微環(huán)境，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化及其可能機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的BMSC用10%大鼠缺血再灌注損傷腎勻漿上清液進(jìn)行培養(yǎng)。7 d后從形態(tài)學(xué)改變、18型角蛋白(CK-18)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7( BMP-7)的相應(yīng)表達(dá)水平。結(jié)果損傷腎勻漿誘導(dǎo)7 d后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，并檢測(cè)到CK-18陽(yáng)性表達(dá)；同時(shí)被誘導(dǎo)的HGF和BMP-7表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論損傷腎勻漿可誘導(dǎo)BMSC部分向腎小管上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其可能機(jī)制是BMSC可能以旁分泌的形式產(chǎn)生了HGF和BMP-7等“腎臟保護(hù)因子”。

[關(guān)鍵詞]間質(zhì)干細(xì)胞；上皮細(xì)胞；腎小管；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；急性腎損傷；轉(zhuǎn)分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)存在于骨髓基質(zhì)中，來(lái)源于中胚層間充質(zhì)，是骨髓中的一類非造血干細(xì)胞，具有橫向分化(即可塑性)和多向分化的潛能。近年研究發(fā)現(xiàn)BMSC的分化潛能不僅局限于間充質(zhì)系，在特定條件下BMSC還能夠分化為肝臟細(xì)胞[1-2]、內(nèi)皮細(xì)胞[3]、神經(jīng)細(xì)胞[4]等。BMSC用于腎臟方面的研究開始的時(shí)間比較晚，但干細(xì)胞移植在急性腎損傷的修復(fù)方面已經(jīng)取得一定的成績(jī)。轉(zhuǎn)分化是干細(xì)胞的兩大基本特征之一。它是指干細(xì)胞能從一種細(xì)胞類型變成另一種完全不同的細(xì)胞類型。其主要機(jī)制是在一定條件影響下，相關(guān)基因出現(xiàn)了差異性，選擇性的表達(dá)。目前認(rèn)為干細(xì)胞發(fā)揮作用的可能機(jī)制有：(1)轉(zhuǎn)分化；(2)細(xì)胞輸入；(3)自分泌(autocrine)；(4)旁分泌(paracrine)；(5)最新的假設(shè)還包括促血管再生、抑制凋亡、抗炎、更好定位及歸巢(homing efficiency)，以及固有細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和增生[5-7]。其中，旁分泌目前被認(rèn)為更為重要[8-9]。那么，旁分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子和干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化又有什么關(guān)系呢？本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)大鼠缺血再灌注損傷腎臟勻漿模擬腎損傷的微環(huán)境，體外誘導(dǎo)BMSC的轉(zhuǎn)分化，同時(shí)檢測(cè)旁分泌產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)，來(lái)進(jìn)一步探討二者的可能關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量120～150 g,另外取8周齡SD雄性大鼠2只(制作腎臟勻漿用)，均由華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)提供。

1.1.2儀器與試劑倒置顯微鏡(Olympus公司)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)；實(shí)時(shí)熒光PCR儀；垂直板電泳裝置；PCR儀(Bio-Rad)；流式細(xì)胞分析儀(Thermo)；DMEM /F-12(1∶1，Hyclone公司)；胰蛋白酶(Hyclone公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗大鼠SH2抗體(BD公司)；FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠SH3抗體(Millcell公司)；重組人細(xì)胞角蛋白18(CK-18，Sigma 公司)；HGF和BMP-7引物(華大生物公司)。

1.2方法

1.2.1BMSC的分離與純化將4只雄性大鼠斷頸處死，75%乙醇中浸泡10 min左右。于超凈臺(tái)中無(wú)菌條件下取大鼠股骨、脛骨，除去骨表面附著的組織，并用 磷酸鹽緩沖液(PBS)將血跡沖洗干凈。去除干骺端鉆孔，吸取 2 mL低糖DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)液從一端沖洗骨髓腔將骨髓細(xì)胞吹到培養(yǎng)皿內(nèi)，用密度為1.077 g/L的淋巴細(xì)胞分離液分離，得到單核細(xì)胞層，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按1×106個(gè)/mL有核細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱在 37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。于接種后24 h首次全量換液，此后每隔 3 天全量換液。原代細(xì)胞約7 d時(shí)細(xì)胞可到 80%～90%融合，0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2傳代。

1.2.2BMSC鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的免疫表型鑒定 收集培養(yǎng)第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分成3組，每組濃度均制成2×106個(gè)/mL，分別加入FITC標(biāo)記的兔抗大鼠SH2單克隆抗體、小鼠抗大鼠SH3單克隆抗體和加入同型對(duì)照IgG孵育。4 ℃避光保存1 h后，1×PBS清洗3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原SH2、SH3的表達(dá)，鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。

1.2.3BMSC體外誘導(dǎo)分化

1.2.3.1腎勻漿制備取正常SD雄性大鼠2只，麻醉后常規(guī)消毒，腹部正中切開，無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉雙腎腎蒂，缺血60 min后松開動(dòng)脈夾，再灌注60 min，得損傷腎。清除脂肪層及筋膜，用無(wú)菌眼科剪剪碎，以1×PBS作為勻漿介質(zhì)，在玻璃勻漿器中無(wú)菌操作，得10%腎勻漿(勻漿過(guò)程在冰上操作)。將所得腎勻漿3 000 r/min 離心20 min后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾網(wǎng)過(guò)濾除菌后4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化取第3代純化的且經(jīng)流式儀鑒定后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按5×105個(gè)/mL接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為兩組，分別進(jìn)行后續(xù)的分析。兩組細(xì)胞分別標(biāo)為(1)未誘導(dǎo)組：DMEM/F12培養(yǎng)液，10%胎牛血清；(2)誘導(dǎo)組:DMEM/F12培養(yǎng)液，10%胎牛血清,10%大鼠缺血再灌注損傷腎臟組織勻漿上清液；此外，將未做表型鑒定的原代培養(yǎng)細(xì)胞，以同樣的細(xì)胞濃度作為空白對(duì)照組，該組只加入DMEM/F12培養(yǎng)液，10%胎牛血清。

1.2.4誘導(dǎo)細(xì)胞鑒定

1.2.4.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定誘導(dǎo)第 0、3、5、7 d，倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組細(xì)胞大體形態(tài)變化。

1.2.4.2Western Blot檢測(cè)誘導(dǎo)7 d后細(xì)胞CK-18的表達(dá)用1×PBS分別將誘導(dǎo)第7天的誘導(dǎo)組及未誘導(dǎo)組細(xì)胞沖洗3遍，每孔中加細(xì)胞裂解液1 mL使細(xì)胞充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白，并檢測(cè)樣品蛋白含量。將檢測(cè)完后的蛋白制作成兩組樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，電泳結(jié)束后即轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將所轉(zhuǎn)膜取出，將膜用1×PBS浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉30 min。將抗CK-18蛋白一抗用PBS-T(含1×PBS，0.1% Tween)稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵育1 h后，用PBS-T在室溫下脫色搖床上洗3次，每次20 mL，10 min。同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min后，顯色，拍照。ACTB為內(nèi)參，利用ScnImage軟件測(cè)定各目的條帶的凈灰度值與內(nèi)參照ACTB條帶值相比較。

1.2.4.3實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HGF、BMP-7 mRNA的表達(dá)分別提取未誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)7 d的誘導(dǎo)組細(xì)胞的總RNA，電泳跑膠對(duì)總RNA完整性進(jìn)行鑒定。將提取的細(xì)胞總RNA作為模板，各取1 μg用于逆轉(zhuǎn)錄，按SsoFast EvaGreen supermix試劑盒方法得到cDNA，得到兩組各20 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。將上述cDNA按1∶5稀釋，稀釋后按AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Reagents說(shuō)明書進(jìn)行，以ACTB mRNA作為內(nèi)參基因，共分6組。完成后將樣本插入qPCR儀，1 h后查看結(jié)果，與內(nèi)參ACTB mRNA值相比，得到各指標(biāo)比較值。各引物序列如表1。

表1　各基因引物序列

1.2.4.4Western blot半定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基上清液中HGF和BMP-7的蛋白表達(dá)水平細(xì)胞接種于六孔板，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄掉上清液后(或保留上清液直接上樣電泳)，每個(gè)6孔板的單孔加入50 μL RIPA[含1%花絮物質(zhì)苯甲基磺酰氟(PMSF)]，冰置30 min充分反應(yīng)并將細(xì)胞收集到離心管中，于4 ℃、12 000 g離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中待用，方法如前所述。

2結(jié)果

2.1BMSC體外分離、純化將經(jīng)1.077 g/L淋巴細(xì)胞分離液分離后所得原代單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，約24 h可基本貼壁，3 d細(xì)胞生長(zhǎng)良好，約7 d細(xì)胞融合約80%～90%，消化傳代后3 d細(xì)胞生長(zhǎng)基本可達(dá)80%～90%融合。取第3代大鼠MSC，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SH2陽(yáng)性率94.5%，SH3陽(yáng)性率95.8%，見圖1。第3代細(xì)胞，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、渦旋狀有序排列，見圖2。

圖1　流式細(xì)胞儀鑒定BMSC SH2(A)、SH3(B)表達(dá)

A：原代細(xì)胞第3天；B：原代細(xì)胞第7天；C：第1代細(xì)胞第3天；D：第2代細(xì)胞第3天；E：第3代細(xì)胞第3天。

圖2BMSC原代細(xì)胞第3、7天及傳代后3 d形態(tài)

A：未誘導(dǎo)BMSC細(xì)胞；B：誘導(dǎo)后細(xì)胞(×10)；C：誘導(dǎo)后細(xì)胞(×20)；D：誘導(dǎo)后細(xì)胞(×40)。

圖3誘導(dǎo)第7天BMSC倒置顯微鏡下形態(tài)

圖4　Western Blot檢測(cè)CK-18的表達(dá)

2.2BMSC誘導(dǎo)7 d后形態(tài)學(xué)觀察誘導(dǎo)第7天,未誘導(dǎo)組細(xì)胞呈明顯長(zhǎng)梭形(圖3 A)；誘導(dǎo)組細(xì)胞數(shù)減少，部分形態(tài)變?yōu)槎趟笮?、圓形或不規(guī)則形(圖3 B～D)。

2.3Western Blot檢測(cè)誘導(dǎo)7 d后細(xì)胞18型角蛋白的表達(dá)Western Blot檢測(cè)誘導(dǎo)7 d細(xì)胞CK-18表達(dá)陽(yáng)性，凈灰度值明顯高于未誘導(dǎo)組,見圖4。

2.4HGF、BMP-7的mRNA和相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)本研究比較了未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)7 d的誘導(dǎo)組細(xì)胞中HGF、BMP-7的mRNA含量。圖5A結(jié)果表明，誘導(dǎo)后細(xì)胞中的目的基因HGF和BMP-7的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。圖5B的半定量Western blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后不但細(xì)胞中HGF和BMP-7的mRNA水平升高，蛋白水平也相應(yīng)升高。本研究比較了分泌到培養(yǎng)基中的HGF與BMP-7蛋白含量。圖5C顯示，雖然誘導(dǎo)分化后白細(xì)胞介素-6表達(dá)可能減弱，但卻能看到明顯的HGF和BMP-7的含量增加。

A：RT-qPCR檢測(cè)mRNA水平；B：細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的檢測(cè)；C：細(xì)胞外相應(yīng)蛋白的檢測(cè)。

圖5BMP-7和HGF的表達(dá)情況檢測(cè)

3討論

干細(xì)胞治療急性腎損傷，目前的焦點(diǎn)主要集中在干細(xì)胞的來(lái)源和作用機(jī)制上。修復(fù)損傷腎的干細(xì)胞包括腎臟外源性干細(xì)胞和腎臟內(nèi)源性干細(xì)胞。內(nèi)源性腎干細(xì)胞是指各種腎祖細(xì)胞(progenitor of kidney)，其來(lái)源有兩種學(xué)說(shuō)：(1)原位干細(xì)胞學(xué)說(shuō)(stem cell in situ theory) 指部分干細(xì)胞在腎發(fā)育階段，就提前進(jìn)入腎臟，潛伏于腎臟組織中，處于靜止?fàn)顟B(tài)，腎乳頭是其聚集區(qū)[10]，能表達(dá)特有的Nanog基因[11]；(2)骨髓干細(xì)胞學(xué)說(shuō)(stem cell in bone marrow theory)腎臟祖細(xì)胞存在于骨髓中，當(dāng)腎臟受損時(shí)，從骨髓中遷移出來(lái)，隨血循環(huán)歸巢到受損的腎臟。目前認(rèn)為存在于腎臟組織中的固有干細(xì)胞才是修復(fù)腎損傷組織的主要來(lái)源干細(xì)胞[12]。

本研究使用損傷性腎勻漿，在體外模擬出腎損傷的微環(huán)境，這種腎勻漿實(shí)際上含有一些有毒的細(xì)胞代謝產(chǎn)物及炎性細(xì)胞因子等，也包含有腎組織細(xì)胞產(chǎn)生的腎臟保護(hù)因子如HGF等。在這些綜合因素的作用下，使BMSC在體外產(chǎn)生了轉(zhuǎn)分化，一部分BMSC分化成了CK-18表達(dá)陽(yáng)性，細(xì)胞形態(tài)類似于腎小管上皮細(xì)胞的“腎小管樣上皮細(xì)胞”。轉(zhuǎn)分化后的BMSC,雖然具有腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)和特有的CK-18表達(dá)，但是發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)狀況并不理想，容易出現(xiàn)死亡。這些發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致。例如Poulsom等[13]報(bào)道，大約有3%～22%的BMSC能轉(zhuǎn)變成腎小管上皮細(xì)胞,Costanza等[14]報(bào)道轉(zhuǎn)分化的干細(xì)胞容易發(fā)生凋亡，可能是某些旁分泌因子產(chǎn)生了作用，并推測(cè)是干細(xì)胞治療腎損傷效果并不理想的可能原因。干細(xì)胞通過(guò)旁分泌產(chǎn)生的保護(hù)性腎臟因子，被認(rèn)為是干細(xì)胞主要的治療機(jī)制之一。為了排除來(lái)自腎勻漿中的保護(hù)性腎臟因子對(duì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)發(fā)化的干擾，本研究測(cè)定了干細(xì)胞內(nèi)HGF 和BMP-7的mRNA水平定量表達(dá)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)組干細(xì)胞的HGF和BMP-7表達(dá)水平顯著高于未誘導(dǎo)組,說(shuō)明在該誘導(dǎo)分化過(guò)程中，BMSC的HGF和BMP-7的表達(dá)上調(diào)。隨后的Western Blot 半定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外均出現(xiàn)相應(yīng)的HGF和BMP-7表達(dá)產(chǎn)物增加，尤其細(xì)胞外液中的表達(dá)產(chǎn)物增加，是否可以推測(cè)就是干細(xì)胞旁分泌產(chǎn)生的結(jié)果？此外，這種以旁分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，除了促進(jìn)腎臟細(xì)胞本身修復(fù)外，是否也是促使或干預(yù)干細(xì)胞向不同細(xì)胞分化的可能因素呢？這些問(wèn)題有待作進(jìn)一步的探索。認(rèn)識(shí)到旁分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子對(duì)腎損傷的修復(fù)作用后，可以應(yīng)用基因工程技術(shù)干預(yù)細(xì)胞因子的表達(dá)，使間充質(zhì)干細(xì)胞在移植治療中發(fā)揮更重要的用[15]。

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Transdifferentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cell induced by injured kidney homogenate in vitro and the mechanism study*

ChenChangjin1,YangXuemei2,LvChunyan3，ZhaoZiyi1,YuanHui1，GuHaiying1,GaoHong1,ChenYiming4,ChenMing2

(1.CentralLaboratory,TeachingHospitalofChengduUniversityofT.C.M,Chengdu,Sichuan610072,China；2.DepartmentofNephropathy，TeachingHospitalofChengduUniversityofT.C.M,Chengdu,Sichuan610072,China；3.DepartmentofPathology,ChengduFifthPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan611130，China；4.GuanghuaDistrictofChengduShudeMiddleSchool，Chengdu,Sichuan610091,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of transdifferentiation of bone marrow- derived mesenchymal stem cells(BMSCs) and the possible mechanism,the micro-environment of acute kidney injury in vitro was simulated with injured kidney homogenate.MethodsBMSCs,isolated from rat bone marrow,were cultured with the presence of 10% injured kidney homogenates.After seven days′ culturing,the morphological changes were observed under microscope.The expression of CK-18,hepatocyte growth factor(HGF) and bone morphogenetic proteins-7(BMP-7) were tested by qPCR and Western blot respectively.ResultsThe morphological observation showed that the BMSCs of induced group had been changed obviously after 7 days incubation.The expression of CK-18 induced group were significantly upregulated.The protein levels of HGF and BMP-7 both in cell culture medium and in induced cell were increased sharply.ConclusionBMSCs could be transdifferentiated partly into renal tubular-like epithelial cells after incubation.It figures out the possible mechanism that BMSCs may produce “kidney protection factors” such as HGF and BMP-7 by their paracrine.

[Key words]mesenchymal stem cells;epithelial cells；kidney tubules;bone marrow mesenchymal stem cells;acute kidney injury;transdifferentiation

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.004

*基金項(xiàng)目：成都市科技局項(xiàng)目(313-106);成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院項(xiàng)目(Y2009003)。

作者簡(jiǎn)介:陳昌金(1965-)，助理研究員，博士，主要從事腫瘤，干細(xì)胞等相關(guān)領(lǐng)域的細(xì)胞及分子生物學(xué)研究。

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0299-04

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-10-16)