李長(zhǎng)麗,鄭　莉，蔣　猛，易成臘，白祥軍

430015 湖北 武漢，湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科(李長(zhǎng)麗，鄭莉)； 430030 湖北 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院

?

·論著·

脊髓損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞活化與線粒體融合蛋白2表達(dá)變化

李長(zhǎng)麗,鄭莉，蔣猛，易成臘，白祥軍

430015 湖北 武漢，湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科(李長(zhǎng)麗，鄭莉)； 430030 湖北 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院

【摘要】目的探索脊髓損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞(AS)活化與線粒體融合蛋白2(Mfn2)的表達(dá)規(guī)律及其意義，為脊髓損傷修復(fù)尋求合適的干預(yù)靶點(diǎn)及時(shí)機(jī)。方法建立成年SD大鼠脊髓損傷(SCI)模型，運(yùn)用免疫熒光和Western Blotting方法，檢測(cè)Mfn2及AS活化相關(guān)蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)變化。清潔級(jí)成年雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組(sham組，n=24)，脊髓損傷組(SCI組，n=24)，SCI組采用Allen’s法建立大鼠胸段脊髓損傷模型，sham組只行椎板切除術(shù)，分別于術(shù)后第1天、第3天、第7天、第14天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠，取大鼠胸段脊髓組織，行組織免疫熒光染色觀察脊髓形態(tài)變化，Western Blotting檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Mfn2與GFAP的表達(dá)變化。結(jié)果脊髓損傷后，大鼠胸段脊髓灰質(zhì)兩背角之間會(huì)形成結(jié)構(gòu)紊亂、邊界不清的損傷灶；Western Blotting及免疫熒光結(jié)果顯示脊髓損傷后，大鼠胸段脊髓Mfn2蛋白表達(dá)從第1天開始下降，與sham組相比，脊髓損傷組胸段脊髓Mfn2表達(dá)整體呈下降趨勢(shì)，術(shù)后第3天開始明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而GFAP表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)則逐漸增加，術(shù)后第3天開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論脊髓損傷后，AS的特異性標(biāo)志物GFAP表達(dá)整體呈上升趨勢(shì)，提示此時(shí)AS出現(xiàn)大量增殖；與此相反，Mfn2(增殖抑制基因)表達(dá)產(chǎn)物則明顯減少。

【關(guān)鍵詞】脊髓損傷； 線粒體； 膠質(zhì)細(xì)胞； 蛋白； 大鼠

影響脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)和軸突再生的因素主要包括兩方面：損傷脊髓周圍存在不利細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境及哺乳動(dòng)物成熟神經(jīng)元內(nèi)在再生能力的減弱，其中膠質(zhì)瘢痕形成及其含有的多種抑制因子是影響軸突再生的重要外部因素。眾多的實(shí)驗(yàn)研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是形成膠質(zhì)瘢痕的重要因素[1-2]。

線粒體融合蛋白(mitofusions,Mfn) 參與線粒體膜融合過程，在維持線粒體形態(tài)和功能中起重要作用。Mfn在哺乳動(dòng)物中編碼Mfn1和Mfn2兩種蛋白質(zhì)分子,Mfn2又名增殖抑制基因(hyperplasia suppressorgene,HSG),是我國(guó)學(xué)者陳光慧利用差異顯示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因[3],其功能除介導(dǎo)線粒體融合外，還參與了細(xì)胞的能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖及凋亡等眾多細(xì)胞生物學(xué)過程。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Mfn2能夠通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK1/2信號(hào)通路的激活，增加周期素依賴性蛋白激酶抑制物(CKls)P27、P21的表達(dá)，從而使血管平滑肌細(xì)胞停留在G0/G1期。而脊髓損傷修復(fù)過程亦涉及膠質(zhì)細(xì)胞異常增殖，并且Mfn2在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有較高的表達(dá)，筆者推測(cè)其功能狀態(tài)或許與脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化密切相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠的脊髓損傷模型探索Mfn2在脊髓損傷后的表達(dá)變化，觀察其與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的相關(guān)性，以期為脊髓損傷修復(fù)治療提供新的視角。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠48只，體重250～350g，均購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，分籠喂養(yǎng)，自由飲食水，并且保持自然晝夜節(jié)律。動(dòng)物模型制備前禁食水12h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組，n=24)，脊髓損傷組(SCI組，n=24)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2動(dòng)物模型的建立和時(shí)間點(diǎn)設(shè)定

脊髓損傷組采用改良的Allen’s法建立脊髓損傷模型[4]，使用10%水合氯醛，以4mL/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉滿意后大鼠俯臥位固定，對(duì)背部擬行切口處皮膚剪毛、消毒、鋪巾，作4cm長(zhǎng)的縱行皮膚切口，分離各層皮下組織暴露T10椎體，咬除棘突及椎板暴露T10脊髓。以后正中血管為中心，將重10g的金屬棒從40mm高處垂直自由下落撞擊硬脊膜，造成T10段脊髓沖擊損傷，損傷直徑約為3mm，局部采用無菌棉球止血，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。損傷模型成功的標(biāo)志是：金屬棒撞擊脊髓時(shí)，大鼠身體抖動(dòng)，雙下肢迅速回縮并彈起撲動(dòng)，尾巴翹起并迅速倒下。sham組只做椎板切除，不行脊髓損傷打擊。所有大鼠術(shù)后均應(yīng)用抗生素，以每只3萬U/次，2次/d的劑量腹腔注射青霉素(由同濟(jì)醫(yī)院藥劑科提供)，連續(xù)3d。術(shù)后軟食喂養(yǎng)，定時(shí)行擠壓排尿。分別在術(shù)后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即第1、3、7、14天取大鼠胸段脊髓組織。

3取材及冰凍切片制備

各時(shí)間點(diǎn)將大鼠麻醉后暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水約300mL直至流出澄清液，然后使用4%多聚甲醛灌注固定約1h后，取以損傷為中心長(zhǎng)約5mm的胸段脊髓組織，置于4%多聚甲醛液體中后固定4℃過夜，30%蔗糖溶液中脫水48h。冰凍切片包埋膠(OCT膠)包埋，冰凍切片機(jī)切片，切片厚度20μm，所切標(biāo)本放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于免疫熒光染色?/p>

4組織免疫熒光染色

從-20℃冰箱取出片子→置入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱晾干→將脊髓標(biāo)本所在位置用組化筆圈起來→磷酸緩沖鹽(PBS)溶液水平搖床上5min/次清洗3次→破膜;0.3%Triton 液室溫破膜15min→PBS溶液水平搖床上5min/次清洗2次→封閉；正常山羊血清封閉液室溫下封閉40min→孵育一抗；按1∶200稀釋Mfn2一抗后4℃冰箱孵育過夜→洗掉一抗；浸泡在PBS溶液缸中搖床上8min/次，清洗3次→孵育二抗；按1∶100稀釋熒光二抗后室溫避光孵育2h→洗掉二抗;浸泡在PBS溶液缸中搖床上8min/次清洗3次→甘油封片→正置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

5蛋白提取

(1)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，麻醉大鼠后迅速處死，置于冰上快速切取以損傷節(jié)段為中心約1cm長(zhǎng)胸段脊髓組織，放于EP管并立刻置入-80℃深低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?(2)待所有時(shí)間點(diǎn)脊髓標(biāo)本收集完整后，從-80℃冰箱取出放置于冰上，并將苯甲基磺酰氟(PMSF)加入到放射免疫分析(RIPA)裂解液中，使裂解液中PMSF濃度為1mM； (3)按每20mg組織加入200μL裂解液的比例加入適量含PMSF的RIPA裂解液，在冰上使用玻璃勻漿器充分勻漿； (4)4℃離心機(jī)，12 000g離心15min取上清即為提取的蛋白溶液，用牛血清蛋白(BCA)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度； (5)加入適量5×上樣緩沖液，使上樣緩沖液最終濃度為1×，煮沸蛋白10min使蛋白變性，放入-20℃冰箱備用。

6Western Blotting檢測(cè)

(1)將長(zhǎng)短玻璃板洗凈晾干，正確置于制膠架上； (2)灌膠：玻璃板對(duì)齊垂直固定于架子上，按前述配方配置10%的濃縮膠進(jìn)行灌膠，至約2/3位置，然后上層加水封膠壓平，室溫約20min后在膠和水之間出現(xiàn)一條水平折線，說明分離膠已凝固；倒掉上層水并用濾紙吸凈玻璃板間殘留水滴，配置濃縮膠并填滿玻璃板之間的剩余空間，水平插入10孔梳子； (3)加樣：用微量加樣器加樣，根據(jù)測(cè)得的樣本蛋白濃度，每孔加入100μg蛋白樣品；(4)電泳：濃縮膠中穩(wěn)流0mA，分離膠中穩(wěn)壓80U； (5)轉(zhuǎn)膜：200mA穩(wěn)流進(jìn)行，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間為50min左右，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間為80min左右，Mfn2的轉(zhuǎn)膜時(shí)間為140min左右； (6)封閉：10%牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫?fù)u床上封閉1h； (7)孵一抗：用5%的BSA稀釋一抗，其中Mfn2按1∶1000、GFAP按1∶1000、GAPDH按1∶3000的濃度稀釋，4℃過夜； (8)孵二抗：1×混合配方緩沖鹽(TBST)溶液以10min/次洗膜3次后，二抗按1∶3000濃度稀釋，室溫下孵育2h； (9)洗二抗：1×TBST溶液以8min/次洗3 次； (10)電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液試劑盒中A液和B液按1∶1混合配備，將配好的顯色液滴在膜上5min 后，在Western Blotting曝光儀中觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7細(xì)胞免疫熒光染色

培養(yǎng)皿中的貼壁星形膠質(zhì)細(xì)胞棄培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次(5min/次)→冰甲醇室溫固定15min后，PBS溶液清洗2次(8min/次)→封閉;山羊血清封閉液室溫下封閉1h→孵育一抗，4℃過夜;Mfn2抗體按1∶200稀釋；GFAP抗體按照1∶100稀釋→PBS溶液水平搖床8min/次清洗3次→孵育二抗;滴加1∶100稀釋的二抗后室溫避光孵育2h；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔二抗1∶100；Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗1∶100→PBS清洗3次(8min/次)→甘油封片，正置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1胸段脊髓組織免疫熒光檢測(cè)

病理切片免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，sham組脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰，灰、白質(zhì)邊界清楚，對(duì)比明顯，無明顯空腔和出血。SCI組可見灰質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，特別是兩背角之間可見大面積損傷灶，內(nèi)部存在空洞，結(jié)構(gòu)難辨別，邊界不清晰，染色程度不一，甚至形成囊腔及膠質(zhì)瘢痕(圖1)。

2胸段脊髓組織中Mfn2表達(dá)變化

Western Blotting結(jié)果顯示，與sham組相比，SCI組Mfn2的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低；條帶灰度值掃描結(jié)果顯示，脊髓損傷后Mfn2表達(dá)隨時(shí)間推移整體呈下降趨勢(shì)，從第3天開始出現(xiàn)明顯下降，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2a)。免疫熒光檢測(cè)顯示，隨著脊髓損傷時(shí)間的推移，Mfn2的表達(dá)逐漸降低(圖2b)。

3GFAP表達(dá)變化

Western Blotting結(jié)果顯示，與sham組相比，SCI組GFAP的表達(dá)變化隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加；條帶灰度值掃描結(jié)果顯示，脊髓損傷后GFAP表達(dá)隨時(shí)間推移整體呈上升趨勢(shì)，從第3天開始GFAP的表達(dá)明顯增加，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3a)。免疫熒光結(jié)果也觀察到一致的結(jié)果(圖3b)。

圖1sham組與SCI組第7天脊髓組織免疫熒光(厚度20μm40×)

ab

圖2a.不同時(shí)間點(diǎn)MFn2表達(dá)(Western Blotting)； b.不同時(shí)間點(diǎn)MFn2表達(dá)(免疫熒光)

ab

圖3a.不同時(shí)間點(diǎn)GFAP表達(dá)(Western Blotting)； b.不同時(shí)間點(diǎn)GFAP表達(dá)(免疫熒光)

討論

脊髓損傷后損傷部位AS細(xì)胞通過自分泌、旁分泌的細(xì)胞因子促進(jìn)自身分裂增殖，形成膠質(zhì)瘢痕，活化的星型膠質(zhì)細(xì)胞(AS)是形成膠質(zhì)瘢痕的最主要細(xì)胞成分。膠質(zhì)瘢痕的形成是一把雙刃劍，在SCI早期可隔離損傷刺激、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、維持局部?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定，起保護(hù)性屏障作用，但是發(fā)展到脊髓損傷的晚期，AS大量增殖伴胞體肥大，導(dǎo)致細(xì)胞大量重疊，不但成為阻止軸突生長(zhǎng)的物理屏障，而且其還分泌抑制軸突生長(zhǎng)的化學(xué)成分。

脊髓損傷后晚期由于AS大量活化形成的膠質(zhì)瘢痕是阻礙脊髓損傷修復(fù)的重要物理及生化屏障，因此尋找能夠有效抑制AS過度活化和膠質(zhì)瘢痕形成的手段，對(duì)促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生、最終達(dá)到脊髓損傷修復(fù)的目的至關(guān)重要。而對(duì)AS活化進(jìn)行細(xì)胞周期調(diào)控是近來研究神經(jīng)損傷修復(fù)的一個(gè)新的方向，已有研究表明白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotropic factor,CNTF)可以刺激AS由靜止態(tài)轉(zhuǎn)為活化態(tài)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factors-2，F(xiàn)GF-2)、上皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能夠刺激活化的AS進(jìn)入細(xì)胞周期[5]。Di-Giovanni等[6]在運(yùn)用一種能對(duì)小分子細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶起抑制作用的抑制劑Flavopiridol后，膠質(zhì)瘢痕的形成減少，且對(duì)正常生理狀態(tài)下的AS細(xì)胞并無抑制作用。由此表明細(xì)胞周期的重新啟動(dòng)在AS的活化增殖過程中扮演著重要角色，倘若能夠?qū)で笥行У匾种艫S細(xì)胞周期重啟的手段，必定將能夠?yàn)榧顾钃p傷修復(fù)提供新的治療靶點(diǎn)。

Mfn2其功能除介導(dǎo)線粒體融合、參與細(xì)胞能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)外，還能起調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等眾多作用。Mfn2編碼產(chǎn)物可通過抑制ERK/MAPK的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而起抑制細(xì)胞增殖作用，已有許多研究發(fā)現(xiàn)Mfn2蛋白有抑制細(xì)胞過度增殖的效應(yīng)。Guo等[7-9]分別在心血管、腫瘤及腎臟的研究中發(fā)現(xiàn)，各自研究疾病出現(xiàn)細(xì)胞異常增值時(shí)，內(nèi)源性Mfn2表達(dá)減少，運(yùn)用腺病毒載體導(dǎo)入外源性基因，使Mfn2表達(dá)增加后，原異常增殖的細(xì)胞增殖現(xiàn)象得到抑制，因此認(rèn)為Mfn2過表達(dá)時(shí)能抑制細(xì)胞過度增殖。

GFAP又名膠質(zhì)纖維酸性蛋白，是一種星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)，其含量的變化可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量或活化程度的改變，因此被選為本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)。在離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到有Mfn2蛋白表達(dá)，這為研究Mfn2蛋白與脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)瘢痕的形成之間的關(guān)系提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物GFAP表達(dá)呈顯著上升趨勢(shì)，傷后第3天起與sham組相比上升幅度較大，與此相反，脊髓損傷后脊髓組織內(nèi)Mfn2表達(dá)呈下降趨勢(shì)，表明在脊髓損傷后出現(xiàn)內(nèi)源性Mfn2 表達(dá)減少。通過上述現(xiàn)象，筆者認(rèn)為脊髓中內(nèi)源性Mfn2這種增殖抑制基因表達(dá)減少可能在脊髓損傷后AS過度活化過程中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了脊髓損傷后內(nèi)源性Mfn2表達(dá)減少與星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化之間的關(guān)系，為研究抑制膠質(zhì)瘢痕形成促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)提供了新的靶點(diǎn)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯： 黃小英)

The relationship between expression changes of Mfn2 and astrocyte activation after spinal cord injury

LIChang-li1,ZHENGLi1,JIANGMeng2,YICheng-la2,BAIXiang-jun2

(1.Department of Geriatrics,Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese & Western Medicine,Wuhan430015;2.Department of Traumatic Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between expression changes of Mfn2 and astrocyte activation after spinal cord injury(SCI) and analyze its significance,so as to provide a basis for the next research about overexpression of Mfn2 suppressing the astrocytes activation after SCI. MethodsThe rat models of SCI were built and the expression of Mfn2 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) was detected using the methods of immunofluorescence-staining and Western Blotting. Forty-eight adult male SD rats were randomly divided into two groups: sham group(n=24) and SCI group(n=24). Thoracic spinal cord injured model was built in animals of the SCI group according to the Allen’s method,but the animals of the sham group only received laminectomy. Animals were anesthetized and thoracic spinal cord tissues were taken at the days of 1,3,7 and 14 separately. Then histologic-immunofluorescence-staining was made to observe the morphology of the spinal cord and Western Blotting was made to detect the expression changes of GFAP and Mfn2 at various time points. ResultsThe immunofluorescence staining result showed that after SCI,the thoracic segment between dorsal horns of spinal cord grey matter was damaged and the structure was disordered and the boundary was not clear;the result of Western Blotting showed that after SCI,the expression of Mfn2 in the thoracic spinal cord was decreased from the first day,compared with the sham group;the Mfn2 expression of group of thoracic SCI was decreased entirely and obviously from the third day after operation,with significantly statistical difference(P<0.05);the expression of GFAP increased gradually with the development of injury,and the difference was statistically significant from the third day after the operation(P<0.05). ConclusionAfter SCI,the expression of GFAP which is the specific marker of astrocytes is increased. At the same time,the products of Mfn2 which is proved to be a hyperplasia suppressor gene is decreased. So there is an inversed relationship between the expression of Mfn2 and the activation and proliferation of astrocytes after SCI.

【Key words】spinal cord injury; chondriosome; astrocyte; protein; rats

文章編號(hào)：1009-4237(2016)03-0153-05

通訊作者：鄭莉,E-mail:1078616252@qq.com

【中圖分類號(hào)】R 651.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.03.008

(收稿日期：2015-07-17； 修回日期： 2016-01-05)

附屬同濟(jì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科(蔣猛，易成臘，白祥軍)