周明寬　張亞東　呂坤龍　莊錦濤　鄧春華　涂響安

510080 廣州，中山大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科

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勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體周細胞數(shù)量和微血管密度變化的研究

周明寬張亞東呂坤龍莊錦濤鄧春華涂響安

510080 廣州，中山大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科

【摘要】目的檢測勃起功能障礙(ED)大鼠模型陰莖海綿體周細胞數(shù)量(PN)和微血管密度(MVD)變化。方法構(gòu)建高脂血癥ED大鼠模型(ED組)，檢測勃起狀態(tài)下海綿體內(nèi)壓(ICP)變化，免疫組織化學染色法檢測陰莖海綿體PN和MVD，并比較其與正常大鼠(正常對照組)的差異。結(jié)果大鼠陰莖海綿體周細胞主要分布在陰莖海綿體靠近白膜的微血管部分。勃起狀態(tài)下ED組大鼠ICP為(21.0±1.5)mm Hg，低于正常對照組大鼠的(36.3±5.7)mm Hg(P<0.01)。ED組大鼠陰莖海綿體的PN為(7.13±1.82)個，少于正常對照組的(8.89±2.24)個(P<0.01)，2組大鼠的MVD比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論陰莖海綿體周細胞可能與陰莖海綿體勃起的血流調(diào)控過程有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】勃起功能障礙；海綿體；周細胞；數(shù)量

勃起功能障礙(ED)是指陰莖不能達到或維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活，是男科的常見病和多發(fā)病。陰莖海綿體是主要的勃起器官，有豐富的動、靜脈血管分布。近年研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、高血壓病、高脂血癥等與ED的發(fā)生密切相關(guān)，血管內(nèi)皮功能障礙是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[1]。另有報道，對于微血管血流量的調(diào)控，除內(nèi)皮細胞外，包括微血管周細胞在內(nèi)的血管周圍細胞在微血管系統(tǒng)的動態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。周細胞是位于微血管(微動脈、毛細血管、微靜脈)內(nèi)皮細胞外的壁細胞[3]。研究認為，周細胞參與血腦屏障功能、血流調(diào)控、內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)、纖維化和血管再生等多種病理生理過程的調(diào)節(jié)，在泌尿生殖系統(tǒng)病理生理過程如腎臟纖維化、腎血流調(diào)節(jié)、腎小球濾過等也有一定的調(diào)節(jié)作用[4-5]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(免疫組化)法檢測陰莖海綿體中周細胞數(shù)量(PN)和微血管密度(MVD)，并比較不同疾病狀態(tài)下PN和海綿體內(nèi)壓(ICP)的變化，探討周細胞對陰莖海綿體勃起過程中血流調(diào)控的影響。

材料與方法

一、實驗動物

無特定病原體級成年雄性SD大鼠10只，購自中山大學實驗動物中心，實驗動物處理符合中山大學附屬第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會規(guī)定。

二、主要試劑

實驗用抗體：兔源多克隆抗大鼠CD31(Abcam，美國)，兔源多克隆抗大鼠血小板衍生生長因子受體-β(PDGFR-β，Santa，美國)，小鼠源單克隆抗大鼠α-平滑肌激動蛋白(α-SMA，武漢博士德)，二抗為超敏型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋)。所有抗體均采用含5%山羊血清和0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。

三、方法

1. 高脂血癥ED大鼠模型的建立及鑒定

大鼠適應(yīng)性喂飼1周后，隨機分成ED組和正常對照組進行實驗，每組各5只。ED組喂飼高脂飼料(普通飼料+15%食用油+6%膽固醇+2%膽酸鈉+10%蔗糖+0.2%丙基硫氧嘧啶)制作高脂血癥動物模型，正常對照組喂飼普通飼料；2組大鼠均正常自由飲水。每日觀察大鼠活動情況，每周稱量體質(zhì)量和測量體長，記錄進食量和飲水量。飼養(yǎng)周期30 d。30 d后，禁食12 h，再次稱量體質(zhì)量和測量體長；腹腔注射水合氯醛麻醉，眼底靜脈叢采血，采用酶法分別檢測血清總膽固醇和甘油三酯。

2. 大鼠陰莖ICP測定

ICP的測定方法參照文獻[6]，即大鼠經(jīng)4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，取下腹部正中切口，充分暴露陰莖及球海綿體肌，并解剖暴露陰莖背神經(jīng)。將充滿肝素鹽水的25 G針頭插入一側(cè)陰莖海綿體，針的另一端連接壓力傳感器，固定針頭和陰莖。記錄大鼠的基礎(chǔ)ICP，電刺激陰莖背神經(jīng)誘發(fā)勃起，測定勃起后的ICP并記錄。

3. 陰莖組織的免疫組化染色檢查

大鼠麻醉固定后，剪開陰莖皮膚，完整切取陰莖海綿體，PBS漂洗去除血跡并取中段制作陰莖海綿體冠狀位連續(xù)石蠟切片。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)法。免疫學染色時，石蠟切片烤片，常規(guī)脫蠟、水化后分別對內(nèi)皮細胞標志物CD31和周細胞標志物PDGFR-β及α-SMA進行免疫組化染色。染色過程中抗原修復方法為高壓修復法。二氨聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水封片后觀察，檢測海綿體組織中CD31、PDGFR-β和α-SMA的表達并比較。

4. 海綿體PN和MVD的定量檢測

PN：陰莖海綿體免疫組化切片首先在100倍視野下選擇計數(shù)部位，然后在400倍視野下計數(shù)。每組計數(shù)5例，每例分別選取9個不重復視野計數(shù)并拍照(兩側(cè)陰莖海綿體各4個，中間連接部1個)，然后計算單位視野(400倍)平均PN，即PN。

MVD：陰莖海綿體免疫組化切片首先在100倍視野下選擇計數(shù)部位，然后在400倍視野下計數(shù)，單個內(nèi)皮細胞作為1個計數(shù)單位，殘存血管或管腔直徑>8個紅細胞者不計數(shù)。每組計數(shù)5例，每例分別選取9個不重復視野計數(shù)并拍照(兩側(cè)陰莖海綿體各4個，中間連接部1個)，然后計算單位視野(400倍)平均微血管數(shù)量，即MVD。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié)果

一、大鼠陰莖ICP測定

大鼠喂飼30 d后，ED組大鼠體質(zhì)量、血清總膽固醇和甘油三酯水平均高于正常對照組(P<0.05)，見表1。大鼠麻醉后測量ICP，ED組與正常對照組ICP基線水平相似；電刺激陰莖背神經(jīng)誘發(fā)勃起后測量ICP，ED組平均ICP高于正常對照組(P<0.05)，表明ED組制模成功，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1　ED組和正常對照組大鼠各指標水平比較±s)

圖1　ED組和正常對照組大鼠ICP比較

A：ED組；B：正常對照組；綠色條帶為電刺激持續(xù)時間

二、陰莖海綿體周細胞和微血管免疫組化結(jié)果

大鼠陰莖海綿體冠狀位石蠟切片分別對內(nèi)皮細胞抗體CD31、周細胞抗體PDGFR-β和α-SMA進行免疫組化染色，抗體抗原陽性反應(yīng)呈棕色，3種抗體均有表達，且主要分布在陰莖海綿體靠近白膜的部分，見圖2、3。

圖2　大鼠陰莖海綿體周細胞免疫組化染色結(jié)果(SP法，A、C×200，B、D×400)

A、 B：正常對照組；C、D：ED組；黑色箭頭所示為周細胞

圖3　陰莖海綿體微血管免疫組化(SP法，A、C×200，B、D×400)

A、 B：正常對照組；C、D：ED組；黑色箭頭所示為微血管

三、陰莖海綿體PN和MVD比較

ED組大鼠陰莖海綿體PN少于正常對照組(P<0.01)，2組MVD比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2　ED組和正常對照組大鼠陰莖海綿體

討論

ED是男性常見的性功能障礙之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，ED與男性的年齡、身體狀況、吸煙、血糖和血脂等狀態(tài)密切相關(guān)[7]。陰莖主要由陰莖海綿體和尿道海綿體構(gòu)成，陰莖海綿體是主要的勃起器官，由小梁和血竇組成。陰莖勃起是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)下陰莖海綿體動脈復雜血流動力學變化的血管調(diào)節(jié)過程：動脈擴張、動脈血流量明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細胞分泌的內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、一氧化氮、內(nèi)皮源性超極化因子和神經(jīng)末梢釋放的去甲腎上腺素、一氧化氮及局部其他細胞釋放的多種血管活性物質(zhì)的作用下，陰莖海綿體平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度和對鈣離子的敏感性發(fā)生變化，引起平滑肌細胞的收縮、舒張以及海綿體血流量的變化，陰莖勃起狀態(tài)改變[8]。

對于微血管血流量的調(diào)控，除內(nèi)皮細胞外，包括微血管周細胞在內(nèi)的血管周圍細胞在微血管系統(tǒng)的動態(tài)調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。周細胞位于微血管內(nèi)皮細胞和基膜之間并部分包繞內(nèi)皮細胞，它通過多種途徑參與血管功能的維持和調(diào)節(jié)。國外研究發(fā)現(xiàn)，周細胞能合成細胞外基質(zhì)，當周細胞缺乏時，微血管發(fā)育異常、管徑不規(guī)則，通透性增加[9]。周細胞通過多種信號通路，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β及其受體系統(tǒng)、血管生成素及其受體、血小板生長因子-β及其受體和1-磷酸-鞘氨醇及其受體等，與微血管內(nèi)皮細胞相互聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)和維持血管的穩(wěn)定性[10]。周細胞內(nèi)還含有SMA，體外試驗可直接觀察到周細胞的收縮，因此推測周細胞可能直接參與調(diào)控微血管直徑，調(diào)節(jié)局部血流量等[11-12]。

PN因組織器官類別、生長階段和疾病狀態(tài)的不同而有較大差異，其與內(nèi)皮細胞的數(shù)量比例范圍為1∶100至1∶1，大約覆蓋10%～50%的血管內(nèi)皮層。在嚙齒動物模型中，糖尿病發(fā)生后2個月PN開始減少，這一現(xiàn)象比無細胞毛細血管的出現(xiàn)早數(shù)月；并且無論是自然發(fā)生的糖尿病模型還是藥物誘導的動物模型，視網(wǎng)膜PN均從2～3個月時開始減少，實驗6個月時，PN減少了15%～50%，其機制仍不清楚，推測可能與局部活性氧簇物質(zhì)、糖基化產(chǎn)物過多等導致周細胞的凋亡有關(guān)[13]。PN的減少會引起部分內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變：正常血管內(nèi)壁是平整光滑的，周細胞缺如的血管內(nèi)壁會出現(xiàn)較多的膜折疊，影響內(nèi)皮細胞的外形，進而影響血管的直徑和功能[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，周細胞在大鼠陰莖海綿體中主要分布在較靠近白膜的海綿體微血管部分， ED大鼠陰莖海綿體MVD與正常對照組相近，PN較正常對照組明顯減少，而ICP測定顯示，ED大鼠陰莖ICP較正常對照組明顯降低，提示陰莖海綿體周細胞可能與陰莖海綿體勃起的血流調(diào)控過程有關(guān)，但周細胞在勃起過程中對海綿體血流調(diào)控的具體作用機制仍不清楚，需要進一步研究闡明。

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Changes in pericyte number and microvascular density in corpus cavernosum of rat models with erectile dysfunction

ZhouMingkuan,ZhangYadong,LyuKunlong,ZhuangJintao,DengChunhua,TuXiang’an.

DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,ChinaCorrespondingauthor,TuXiang’an,E-mail:txabs9988@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes in the pericyte number (PN) and microvascular density (MVD) in the penile corpus cavernosum of rat models with erectile dysfunction (ED). MethodsED rat models with hyperlipidemia were established. The changes in the intracavernosal pressure (ICP) were measured under erectile status. PN and MVD of the corpus cavernosum were analyzed by immunohistochemistry and statistically compared with the normal rats (control group). ResultsThe pericytes were mainly distributed in the microvesssels adjacent to the tunica albuginea of the corpus cavernosum. Under erectile status, the mean ICP in the ED group was (21.0±1.5) mmHg, significantly lower compared with (36.3±5.7) mmHg in the control group (P<0.01). The PN in the ED group was 7.13±1.82, considerably less than 8.89±2.24 in the control group (P<0.01). The MVD did not significantly differ between the ED and control groups (P>0.05). ConclusionThe pericyte of the corpus cavernosum might be associated with the regulation of blood flow in the penile corpus cavernosum.

【Key words】Erectile dysfunction; Corpus cavernosum; Pericyte; Number

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.006

基金項目：國家自然科學基金(81172432，81302223,81471449)；廣東省科技計劃對外合作項目(2013B51000021)；廣州市科技計劃項目(2013J4500010)；廣東省自然科學基金博士啟動項目(S2013040012294)；廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金(A2014822, C2013022)

(收稿日期：2016-01-25)(本文編輯：林燕薇)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，涂響安，E-mail：txabs9988@163.com