曹丙蕾，邱洪凱，孫 濤，凌宗帥，張 群（. 濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濟(jì)南 5004；. 山東臨沂新程金鑼牧業(yè)有限公司，山東沂水 76400；. 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 6600）

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豬流行性腹瀉焦磷酸測序檢測方法的建立

曹丙蕾1，邱洪凱2，孫 濤3，凌宗帥1，張 群1
（1. 濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濟(jì)南 250014；
2. 山東臨沂新程金鑼牧業(yè)有限公司，山東沂水 276400；
3. 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

摘 要：本研究旨在建立一種基于RT-PCR的焦磷酸測序方法，以便對豬流行性腹瀉（PED）進(jìn)行高效準(zhǔn)確地檢測。利用PSQ Assay Design SW軟件分析了豬流行性腹瀉病毒（PEDV）N蛋白基因的保守區(qū)域，設(shè)計了一對擴(kuò)增引物及一條測序引物，建立了PEDV N蛋白基因的焦磷酸測序檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以直接通過PSQ的序列結(jié)果直觀地判定PEDV，大大提高了PEDV的檢出率和準(zhǔn)確性。該方法特異性強(qiáng)，不與其他豬源病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，最低核酸檢測限為0.05 pg/μL。本研究所建立的焦磷酸測序方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，能從基因序列水平上精確鑒定PEDV，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，對于PED的快速確診具有重要意義。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉；豬流行性腹瀉病毒；RT-PCR；焦磷酸測序；鑒定

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、接觸性、高度傳染性消化道疾病，主要癥狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水。PED波及的范圍廣，在全球均有病例報道，成為幾十年來影響亞洲地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的大問題[1]。PED通常多發(fā)于寒濕較重的秋冬季，近年多呈地方性流行。不同年齡段的豬只對該病毒均易感，幼年豬感染率高達(dá)100%，7日齡以下仔豬的病死率為80%～100%。PED已給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。由于PED與豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床癥狀較為相似，臨診中較難進(jìn)行鑒別診斷，給疾病的確診、治療和防控帶來了很大困難，故PED的病原檢測成為目前最有效的鑒別診斷方法[4-5]。

傳統(tǒng)的病原診斷方法包括病毒分離與鑒定、RT-PCR、熒光RT-PCR等，具有一定的特異性和靈敏性，但其無法滿足快速準(zhǔn)確檢測的要求，即無法獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)——基因序列，從而可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[6-7]。而利用常規(guī)的Sanger測序法僅在對大片段DNA進(jìn)行序列測定時才顯示出優(yōu)勢，且速度慢、成本高、通量低，但如果在實(shí)際工作中，引物選擇得好，那么很短的一段保守特異性序列就可滿足對病原體分子診斷的需要[6，8]。

焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是一種能夠進(jìn)行定量序列測定的短鏈測序技術(shù)。該技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、實(shí)時地進(jìn)行短DNA序列分析，檢測通量高；可同時進(jìn)行多達(dá)96份樣品的測序，無需進(jìn)行電泳；對DNA片斷無需熒光標(biāo)記，操作簡單方便，可程序化；便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和規(guī)范，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[6，9-10]。目前該技術(shù)在物種鑒定、病毒快速鑒定和分型、微生物檢測等方面被廣泛應(yīng)用。本研究針對PEDV N蛋白基因序列，利用焦磷酸測序軟件設(shè)計RT-PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸測序引物，建立了N蛋白基因的焦磷酸測序檢測方法，直接通過測序結(jié)果就能夠快速從基因序列水平上直觀地進(jìn)行PEDV鑒別診斷，既能快速鑒定PEDV，又能區(qū)分鑒別PEDV和TGEV，大大提高了檢測效率，實(shí)現(xiàn)了從基因水平上對PEDV進(jìn)行精確鑒定。

1　材料與方法

1.1材料

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等核酸樣本由本實(shí)驗(yàn)室保存。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、100 bp DNA Ladder Marker及相應(yīng)試劑等購自TaKaRa公司；焦磷酸測序儀PyroMarkTM ID System、Vacuum Prep Tool、鏈霉親和素包被磁珠、PyroGold SQA Reagents 1×96 DNA序列分析試劑盒及相應(yīng)試劑均為Gene公司產(chǎn)品。磁珠法RNA提取試劑盒及核酸提取儀由西安天隆科技有限公司提供。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1焦磷酸測序引物的設(shè)計。根據(jù)GenBank中公布的PEDV N蛋白基因的保守序列，運(yùn)用PSQ Assay Design SW軟件進(jìn)行分析，設(shè)計一對通用擴(kuò)增引物PF和PR及測序引物PS（表1）[8-11]，其中對引物PR在其5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為108 bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　PEDV的擴(kuò)增引物及測序引物

1.2.2病毒RNA的提取。將收集的PEDV病毒液樣本利用磁珠RNA提取法提取核酸，提取的RNA立即用于RT-PCR擴(kuò)增或置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-PCR反應(yīng)。以病毒RNA為模板，采用一步法進(jìn)行RT- PCR擴(kuò)增并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定RT- PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測擴(kuò)增結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。剩余的PCR產(chǎn)物用于焦磷酸測序反應(yīng)。

1.2.4測序單鏈模板的制備。按照Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應(yīng)操作說明制備測序單鏈模板，在PCR產(chǎn)物中加入含有鏈霉親和素包被磁珠的結(jié)合緩沖液，常溫震蕩混勻10 min，將vacuum prep tool在超純水中清洗30 s后抓取與PCR產(chǎn)物結(jié)合的磁珠，然后用70%乙醇清洗5 s；Denatureation buffer洗5 s；最后移到Washing buffer中清洗10 s，將vacuum prep tool放入含有測序引物的PSQ 96孔板中，搖動，釋放磁珠。將此PSQ 96孔板置于Thermo Plate上置80 ℃ 2 min，取出自然冷卻至室溫[8-10]。

1.2.5焦磷酸測序反應(yīng)。依據(jù)儀器說明中設(shè)定的程序及程序給定的劑量，在試劑艙中相應(yīng)的孔內(nèi)加入酶混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）、底物APS以及dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入PyroMark Q96 ID中進(jìn)行Pyrosequencing，反應(yīng)完畢后儀器自動給出測序結(jié)果，對測序結(jié)果在線進(jìn)行BLAST分析，比較序列特異性[10-13]。

1.2.6特異性試驗(yàn)。分別以PEDV、TGEV、PRRSV的核酸樣品為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，采用1.2.4中建立的方法進(jìn)行焦磷酸測序，對測序結(jié)果利用BLAST鑒定測序引物的特異性。同時，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增引物的特異性[11]。

1.2.7靈敏度試驗(yàn)。將PEDV核酸樣本（50 ng/ μL）分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，并以此為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增條帶情況，判定用于焦磷酸測序的RT-PCR的最低檢測限。

1.2.8重復(fù)性試驗(yàn)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行3次焦磷酸測序，比較序列結(jié)果，以確定該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.9焦磷酸測序檢測方法在臨床樣品中的比對應(yīng)用。對臨床采集的疑似PEDV的20個樣本提取RNA，并以此為模板進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，同時將RT-PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，通過序列結(jié)果的比較，來驗(yàn)證焦磷酸測序方法的高效性和準(zhǔn)確性。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用PSQ Assay Design SW軟件設(shè)計的擴(kuò)增引物對PEDV核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為108 bp，與預(yù)期目的片段大小一致（圖1）。測序結(jié)果分析表明，該目的條帶與PEDV N蛋白基因片段同源性達(dá)100%。

圖1　PEDV N基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2焦磷酸測序反應(yīng)

PEDV N基因片段的焦磷酸測序結(jié)果為：CGTTTGATCCTAGTGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGGCCA。將該序列進(jìn)行BLAST比較分析，結(jié)果與目的序列片段符合率為100%。該序列能夠作為PEDV快速鑒定的靶序列，其焦磷酸測序結(jié)果與普通Sanger測序結(jié)果的符合率為100%，經(jīng)BLAST軟件分析，該序列屬于PEDV N基因，因此該試驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確性和特異性（圖2）。

圖2　PEDV N 蛋白基因焦磷酸測序結(jié)果

2.3特異性結(jié)果

以PEDV、TGEV和PRRSV的核酸為模板進(jìn)行上述焦磷酸測序反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只有PEDV獲得了目的序列的結(jié)果。將該序列進(jìn)行BLAST比較分析，結(jié)果與目的序列片段符合率為100%；其他無關(guān)核酸樣品未獲得任何序列結(jié)果。特異性表明，本研究所設(shè)計的PEDV N基因的擴(kuò)增引物與測序引物具有較好的特異性。

2.4靈敏度結(jié)果

由于進(jìn)行焦磷酸測序需要先進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，故焦磷酸測序的靈敏度也即是RT-PCR的靈敏度，因此可依此來判定焦磷酸測序的靈敏度。依據(jù)擴(kuò)增結(jié)果（圖3），RT-PCR的最低核酸檢測限為0.05 pg/μL（稀釋度為10-6時），此時所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可以用于焦磷酸測序，得到較好的序列結(jié)果。

圖3　PEDV N蛋白基因的RT-PCR靈敏度結(jié)果

2.5重復(fù)性結(jié)果

對每個RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行3次重復(fù)性檢測，檢測結(jié)果均一致，證明該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6樣品檢測

對20個疑似PEDV的臨床樣本進(jìn)行焦磷酸測序，從序列結(jié)果上直觀地確診了15個PEDV陽性，5個PEDV陰性，反應(yīng)結(jié)果與普通測序結(jié)果完全一致，序列符合率為100%，但是檢測效率明顯得到提升。

3　討論

PED最早于20世紀(jì)70年代在英國被發(fā)現(xiàn)。此后，除美洲以外，全球多個國家和地區(qū)相繼報道了PED的發(fā)生，尤其是在歐洲和亞洲，包括日本、中國與韓國，給這些國家的畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國豬群中的PEDV感染尤其嚴(yán)重，其感染率明顯高于豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒病[1-2]。

由于PED與豬傳染性胃腸炎在臨床癥狀上極為相似，在實(shí)際臨診中容易造成混淆誤診，故在基因水平上進(jìn)行判定是最為準(zhǔn)確可靠的。焦磷酸測序技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種能夠通過對基因序列測序?qū)崿F(xiàn)檢測和確診的新型檢測技術(shù)，具有高通量、快速、 敏感等特點(diǎn)，可將分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)——基因序列直觀地表現(xiàn)出來，減少了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。與普通RT-PCR和real time RT-PCR等檢測技術(shù)相比，本技術(shù)無需將PCR產(chǎn)物送交公司測序，加入特異的堿基后，可在40 min內(nèi)準(zhǔn)確獲得樣品目的片段的基因序列，因此大大提高了疫病的確診效率[7，14]。

PEDV共有4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其中N蛋白是PEDV已知結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是組成病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。不僅如此，N蛋白還具有保守性強(qiáng)的特點(diǎn)。豬在感染PEDV早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生高水平的抗N蛋白抗體，因而利用N蛋白建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[15]。本研究利用軟件對PEDV N蛋白基因的保守序列設(shè)計了一對通用擴(kuò)增引物及一條帶有生物素標(biāo)記的測序引物，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得純度較高的PCR產(chǎn)物后進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，獲得了一段特異性強(qiáng)的短序列。這段序列可以作為PEDV鑒定的靶序列，直接從這段基因序列上就可判定是否是PEDV。

焦磷酸測序檢測方法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)了從基因水平上對疫病進(jìn)行判定。由于焦磷酸測序方法對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度與純度有一定的要求，因此該方法的敏感性低于國外常用的熒光定量分型方法[8，16]。但是焦磷酸測序方法可以直觀地從結(jié)果中觀察到序列，避免了二次測序確證，可直接對疫病進(jìn)行判定，便于快速監(jiān)控疫情，對出入境動物檢疫具有有快速高效的預(yù)警作用。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

《中國動物檢疫》2016年重點(diǎn)選題策劃

Establishment of Pyrosequencing Assay Detection Method of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Cao Binglei1，Qiu Hongkai2，Sun Tao3，Ling Zongshuai1，Zhang Qun1
（1. Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinan，Shandong 250014；2.Shandong Linyi Xincheng Jinluo Animal Husbandry Co.，LTD，Yishui，Shandong 276400；3 Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002）

Abstract：The pyrosequencing（PSQ）assay based on reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was developed for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV） effi ciently and accurately. The pair of amplifi cation primers and a sequencing primer were designed for the conserved region of the N protein gene of PEDV by the analysis of the software PSQ Assay Design SW to establish the pyrosequencing assay for the detection of PEDV. The results showed that this assay could be used for the identifi cation of PEDV by the sequences of the PSQ directly and the rates of detection and the accuracy could be improved greatly. The results of specifi cation assay showed that this assay had good specifi city ，no cross reaction with other porcine viruses. The minimum detection limit of the nuclei acid was 0.05 pg/μL. The pyrosequencing assay with high sensitivity and stability could accurately identify PEDV at the level of gene to avoid the occurrence of false positive results. It was of great signifi cance for the rapid diagnosis of porcine epidemic diarrhea.

Key words：porcine epidemic diarrhea；porcine epidemic diarrhea virus；reverse-transcriptase polymerase chain reaction；pyrosequencing assay；detection

中圖分類號：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-944X（2016）05-0075-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.024

基金項(xiàng)目：山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（SK201401）；動物病原微生物DNA條形碼檢測技術(shù)研究與示范應(yīng)用（2012BAK11B04）