陳仁良,王　威,嚴(yán)俊杰,熊宏民,謝寶貴

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心,福建福州350002)

金針菇凝集素基因Fv-mJRL1的生物信息學(xué)分析及其共表達(dá)

陳仁良,王威,嚴(yán)俊杰,熊宏民,謝寶貴*

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心,福建福州350002)

摘要：Jacalin凝集素(jacalin-related lectins,JRLs)是一類(lèi)含有一個(gè)或多個(gè)JRL結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),參與生物或非生物環(huán)境刺激應(yīng)答．本研究基于金針菇(Flammulina velutipes)基因組數(shù)據(jù),注釋篩選到其中一個(gè)JRL基因Fv-mJRL1,對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并利用其上游調(diào)控序列進(jìn)一步預(yù)測(cè)到該基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子Fv-Mbp1．通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析得知,無(wú)論是在不同栽培基質(zhì)培養(yǎng)的金針菇菌絲還是在金針菇各發(fā)育時(shí)期的組織中,Fv-mJRL1基因與潛在的轉(zhuǎn)錄因子基因Fv-Mbp1之間都存在極強(qiáng)的共表達(dá)規(guī)律．生物信息學(xué)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析為篩選挖掘基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子提供便利,后期仍需利用下游分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更為精確的驗(yàn)證．

關(guān)鍵詞：jacalin凝集素;子實(shí)體形成;潛在轉(zhuǎn)錄因子;皮爾森相關(guān)系數(shù)

金針菇營(yíng)養(yǎng)豐富且味道鮮美,具有很高的食用和藥用價(jià)值,是我國(guó)和東南亞地區(qū)重要的商業(yè)性栽培食用菌．金針菇屬低溫結(jié)實(shí)性食用菌,菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為20～23 ℃,原基形成適宜溫度為3～18 ℃[1]．菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)結(jié)束之后,需要低溫處理刺激原基形成,但這種低溫刺激影響金針菇結(jié)實(shí)的分子機(jī)理尚不清楚．Jacalin凝集素(jacalin-related lectins,JRLs)作為植物凝集素超家族中新發(fā)現(xiàn)的家族,是能夠與植物來(lái)源的糖類(lèi)化合物結(jié)合的非經(jīng)典凝集素,根據(jù)糖基結(jié)合特異性,JRLs分為與半乳糖特異結(jié)合的jacalin凝集素(galactose specific jacalin-related lectins,gJRLs)[2]和與甘露糖或葡萄糖特異結(jié)合的jacalin凝集素(mannose specific jacalin-related lectins,mJRLs)[3]．在植物中非經(jīng)典凝集素能響應(yīng)脅迫刺激并參與細(xì)胞調(diào)控與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4],均表明此類(lèi)凝集素與體內(nèi)糖類(lèi)化合物結(jié)合,作為參與植物自身信號(hào)傳導(dǎo)的內(nèi)源性凝集素．大多數(shù)JRL基因具有響應(yīng)生物或非生物脅迫刺激的功能,與經(jīng)典凝集素在功能上有著明顯區(qū)別[5],因此對(duì)于金針菇中JRL基因的研究,有助于揭示低溫刺激影響金針菇結(jié)實(shí)的分子機(jī)理．

真菌凝集素與自身的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：灰樹(shù)花(Grifolafrondosa)Gf-mJRL在子實(shí)體中活性最高,而在菌絲及原基中活性較低[6]；密褐褶孔菌(Gloeophyllumtrabeum)Gt-mJRL與其木質(zhì)素降解酶系進(jìn)化有一定的相關(guān)性[7]；紅菇蠟傘(Hygrophorusrussula)Hr-mJRL的N-和O-糖苷結(jié)合形式及有無(wú)信號(hào)肽等的研究進(jìn)一步拓展了分子理論研究[8].但目前對(duì)于真菌JRLs在分子表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域的研究尚少．我們分析金針菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)金針菇內(nèi)源凝集素基因Fv-mJRL1表達(dá)量在原基期最高．生物信息學(xué)分析顯示其基因上游調(diào)控序列存在多個(gè)順式作用元件，且存在多個(gè)磷酸化、糖基化和豆蔻酰化等蛋白功能修飾位點(diǎn)，是蛋白功能趨近于植物且聚類(lèi)為擔(dān)子菌的親水性?xún)?nèi)源凝集素.結(jié)合出菇實(shí)驗(yàn)及葡萄糖、稻草、木屑等常用出菇栽培基質(zhì)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),探索Fv-mJRL1對(duì)金針菇原基形成的影響,并挖掘其潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,將有助于闡明金針菇子實(shí)體形成的分子調(diào)控機(jī)理．

1材料與方法

1.1材料

金針菇異核體菌株 H1123由單核菌株W23和L11配對(duì)獲得．W23菌株的基因組數(shù)據(jù)和H1123菌株各發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供,其中W23菌株的基因組數(shù)據(jù)已提交至DDBJ/EMBL/GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),登錄號(hào)為APHZ00000000(BioProject:191864)．

1.2Fv-mJRL1基因鑒定以及生物信息學(xué)分析

通過(guò)金針菇H1123菌株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選,結(jié)合W23菌株全基因組測(cè)序的注釋數(shù)據(jù),獲得目的基因Fv-mJRL的DNA序列以及全長(zhǎng)編碼框序列(CDS)．在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)Fv-mJRL與Gf-mJRL具有較高同源性,本菌株共注釋到3個(gè)mJRL基因,故將目的基因命名為Fv-mJRL1．

采用SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)與分析;采用TargetP程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞進(jìn)行定位分析;采用Phyre2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu);利用ExPASy(http:∥web.expasy.org/)對(duì)蛋白疏水性及豆蔻?；稽c(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè);采用在線軟件NetPhos 2.0 Servier(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)．利用 ClustalX 的Muscle比對(duì)方法進(jìn)行同源比對(duì),參數(shù)為默認(rèn)值；以同源比對(duì)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),采用MEGA 5.0 軟件包(參數(shù)為 bootstrap values 1 000 resamplings)構(gòu)建相應(yīng)序列的鄰接法(neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)．

1.3Fv-mJRL1基因上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

參照陳仁良等的方法[9],從金針菇W23菌株基因組注釋數(shù)據(jù)獲取Fv-mJRL1基因的上游調(diào)控序列,采用Promoter 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)分析基因啟動(dòng)子在上游調(diào)控序列中的分布情況,進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)錄因子檢索數(shù)據(jù)庫(kù)YEASTRACT(http:∥www.yeastract.com/)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子潛在結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SDG(http:∥www.yeastgenome.org/)及真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)FTFD(http:∥ftfd.snu.ac.kr/)與本實(shí)驗(yàn)室金針菇蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲取金針菇同源轉(zhuǎn)錄因子[10]．

1.4金針菇菌株的培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方如下(g/L):KH2PO41.0,K2HPO40.4,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2·2H2O 0.013,酵母提取物0.5,L-天冬酰胺1.5,NH4NO30.5,鹽酸硫胺0.03 (過(guò)濾除菌)；另Tween80 2 mL,微量元素溶液1 mL,并用0.1 mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)pH到6.5．其中微量元素溶液的配方(g/L):FeC6H5O74.8,CoCl2·6H2O 0.4,ZnSO4·7H2O 2.64,MnCl2·4H2O 2.0,CuSO4·5H2O 0.4．

利用葡萄糖、稻草(WJY116,100目過(guò)篩)和木屑(湖桑,100目過(guò)篩)3種常用的栽培基質(zhì),分別按1 g/mL加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)．以添加葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照,置于搖床中23 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 d,收集菌絲．通過(guò)搔菌法[1]栽培金針菇菌株H1123,出菇時(shí)于栽培料面采集菌絲、菌絲扭結(jié)、菌皮、原基(初期、中期、后期)、伸長(zhǎng)期和成熟期子實(shí)體,以菌絲作為對(duì)照．采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit(R6827-01,Bio-Tek公司,美國(guó))分別提取以上材料的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司,北京)合成cDNA．

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)及基因共表達(dá)分析

使用軟件Premier 5.0 進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì),并選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參基因[11],引物(表1)由上海生物工程有限公司合成．采用TransStart TOP Green qPCR試劑盒(Bio-Rad公司，美國(guó)),反應(yīng)體系及程序按照試劑盒的使用說(shuō)明書(shū),采用兩步法，退火溫度為59 ℃,循環(huán)數(shù)為40,每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù),相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算處理[12]．

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的引物

皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)作為基因共表達(dá)關(guān)系的衡量指標(biāo)：0.8～1.0為極強(qiáng)相關(guān),0.6～0.8為強(qiáng)相關(guān),0.4～0.6為中等程度相關(guān),0.2～0.4為弱相關(guān),0～0.2為極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)[13]．

2結(jié)果

2.1Fv-mJRL1基因的結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析

從W23基因組注釋得到Fv-mJRL1基因全長(zhǎng)1 126 bp,包括開(kāi)放閱讀框(ORF)775 bp，上游的5′非編碼區(qū)(5′-UTR)245 bp和下游的3′-UTR 106 bp．以該基因序列作為參照,利用Zoomlite軟件將轉(zhuǎn)錄組原始序列標(biāo)簽(reads)定位到參考序列上,檢測(cè)到Fv-mJRL1基因含有4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子(E1～E5),編碼180個(gè)氨基酸,其蛋白質(zhì)含有1個(gè)典型的jacalin-like lectin結(jié)構(gòu)域,InterproScan5預(yù)測(cè)其屬于mJRL,Netphos預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)可受8類(lèi)激酶磷酸化(圖1)．

IKK，ATM，PKG為絲氨酸激酶;EGFR，INSR，Syk為酪氨酸激酶;PKC，PKA為蘇氨酸激酶.圖1　Fv-mJRL1基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)分析Fig.1Fv-mJRL1 gene structure analysis and the domain and phosphorylation sites analyses of its expressed protein

2.2Fv-mJRL1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其疏水性、豆蔻酰化分析

通過(guò)在線預(yù)測(cè)分析顯示Fv-mJRL1不含有信號(hào)肽(C、S、Y、D各指標(biāo)值分別為0.299，0.287，0.283，0.285),無(wú)跨膜結(jié)構(gòu),定位在細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核),不屬于分泌蛋白．ExPASy預(yù)測(cè)顯示Fv-mJRL1存在4個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)：G62IQPTY、G140TSFGT、G147QVIAL、G154TDENS(圖2(a));其二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主,僅含有4個(gè)α螺旋;親水性較好的β3、β4、β7,可利于亞基單體聚合成多聚體后形成親水性的溶劑通道(圖2(b),2(c));Phyre2預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)(模板為c1x1vB,可信度為98.1%)為由β折疊片層結(jié)構(gòu)組

成對(duì)稱(chēng)形棱柱的主體結(jié)構(gòu),這一空間袋形構(gòu)型有助于糖基的結(jié)合,結(jié)合糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)BL1(S90)、BL2(S135)和BL3(S159)(圖2(c))．

2.3Fv-mJRL1系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI、EBI數(shù)據(jù)庫(kù)選擇下載功能已明確的具有代表性的mJRLs蛋白序列進(jìn)行蛋白功能進(jìn)化分析,包括：豆(Parkiaplatycephala)P83304、菊芋(Helianthustuberosus)1C3K、田旋花(Convolvulusarvensis)Q9FVA0 、榴蓮蜜(Artocarpusinteger)Q7M1T4、紅菇蠟傘BAL02996.1、密褐褶孔菌XP_007867984.1、灰樹(shù)花BAE43874.1、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)KGO62150.1、稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)KDB12616.1、蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)XP_006672990.1．

(a)中三角形為豆蔻酰基化位點(diǎn)；(c)中箭頭所示為BL頸環(huán)(BL neck rings).圖2　Fv-mJRL1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(a)、疏水性(b)及豆蔻?；稽c(diǎn)(c)分析Fig.2Analyses of Fv-mJRL1 protein structure (a),hydrophobicity (b) and myristoylation sites (c)

圖3　Fv-mJRL1系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3The phylogenic analysis of Fv-mJRL1

采用蛋白水平Muscle比對(duì)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),對(duì)蛋白功能進(jìn)化聚類(lèi)分析的結(jié)果(圖3)顯示：Fv-mJRL1與其他3個(gè)擔(dān)子菌(Basidiomycete)已知的mJRLs序列同源性較高，聚為同一分支,有別于植物(Plant)和子囊菌(Ascomycotina)．mJRLs同時(shí)存在于植物、擔(dān)子菌和子囊菌,且各自聚類(lèi)為一類(lèi)別分支,這表明mJRLs早于植物、擔(dān)子菌和子囊菌的分化就已經(jīng)存在;植物與擔(dān)子菌的親緣關(guān)系相較于子囊菌與擔(dān)子菌的親緣關(guān)系遠(yuǎn),但其mJRLs進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近．這意味著親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物和擔(dān)子菌間,其mJRLs進(jìn)化存在由于生存環(huán)境、方式相似而在長(zhǎng)期適應(yīng)過(guò)程中所形成的蛋白功能相近的趨同進(jìn)化現(xiàn)象;而親緣關(guān)系較近的子囊菌和擔(dān)子菌間,其mJRLs進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),則預(yù)示著子囊菌與擔(dān)子菌由共同的真菌祖先在適應(yīng)于不同的生存環(huán)境、方式過(guò)程中，其mJRLs可能向著蛋白功能相互有別的方向發(fā)展而趨異進(jìn)化．

2.4Fv-mJRL1基因及其潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的共表達(dá)分析

W23基因組注釋獲取Fv-mJRL1基因上游調(diào)控序列為964 bp,通過(guò)裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的YEASTRACT數(shù)據(jù)庫(kù)在線預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示,上游調(diào)控序列啟動(dòng)子中共存在22類(lèi)順式作用元件,其中可結(jié)合APSES類(lèi)型[14]轉(zhuǎn)錄因子(Mbp1)的順式作用元件共3個(gè)．我們獲取酵母Mbp1的蛋白序列與金針菇蛋白質(zhì)組進(jìn)行同源比對(duì),所獲取金針菇中的同源蛋白在真菌轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)再次進(jìn)行同源搜索驗(yàn)證后,將其命名為Fv-Mbp1．

qRT-PCR結(jié)果(圖4(a))顯示：以葡萄糖培養(yǎng)條件為對(duì)照,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加稻草和木屑進(jìn)行培養(yǎng),稻草培養(yǎng)的條件下其表達(dá)量?jī)H略高于木屑培養(yǎng)條件,可能由于稻草和木屑中含有大量成分不清晰的木質(zhì)纖維素造成比較結(jié)果相對(duì)不明晰,但均明顯高于表達(dá)量甚低的葡萄糖培養(yǎng)條件,在葡萄糖、稻草及木屑液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)過(guò)程表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.956(極強(qiáng)相關(guān))．同時(shí),以未扭結(jié)菌絲作為對(duì)照,在出菇實(shí)驗(yàn)中該基因在菌絲扭結(jié)時(shí)期的表達(dá)量顯著高于未扭結(jié)菌絲、菌皮、子實(shí)體原基(初期、中期、后期)、伸長(zhǎng)期和成熟期子實(shí)體等階段(圖4(b)),是菌絲期(未扭結(jié))的62.3倍,在正常出菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.968(極強(qiáng)相關(guān))．本研究還揭示了轉(zhuǎn)錄因子基因Fv-Mbp1與Fv-mJRL1基因具有緊密的共表達(dá)規(guī)律,它們?cè)诓煌瑮l件下的共表達(dá)模式,均進(jìn)一步支持Fv-Mbp1與Fv-mJRL1存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系．

(a)不同培養(yǎng)條件：GL.葡萄糖；RS.稻草；SD.木屑.(b)不同發(fā)育階段：myc.菌絲期；knot.扭結(jié)；myd.菌皮；pre-pri.原基初期;pri.原基中期；late-pri.原基后期；eln.伸長(zhǎng)期；mat.成熟期.圖4　Fv-mJRL1基因及其轉(zhuǎn)錄因子基因Fv-Mbp1表達(dá)變化Fig.4The expression changes of Fv-mJRL1 and its transcription factor gene Fv-Mbp1

3討論

金針菇凝集素Fv-mJRL1基因的生物信息學(xué)分析顯示,其上游序列存在較多順式作用元件,表明其表達(dá)可受眾多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控．Fv-mJRL1蛋白結(jié)構(gòu)域中散布著部分保守的氨基酸殘基,共38個(gè)非極性氨基酸，占結(jié)構(gòu)域氨基酸組成的41.8%,對(duì)凝集素肽鏈折疊和聚合所發(fā)揮的生物學(xué)作用起關(guān)鍵作用,它的合成受到生物或非生物脅迫刺激的誘導(dǎo)表達(dá)[14-15]．同時(shí),Fv-mJRL1蛋白存在著眾多功能修飾位點(diǎn),鑒于其基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析,與胞內(nèi)糖基的結(jié)合在其功能鑒定中顯得尤為重要,其中頸環(huán)位點(diǎn)BL1、BL2決定著其糖基結(jié)合的特異性,BL3具有較強(qiáng)的保守性但不能決定糖基的特異性[16]．所預(yù)測(cè)存在的磷酸化位點(diǎn)為Fv-mJRL1激酶信號(hào)通路研究提供了參考,但劉芳等[17]研究發(fā)現(xiàn)AGC/PKA 蘇氨酸蛋白激酶的基因只在金針菇菌絲生長(zhǎng)中特異表達(dá)而原基時(shí)期并不表達(dá),表明Fv-mJRL1基因在原基形成時(shí)期表達(dá)并不受AGC/PKA 激酶信號(hào)通路影響．此外,Fv-mJRL1存在4個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn),豆蔻?；饔每梢源龠M(jìn)蛋白質(zhì)-膜間和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用[18],但是豆蔻?；稽c(diǎn)的甘氨酸點(diǎn)突變可引起蛋白功能、定位及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生異常[19],這對(duì)于后期研究Fv-mJRL1的功能靶向研究有著指導(dǎo)性意義．

目前,對(duì)于mJRLs的研究主要集中探索脅迫誘導(dǎo)型mJRLs的功能及其作用的分子機(jī)制[20]、參與生物體內(nèi)O-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)和N-糖基等內(nèi)源糖基互作翻譯后修飾的功能[21]、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制[22-23],從而用于育種改良．本研究中Fv-mJRL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,子囊菌與擔(dān)子菌間mJRL趨異進(jìn)化而植物與擔(dān)子菌間mJRL趨同進(jìn)化,預(yù)示著Fv-mJRL蛋白功能方面可能與植物mJRL較為趨近,與植物的細(xì)胞功能、生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系更為密切,而與子囊菌mJRL在生存方式所發(fā)揮的功能有一定的差異．

根據(jù)本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)Fv-mJRL1基因及其潛在的APESE型轉(zhuǎn)錄因子基因Fv-Mbp1的共表達(dá)分析,兩者存在著較強(qiáng)的共表達(dá)關(guān)系，表明Fv-Mbp1作為Fv-mJRL1基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子的可能性很大．內(nèi)源甘露糖結(jié)合型凝集素Fv-mJRL1基因可能在金針菇子實(shí)體原基形成及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中作為胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分,對(duì)菌絲扭結(jié)和原基形成階段具有重要作用．據(jù)Doedt等[24]報(bào)道APSES型轉(zhuǎn)錄因子不僅參與形態(tài)的變化,也強(qiáng)烈影響代謝基因的表達(dá),例如誘導(dǎo)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),并抑制氧化代謝相關(guān)基因的表達(dá),這也進(jìn)一步佐證在葡萄糖、稻草、木屑基質(zhì)中Fv-Mbp1潛在調(diào)控著Fv-mJRL1基因表達(dá),并可能參與稻草和木屑的降解．在小麥中,mJRL凝集素(VER2)在春化作用中能夠通過(guò)自身的磷酸化與去磷酸化反應(yīng)參與O-GlcNAc信號(hào)途徑[23-24];冷激及機(jī)械等非生物脅迫作為金針菇出菇的一般方法,結(jié)合生物信息學(xué)分析,我們推測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的Fv-mJRL1可能存在與小麥凝集素VER2類(lèi)似的分子作用機(jī)制.當(dāng)金針菇菌絲生長(zhǎng)受到外界脅迫刺激時(shí),信號(hào)受體將接收不同的外界信號(hào),可由相應(yīng)的通路激酶激活潛在的轉(zhuǎn)錄因子Fv-Mbp1,啟動(dòng)Fv-mJRL1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,通過(guò)與甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺或其糖蛋白互作,進(jìn)而影響金針菇菌絲扭結(jié)及原基形成的生物學(xué)過(guò)程．當(dāng)然,后期仍需下游分子實(shí)驗(yàn)(如凝膠阻滯遷移和pull-down等)對(duì)所篩選潛在的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步建立基因或蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)．

食用菌的遺傳轉(zhuǎn)化率低在一定程度上牽制著其分子生物學(xué)研究的水平,組學(xué)和生物信息學(xué)結(jié)合可為食用菌基礎(chǔ)理論研究提供便利．對(duì)于食用菌子實(shí)體形成與發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制的研究,可借助組學(xué)數(shù)據(jù)迅速篩選目的基因及共表達(dá)分析發(fā)掘潛在的調(diào)控基因表達(dá)的“分子開(kāi)關(guān)”(轉(zhuǎn)錄因子),初步獲得基因時(shí)空特異性表達(dá)調(diào)控變化規(guī)律．

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Bioinformatic Analysis and Co-expression Study of Jacalin-related Lectin Gene Fv-mJRL1 in Flammulina velutipes

CHEN Renliang,WANG Wei,YAN Junjie,XIONG Hongmin,XIE Baogui*

(Mycological Research Center,College of Life Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Jacalin-related lectins (JRLs) are a subgroup of proteins with one or more jacalin-like lectin domains,and they participate in biological or non-biological response to environmental stimuli．The Flammulina velutipes genomic data were used to screen one lectin gene Fv-mJRL1,and the gene structure and protein properties of biological information were analyzed．The potential transcription factor Fv-Mbp1 was further predicted using its upstream regulatory sequence．Fluorescence quantitative RT-PCR analysis showed that Fv-mJRL1 and the transcription factor gene Fv-Mbp1 were strongly co-expressed,whatever growth in different substances of F. velutipes mycelium or in the various growth developmental stages． Results demonstrated that bioinformatics and qRT-PCR analysis were suitable for the screening of potential transcription factors,however,it is still necessary to use further downstream molecular experiments to verify the data.

Key words:jacalin-related lectin(JRL);sporophore formation;potential transcription factor;Pearson correlation coefficient

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2016.03.004

收稿日期：2015-09-14錄用日期：2015-12-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2014CB138302)

*通信作者：mrcfafu@163.com

中圖分類(lèi)號(hào):Q 933

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438-0479(2016)03-0323-07

引文格式：陳仁良,王威,嚴(yán)俊杰，等.金針菇凝集素基因Fv-mJRL1的生物信息學(xué)分析及其共表達(dá).廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016,55(3)：323-329.

Citation：CHEN R L,WANG W,YAN J J,et al．Bioinformatic analysis and co-expression study of jacalin-related lectin geneFv-mJRL1 inFlammulinavelutipes.Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(3)：323-329．(in Chinese)