張帥瀅，韋蘭蘭，張　穎，何　佳,2，王大紅,2

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023;2.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

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納他霉素高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化

張帥瀅1，韋蘭蘭1，張穎1，何佳1,2，王大紅1,2

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023;2.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

摘要：以納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)4.3505為出發(fā)菌株，以紫外線作為誘變方法，篩選抗乙酸鈉高產(chǎn)納他霉素的突變菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，篩選誘導(dǎo)子及添加工藝。研究結(jié)果表明：高產(chǎn)突變菌株為納塔爾鏈霉菌HW-2，其納他霉素產(chǎn)量在發(fā)酵120 h后達(dá)到452.2 mg/L，比原始菌株提高了242.6%，該菌株遺傳性能穩(wěn)定。納塔爾鏈霉菌HW-2生產(chǎn)納他霉素最佳發(fā)酵條件：接種量為發(fā)酵液總體積的6%，250 mL三角瓶裝液量為30 mL，初始pH值為7.5。乙酸鈉為最佳前體物質(zhì)，乙酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，添加時間為發(fā)酵后24 h。

關(guān)鍵詞：納塔爾鏈霉菌；納他霉素；菌株選育；發(fā)酵條件

0引言

納他霉素(natamycin，也稱匹馬菌素)是由褐黃孢鏈霉菌(Streptomycesgilvosporeus)、納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)和恰塔努加鏈霉菌(Streptomyceschattanoogensis)等菌株產(chǎn)生的一種能有效抑制真菌生長和真菌毒素產(chǎn)生的二十六元環(huán)多烯類抗真菌抗生素[1]，具有低劑量、高效率和高安全性等特點。該物質(zhì)無抗細(xì)菌活性，與乳酸鏈球菌肽結(jié)合使用可起到很好的防腐作用[2]。因此，1982年，美國食品和藥物管理局正式批準(zhǔn)納他霉素可以用作食品防腐劑。1997年，中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)納他霉素可以用作食品防腐劑[3]。

雖然納他霉素在食品原料保鮮和成品防腐方面的應(yīng)用顯示了良好前景，但是因成本太高而限制了其使用。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)納他霉素是一個很好的發(fā)展方向。工業(yè)上納他霉素的生產(chǎn)菌主要為納塔爾鏈霉菌和褐黃孢鏈霉菌[4]。國外關(guān)于納他霉素發(fā)酵方面的研究比較深入和成熟[5]，文獻(xiàn)[6]報道了連續(xù)發(fā)酵法可使納他霉素產(chǎn)量達(dá)6～12 g/L。國內(nèi)的學(xué)者也做了相關(guān)的研究工作[7-8]，對褐黃孢鏈霉菌研究較多，而對納塔爾鏈霉菌的菌株選育研究較少[9]。因此，本文主要根據(jù)納他霉素的生物合成途徑，篩選抗乙酸鈉的高產(chǎn)突變菌株，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1材料

納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)4.3505，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司生產(chǎn)；蛋白胨、酵母粉、麥芽浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨，購于北京奧博星公司；葡萄糖、乙酸鈉、丙酸鈉，國藥集團(tuán)生產(chǎn)。

試驗儀器：高效液相色譜(HPLC1260)，安捷倫公司；LS-B50型滅菌器，上海博迅設(shè)備廠；HYL-C型恒溫?fù)u床，江蘇太倉強(qiáng)樂實驗設(shè)備廠。

納塔爾鏈霉菌培養(yǎng)基分為平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10 g/L，麥芽浸粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，瓊脂20 g/L，水1 L，pH7.0。種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，氯化鈉10 g/L，水1 L，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖30 g/L，酵母浸膏2 g/L，牛肉膏10 g/L，水1 L，pH7.0。

1.2方法

1.2.1納塔爾鏈霉菌培養(yǎng)及孢子懸液的制備

將S.natalensis4.3505接種于斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察其生長情況。取斜面試管中生長較好的菌種，加入10 mL已經(jīng)滅過菌的生理鹽水，將孢子振蕩洗下，然后倒入50 mL滅過菌的含有玻璃珠的三角瓶中，用振蕩器振蕩30 min后過濾，將溶液的孢子濃度調(diào)至108個/mL。

1.2.2納他霉素的發(fā)酵和菌體生物量的測定

將培養(yǎng)48 h的納他霉素種子培養(yǎng)基以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)108 h。發(fā)酵結(jié)束后取3 mL發(fā)酵液置于已知質(zhì)量的5 mL干燥離心管中，10 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀中再加入3 mL去離子水洗滌沉淀2次，棄上清留沉淀后將沉淀置于65 ℃的烘箱內(nèi)干燥8 h，稱質(zhì)量。

1.2.3納他霉素含量的測定

取2 mL發(fā)酵液和18 mL甲醇混合，搖床上充分振蕩2 h后，10 000 r/min離心10 min，吸取離心后的上清液，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，過濾液即為待測液。

色譜柱：型號為YMC-Pack ODS C18，柱長250 mm，柱直徑4.6 mm，流動相為V(水)∶V(甲醇)=35∶65，流速為0.8 mL/min，檢測波長λ=304 nm。

1.2.4高產(chǎn)納他霉素菌株的選育

(1)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對菌體生成的影響

制備含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液(0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.15%和0.20%)的平板培養(yǎng)基，將制備好的0.2 mL孢子懸液分別涂布于平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。觀察不同平板培養(yǎng)基上的菌落生長情況，確定乙酸鈉對該菌的最低抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)納塔爾鏈霉菌的紫外線誘變處理

取濃度為108個/mL的孢子懸液10 mL置于直徑為9 cm的已滅菌的培養(yǎng)皿中，在距15 W紫外燈30 cm處進(jìn)行不同時間的照射 (照射時間分別為5 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s和60 s)，同時均勻攪拌。對每個樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋度為10-4、10-5和10-6的菌懸液0.2 mL，將其涂布在平板培養(yǎng)基上，每個梯度進(jìn)行3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)，7 d后計算菌落數(shù)，統(tǒng)計致死率并確定誘變時間。

(3)高產(chǎn)菌株的篩選

選擇最佳誘變時間處理菌懸液0.2 mL，將其涂布于含有最低抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙酸鈉平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d，觀察菌落生長狀況。待菌落長出后，將菌落分別接種于斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7～10 d，測定其發(fā)酵性能。

1.2.5高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗

將誘變獲得的抗乙酸鈉高產(chǎn)菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，經(jīng)發(fā)酵測定其納他霉素的產(chǎn)量，觀察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6發(fā)酵條件的優(yōu)化和前體物質(zhì)的篩選

分別考察接種量、溶氧和初始pH值對納他霉素產(chǎn)生的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸鈉、丙酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的乙醇、正丁醇、乳酸、檸檬酸和異丁醇作為前體添加物，篩選出最佳前體物質(zhì)，并對添加量和添加時間進(jìn)行了優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對菌體生成的影響

根據(jù)納他霉素的生物合成途徑，二碳和三碳小分子物質(zhì)為其生物合成的前體，但前體也具有一定的毒性，濃度越大，其毒性越強(qiáng)。因此，通過測定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對菌體生長的影響，確定最低抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。從表1中可以看出：0.15%乙酸鈉能夠完全抑制納塔爾鏈霉菌的生長。

表1　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對菌體生長的影響

圖1　紫外線照射時間對納塔爾鏈霉菌致死率的影響

2.2紫外線照射時間的確定

在一定的范圍內(nèi)，照射時間越長，微生物突變率也越高，但超過此范圍時，突變率將下降。本研究采用紫外線照射，照射距離為30 cm，照射時間分別為5 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s和60 s，以不經(jīng)過紫外照射的菌株為對照。不同紫外線照射時間對納塔爾鏈霉菌致死率的影響結(jié)果見圖1。

致死率過高或過低都不利于誘變菌株的篩選，一般致死率為85%～90%效果較好[10]，菌株的正突變概率較高，有利于突變株的進(jìn)一步篩選。從圖1中可以看出：照射時間為50 s時，納塔爾鏈霉菌的致死率為87.10%，處于85%～90%區(qū)間內(nèi)，所以選擇最佳誘變時間為50 s。

2.3紫外線照射誘變結(jié)果

經(jīng)過紫外線照射誘變，共獲得56株突變菌株，經(jīng)過發(fā)酵性能測試，其中5株菌株出現(xiàn)了正突變，分別命名為HW-2、HW-8、HW-10、HW-12和HW-26。5株突變菌株的納他霉素產(chǎn)量如表2所示。由表2可知：5株誘變菌株與親本的納他霉素產(chǎn)量相比，HW-2產(chǎn)量最高，為452.2 mg/L。

表2　5株突變菌株的納他霉素產(chǎn)量　mg/L

2.4突變菌株遺傳穩(wěn)定性研究

為了觀察篩選到的高產(chǎn)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對誘變選育的5株菌株分別進(jìn)行傳代，共傳5代，結(jié)果見表3。由表3可以看出：HW-2、HW-12和HW-26菌株遺傳性比較穩(wěn)定，其中，HW-2菌株納他霉素產(chǎn)量基本維持在450 mg/L左右，說明突變菌HW-2具有較好的遺傳穩(wěn)定性，而HW-8和HW-10菌株的遺傳穩(wěn)定性較差。

表3　高產(chǎn)突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗

圖2　納塔爾鏈霉菌突變菌株HW-2的發(fā)酵過程曲線

2.5納他霉素?fù)u瓶發(fā)酵過程曲線

對納塔爾鏈霉菌HW-2的發(fā)酵時間進(jìn)行了考察，在發(fā)酵第1～7天，分別檢測納他霉素和細(xì)胞生長的變化，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出：納他霉素的產(chǎn)量從第2天到第6天快速上升，第6天時，產(chǎn)量上升到513 mg/L。但是隨著發(fā)酵時間的延長，納他霉素產(chǎn)量下降。因此，納他霉素的最佳發(fā)酵時間是6 d。而發(fā)酵液中納塔爾鏈霉菌的菌體質(zhì)量濃度在第4天時達(dá)到最大值62 g/L。

2.6發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.6.1接種量

接種量的大小與菌種特性和發(fā)酵條件等有關(guān)，不同微生物發(fā)酵的接種量有所不同。將種子液分別按體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 d后測定納他霉素的產(chǎn)量，結(jié)果見表4。

表4　接種量對納他霉素產(chǎn)量的影響

由表4可以看出：不同接種量對菌體產(chǎn)納他霉素的影響很大。菌體的生長需要一定的密度，接種量小會導(dǎo)致菌體生長緩慢，菌體生長會消耗掉大量營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響了納他霉素的產(chǎn)量；接種量大會使菌體生長過快，導(dǎo)致菌體過早衰老，也會影響納他霉素的產(chǎn)量。接種量在6%(體積分?jǐn)?shù))時，納他霉素的產(chǎn)量最大，達(dá)531 mg/L。

2.6.2溶氧

納塔爾鏈霉菌是好氧菌，氧氣對菌體生長和納他霉素產(chǎn)生的影響很大。在固定搖床轉(zhuǎn)速條件下，設(shè)置不同的搖瓶裝液量，導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解氧不同，納他霉素的產(chǎn)量會不同。表5為溶氧對納他霉素產(chǎn)量的影響。由表5可以看出：當(dāng)250 mL三角瓶中裝液量為30 mL時，納他霉素產(chǎn)量達(dá)到最大值830 mg/L。

表5　溶氧對納他霉素產(chǎn)量的影響

2.6.3初始pH值

在250 mL三角瓶中裝入28.2 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將培養(yǎng)基pH值調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，接入1.8 mL種子液，培養(yǎng)6 d后，測定納他霉素的產(chǎn)量。結(jié)果如表6所示。

表6　初始pH值對納他霉素產(chǎn)量的影響

從表6可以看出：初始pH值在7.5時，納他霉素的產(chǎn)量最高，達(dá)885 mg/L。但隨著初始pH值的進(jìn)一步升高，納他霉素產(chǎn)量開始下降。這可能是因為在不同的pH值條件下，納他霉素合成途徑中一些關(guān)鍵酶的活性不同。所以在納他霉素發(fā)酵時，應(yīng)將初始pH值控制在7.5。

2.7前體物質(zhì)對納他霉素產(chǎn)量的影響

表7　不同前體物質(zhì)對納他霉素合成的影響　 mg/L

2.7.1不同前體物質(zhì)對納他霉素產(chǎn)量的影響

根據(jù)納他霉素的生物合成途徑，本試驗選用乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、正丁醇、乳酸、檸檬酸和異丁醇作為前體添加物，在發(fā)酵時按0.1%的比例分別加入，采用上文已優(yōu)化的發(fā)酵條件，發(fā)酵6 d，納他霉素產(chǎn)量如表7所示。由表7可知：添加乙酸鈉或丙酸鈉后，納他霉素產(chǎn)量有顯著的提高，其中以乙酸鈉效果最好，產(chǎn)量達(dá)到1 150 mg/L，比對照提高了35%。因此試驗最終選用乙酸鈉為前體物質(zhì)。

2.7.2乙酸鈉添加量和添加時間對納他霉素產(chǎn)量的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%的乙酸鈉，發(fā)酵6 d后檢測納他霉素的產(chǎn)量，結(jié)果如表8所示。從表8可以看出：在乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%時，納他霉素的產(chǎn)量最高，達(dá)到1 380 mg/L。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.20%時，納他霉素的產(chǎn)量卻降低，這主要是因為大量的乙酸鈉會對菌體造成一定的毒性，導(dǎo)致納他霉素的產(chǎn)量降低，乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，其毒性越大。因此，最終選擇乙酸鈉添加量為0.20%。

分別在發(fā)酵培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h時加入0.20%乙酸鈉，發(fā)酵6 d后檢測納他霉素的產(chǎn)量，結(jié)果如表9所示。由表9可看出：在發(fā)酵24 h時添加乙酸鈉效果最好，納他霉素的產(chǎn)量最高，達(dá)到了1 550 mg/L。因此，本試驗選擇在發(fā)酵24 h時添加0.20%乙酸鈉。

表8　乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納他霉素產(chǎn)量的影響

表9　乙酸鈉添加時間對納他霉素產(chǎn)量的影響

3討論

近年來，以乳酸鏈球菌素和納他霉素為代表的生物防腐劑受到全球市場的青睞，有逐漸替代化學(xué)防腐劑的趨勢。目前，納他霉素的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法。中國對于納他霉素的研究始于1995 年，研究者分別采用了菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和真菌誘導(dǎo)等方式來提高納他霉素的產(chǎn)量[11-13]，但與國外報道的產(chǎn)量相比，還有一定的差距。除此之外，采用物理方法和化學(xué)方法對微生物菌種進(jìn)行選育也是最普遍的方法，并結(jié)合抗生素、前體和結(jié)構(gòu)類似物等篩選劑進(jìn)行選擇性篩選[14]。文獻(xiàn)[15-16]分別采用亞硝基胍和紫外線對納他霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行選育，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，均獲得了較好的效果。

納他霉素的生物合成途徑可以分解為活化前體(乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A)的生成、大環(huán)內(nèi)酯的生物合成和氨基糖的形成，二碳和三碳類物質(zhì)是該物質(zhì)的前體(如乙酸、丙酸和丁醇等)，但過量的前體物質(zhì)嚴(yán)重影響S.natalensis的生長和納他霉素的生物合成[17]，因此，選育耐前體突變株是提高納他霉素產(chǎn)量的有效方法。本文采用紫外誘變與乙酸鈉抗性篩選相結(jié)合的方法，篩選到一株遺傳性能穩(wěn)定的納他霉素高產(chǎn)菌株S.natalensisHW-2，并采用搖瓶發(fā)酵試驗得出篩選到的菌種性能比原始菌株提高了2倍，使原菌種生產(chǎn)納他霉素的能力提高，而且該突變株更能夠耐受乙酸鈉。研究了S.natalensisHW-2發(fā)酵過程曲線，優(yōu)化了該菌的發(fā)酵條件。探討了不同的前體物質(zhì)對納他霉素生物合成的影響，認(rèn)為乙酸鈉為最佳前體物質(zhì)，并優(yōu)化了乙酸鈉的添加時間和添加量。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和前體物質(zhì)的添加，有效地提高了納他霉素的產(chǎn)量。雖然本研究所采用的抗乙酸鈉篩選方法有一定的效果，但未考慮其他生物途徑中其他前體物質(zhì)對納他霉素生物合成的影響，在高產(chǎn)菌的篩選上存在著一定的局限性，并且誘變后菌株出現(xiàn)正突變的概率比較小。因此，今后可以選用化學(xué)方法誘變或者物理化學(xué)復(fù)合誘變的方法來提高納他霉素的產(chǎn)量。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(3140101119)

作者簡介：張帥瀅(1992-),男,河南鞏義人,碩士生;何佳(1965-),男,河南洛陽人,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要研究方向為發(fā)酵工程.

收稿日期：2016-01-21

文章編號：1672-6871(2016)04-0081-06

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.04.017

中圖分類號：TQ927;Q939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A