李靜萍　蓋晉宏

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院　山東 濰坊　261061）

?

用PCR法從山東省某屠宰場屠宰鴕鳥體內(nèi)分離滑膜炎支原體的研究

李靜萍蓋晉宏

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院山東 濰坊261061）

摘要滑膜炎支原體常常引起禽類呼吸道疾病和關(guān)節(jié)炎，與病毒、細(xì)菌混合感染，導(dǎo)致呼吸道癥狀加重，死亡率增高，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失；53份屠宰鴕鳥的肺和氣管分別用PCR法和微生物檢測法進(jìn)行分離、鑒定。通過對支原體16SrRNA基因的特異性擴增（163和207堿基片段），PCR法檢出25份陽性，微生物法檢出17份陽性。本研究表明PCR法是快速、高效鑒定鴕鳥感染滑膜炎支原體的檢測方法。

關(guān)鍵詞滑膜炎支原體PCR微生物檢驗法

支原體（Mycoplasmas）是一類介于細(xì)菌和病毒之間的無細(xì)胞壁原核生物。當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)中，常見禽支原體病為雞毒支原體（Mycoplasma Gallisepticum， MG）、雞滑膜炎支原體（Mycoplasma synoviae， MS）和火雞支原體（Mycoplasma meleagridis， MM）三種類型。雞毒支原體主要引起雞的慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease，CRD）繼發(fā)感染后容易引發(fā)嚴(yán)重的氣囊炎［1］。雞滑膜炎支原體主要引起雞的亞臨床呼吸道感染，但是當(dāng)混合感染新城疫（ND）或者傳染性支氣管炎（IB）時，可引起氣囊感染［2］；有時候，滑膜炎支原體也可以引起雞和火雞的關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為滑膜炎、腱鞘炎和滑膜炎，支原體感染引起的跛行和呼吸困難導(dǎo)致生長速度下降和產(chǎn)蛋量下降?；痣u支原體（Mycoplasma meleagridis， MM）主要發(fā)生在火雞，表現(xiàn)為氣囊炎和骨骼發(fā)育畸形。支原體可以經(jīng)卵傳播，感染支原體的種禽，其種蛋孵化率和雛雞成活率均會出現(xiàn)明顯降低。定期檢測，快速確診，并及時清除陽性種禽，是防止支原體散播的有效措施。實驗室診斷起著十分重要的作用，但是支原體菌體較小、形態(tài)多樣、培養(yǎng)要求高、生長緩慢以及支原體種屬之間交叉抗原存在等特性，限制了微生物培養(yǎng)法和血清學(xué)方法在支原體檢測中的應(yīng)用［3］。PCR技術(shù)是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的體外擴增方法，比培養(yǎng)法快速、靈敏、簡便。對難以用培養(yǎng)法和血清學(xué)方法檢測的支原體，PCR技術(shù)更顯其優(yōu)越性。

應(yīng)用滑膜炎支原體特異性PCR法和微生物檢測法從山東省某屠宰場屠宰鴕鳥肺和氣管樣品中分離滑膜炎支原體，通過2種方法的比較，確定最佳檢測方法。

1　材料與方法

1.1樣品采集與運送

采用多重隨機抽樣法，無菌采集53份屠宰鴕鳥肺，以PPLO為介質(zhì)，4℃保存，12h內(nèi)送往實驗室。

1.2分離培養(yǎng)

1.2.1材料與方法（1）MS平板凝集抗原及抗血清購自中國獸藥監(jiān)察所。（2）培養(yǎng)基制備 MS培養(yǎng)液由PPLO肉湯，10%豬血清，5%新鮮酵母提取液，0.02%NAD組成。

1.2.2分離培養(yǎng)將肺剪成2～3mm2小塊，置入液體培養(yǎng)基中，加蓋，置于37℃培養(yǎng)，24h后除去嚴(yán)重渾濁和產(chǎn)氣者（瓶蓋被崩開），液體變黃者按1∶5的比例移植于新鮮培養(yǎng)基內(nèi)，和未變色者一起繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)3～4次，液體不出現(xiàn)變化者棄掉，出現(xiàn)變化者同時移入固體培養(yǎng)基，5～7d后觀察有無菌落生長，若有可疑菌落則挑取后繼續(xù)接種液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，直至得到特征性的純化菌落。

1.3平板凝集試驗

在載玻片上滴加幾滴生理鹽水，沾取疑似菌落與生理鹽水混合（如果出現(xiàn)自動凝集或者懸浮物渾濁，將載玻片廢棄）。將50ul滑膜炎支原體陽性血清和菌落懸浮液混合，如果在1～2min中內(nèi)出現(xiàn)凝集，則確定為滑膜炎支原體。

1.4DNA提取

將1.0ml對數(shù)生長末期的液體培養(yǎng)物置于1.5ml離心管中，13000r/min低溫離心30min，用0.15ml/L PBS（pH=7.2）洗滌2次；用600mlTE緩沖液重懸沉淀，然后加10% SDS 30μl和20mg/ml的蛋白酶K 3μl，輕輕混勻后于37℃過夜；加入10mg/ml的RNAase5μl，56℃孵育60min；用等體積酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）抽提，10000r/min低溫離心5min，取上清液移入另一離心管中，加入等量純氯仿，然后13000r/min離心5min。將上清液移入一支新離心管中，加入1/10的3mol/L醋酸鈉和2倍數(shù)體積的無水乙醇，-20℃過夜；低溫離心，10000r/min，10min，棄上清液；用200μl 70%的乙醇洗滌沉淀，低溫離心，10000r/min，15min，然后56℃烘干；用2μlTE緩沖液溶解結(jié)晶，4℃保存。

1.5PCR擴增

1.5.1引物合成根據(jù)GenBank中公布的滑膜炎支原體的基因序列，應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計如下2對特異性引物（表1），均由SPAFAS公司合成。

表1　用于鑒定滑膜炎支原體的引物核苷酸序列

1.5.2反應(yīng)體系及條件見表2。

表2　PCR反應(yīng)體系

擴增條件為：94℃預(yù)變性5min，95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。

1.6PCR產(chǎn)物的電泳檢測

10μl擴增產(chǎn)物加2μl載樣液，在80V電壓，1%的凝膠上進(jìn)行電泳。凝膠內(nèi)加入0.1%溴乙啶（0.5μg/0.1ml）。電泳液為TBE緩沖液。紫外線燈下顯示擴增結(jié)果，并一次成像拍照。

1.7PCR反應(yīng)特異性和靈敏性檢測

1.7.1PCR反應(yīng)靈敏性檢測取滑膜炎支原體模板DNA樣品，測初始濃度為275ng/μl，用無菌去離子水依次作10的倍比稀釋，采用PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴增。以16SrRNA基因設(shè)計的引物進(jìn)行擴增結(jié)果，其敏感性達(dá)2.75 ×10-8ng/μl。

1.7.2PCR反應(yīng)特異性檢測應(yīng)用滑膜炎支原體、雞毒支原體、沙門氏菌的DNA和超純水，分別作為PCR反應(yīng)模板，在上述試驗確定的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR的特異性試驗。只有滑膜炎支原體擴增出特異性條帶，而其他的均未見條帶。

2　結(jié)論

2.1細(xì)菌學(xué)

本試驗中，53份鴕鳥肺樣品，經(jīng)PPLO固體培養(yǎng)特殊培養(yǎng)，檢出17份陽性樣品。

圖1　PCR擴增結(jié)果M，DNA Marker；（+），陽性（-），陰性；1-8，樣品

圖2　PCR擴增結(jié)果M，DNA Marker；（+），陽性；（-），陰性；1-8，樣品

2.2PCR反應(yīng)

支原體在肉湯培養(yǎng)基上生長，導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色變化或因為支原體的生長代謝引起培養(yǎng)基渾濁。53份疑似樣品經(jīng)PCR檢測，25份樣品檢測結(jié)果為支原體陽性，且都在支原體核酸的163bp區(qū)域顯示特異性擴增（如圖1）。25份陽性樣品經(jīng)PCR分析，13份樣品檢出滑膜炎支原體檢出率為52%（如圖2）。用微生物培養(yǎng)法對53份樣品進(jìn)行檢測，17份樣品檢測結(jié)果為陽性。兩種方法檢測結(jié)果對比顯示見表2。

表2　53份樣品PCR病原學(xué)檢測和微生物學(xué)檢測結(jié)果比較?。?）

研究表明，屠宰的臨床檢查健康的鴕鳥肺分離到滑膜炎支原體，表明鴕鳥可以感染滑膜炎支原體。

3　討論

（1）本研究采用PCR病原學(xué)和微生物培養(yǎng)檢測，從屠宰場屠宰鴕鳥體內(nèi)分離到滑膜炎支原體，證實了鴕鳥感染滑膜炎支原體。（2）在病原分離過程中，病料采集和培養(yǎng)條件都非常難，而且耗時長，以致在臨床上很難分離到MS。此項研究對某屠宰廠屠宰鴕鳥利用ELISA進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，對其中的陽性、陰性鴕鳥進(jìn)行肺樣品采集，經(jīng)過處理后進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果表明ELISA血清學(xué)檢測陽性的鴕鳥用PCR檢測結(jié)果同樣為陽性，ELISA血清學(xué)檢測陰性的鴕鳥用PCR檢測結(jié)果亦為陰性，二者的檢測結(jié)果符合率為100%，表明PCR方法可用于MS臨床檢測。PCR檢測是一種對微生物培養(yǎng)和血清學(xué)鑒定法的有效替代或補充。（3）目前，國外許多國家禽支原體診斷試劑盒已研制成功，但多為檢測血清抗體，費用昂貴，不適用于大規(guī)模的檢測。目前國內(nèi)研究建立的多重PCR反應(yīng)能在一個反應(yīng)中同時檢測幾種支原體病原，簡便易行，敏感性高，特異性強，適合大規(guī)模養(yǎng)殖場的疫病監(jiān)測［4］。

參考文獻(xiàn)

［1］ 郭偉娜. 雞毒支原體感染的流行和控制［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2010，31∶ 80-81.

［2］ 劉建設(shè)， 尹遜同. 雞滑液囊支原體病的診療［J］. 山東畜牧獸醫(yī)，2009， 12∶ 91.

［3］ 任杰， 張紹芬， 張映. 3種PCR引物對豬瘟活疫苗中支原體污染的檢測［J］. 中國畜牧獸醫(yī)， 2008， 35（10）∶ 39-42.

［4］ 張磊， 李穎， 王慧. 3種禽支原體多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］. 中國畜牧獸醫(yī)， 2011， 38（8）∶ 77-80.

［5］ Seifi S， Shirzad M. Incidence and risk factors of Mycoplasma synoviae infection in brdiler breeder farms of Iran， Veterinary World J. 2012； 5（5）∶265.

［6］ Whitcomb RF， Gasparich GE， French FE， Tully JG， Rose DL， Carle P，et al.Spiroplasma syrphidicola sp. nov.， from a Syrphid Fly （Diptera∶Syrphidae）. J. Syst. Evol.1996； 46（3）∶ 797-801.

［7］ Salisch H， Hinz KH， Graack HD， Ryll M.A comparison of a commercial PCR-based test to culture methods for detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in concurrently infected chickens.Avian Pathol. 1998； 27（2）∶ 142-7.

中圖分類號：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-1733（2016）06-0004-02

收稿日期：（2016-03-16）