李曉樓

（四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與環(huán)境工程系，遂寧 629000）

噻吩磺隆降解菌Bacillus subtilis LXL-7的分離與應(yīng)用

李曉樓

（四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與環(huán)境工程系，遂寧 629000）

從土壤中分離到一株能高效降解噻吩磺隆的細(xì)菌LXL-7，經(jīng)鑒定LXL-7為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。在含100 mg/L噻吩磺隆的培養(yǎng)基中，菌株LXL-7降解噻吩磺隆的72 h降解率可達(dá)99.6%以上。菌株LXL-7的最適pH為7.5，適宜溫度為30-35℃，該菌還對噻吩磺隆和鹽有很好的耐受性，至少能耐受400 mg/L的噻吩磺隆和4.0%的NaCl。另外，還通過在商品化的土壤微生物改良劑中添加菌株LXL-7開發(fā)了多功能微生物制劑，新制劑除原有功能外還增加了降解噻吩磺隆的新功能，故認(rèn)為菌株LXL-7能夠被用于噻吩磺隆污染的處理以及相關(guān)微生物制劑的開發(fā)。

噻吩磺?。豢莶菅挎邨U菌；生物降解；微生物制劑

噻吩磺隆（thifensulfuron-methyl）屬于磺酰脲類除草劑，商品名為闊葉散，化學(xué)名稱為3-（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）-1-（2-甲氧基甲?；绶?3-基）-磺酰脲。它是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性除草劑，作用靶標(biāo)為植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶（ALS），可有效抑制支鏈氨基酸的合成導(dǎo)致敏感植物停止生長并死亡，能用于防治大多數(shù)闊葉雜草，對禾本科雜草也有一定的抑制效果。噻吩磺隆在農(nóng)林業(yè)及相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用在提高生產(chǎn)效率等方面發(fā)揮了重要作用，但噻吩磺隆或其代謝物的殘留也對生態(tài)環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及人類健康帶來了許多危害，還會對敏感農(nóng)作物產(chǎn)生藥害或傷及一些有益植物，有時甚至?xí)?yán)重影響到下茬作物的正常生長［1-3］。

已有的研究資料表明，磺酰脲類除草劑的降解主要包括光解、化學(xué)水解和微生物降解等多種途徑。Braschi等［4］的研究結(jié)果表明，在中性pH的天然介質(zhì)中磺酰脲類除草劑的降解以微生物降解為主，而在較低pH的酸性介質(zhì)中化學(xué)水解則是最重要的途徑；由于自然環(huán)境下的土壤或水體多在pH6-8的中性條件下，故認(rèn)為在自然條件下微生物的降解作用是磺酰脲類除草劑的主要降解途徑。例如，Andersen等［5］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在深層土壤中磺酰脲類除草劑的降解量很小，顯著低于表層土壤，并認(rèn)為這是由于表層土壤相對于深層土壤含有更豐富的微生物所致；另外，表層能進(jìn)行光解可能也是其原因之一。Jean等［6］發(fā)現(xiàn)在滅菌土壤中噻吩磺隆的降解速率很慢，而在未滅菌的土壤中則能快速降解，故認(rèn)為土壤中的微生物對噻吩磺隆的降解起到了關(guān)鍵作用。截止目前，研究人員已經(jīng)分離到20株以上的噻吩磺隆降解菌株，例如，Hugh等［7］報(bào)道了7種可降解噻吩磺隆的細(xì)菌和放線菌，并對其降解性能進(jìn)行了比較；Geraldine等［8］從土壤中分離到一株能快速降解噻吩磺隆的伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）。但當(dāng)前國內(nèi)外關(guān)于微生物降解噻吩磺隆的研究工作還僅局限于一些降解菌株的分離以及相關(guān)降解特性的測試，還沒有將降解菌株用于噻吩磺隆污染治理的實(shí)踐應(yīng)用。本研究以分離噻吩磺隆高效降解菌為基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究所分離菌株的生理生化特征及應(yīng)用性能，并將其用于開發(fā)多功能的微生物活菌制劑，以期將新制劑用于清除土壤中殘留的噻吩磺隆。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 噻吩磺隆標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich公司（美國），噻吩磺?。ā?8.5%）購自上海市農(nóng)藥研究所，本實(shí)驗(yàn)中所用其它化學(xué)試劑均為分析純或以上級別。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1.0 L，pH7.0。添加噻吩磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基即為噻吩磺隆分離培養(yǎng)基。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉浸出粉4.0 g，酵母浸出粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH7.0。制作培養(yǎng)平板或者斜面時，需加入2.0%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 噻吩磺隆降解菌的分離與鑒定 土壤樣品取自中國四川省遂寧市農(nóng)田，取土耕地使用磺酰脲類除草劑已有5年以上歷史。加2.0 g土樣于 100 mL噻吩磺隆無機(jī)鹽培養(yǎng)基（噻吩磺隆濃度為50 mg/L）中，在35℃下振蕩培養(yǎng)（150 r/min），每隔24 h測定降解效果，取3 d時降解率大于30%的培養(yǎng)液5 mL轉(zhuǎn)接到相同濃度的噻吩磺隆富集培養(yǎng)基中，并連續(xù)轉(zhuǎn)接5次以上。再次驗(yàn)證降解效果后，在噻吩磺隆無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上涂布上述富集培養(yǎng)液，在35℃下倒置培養(yǎng)，挑取生長旺盛的菌落在培養(yǎng)平板上反復(fù)劃線分離以得到純培養(yǎng)物。菌種的生理生化分析參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《Bergey，s Manual of Determinative Bacteriology》［9，10］；菌種的鑒定采用BiologTM微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA序列分析兩種方法進(jìn)行。

1.2.2 培養(yǎng)基及土壤中噻吩磺隆的測定 噻吩磺隆的測定參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法——土壤中13種磺酰脲類除草劑殘留量的測定/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，方法經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)［11］。

樣品前處理流程：（1）取10.0 mL液體樣品（或固態(tài)土壤樣品10.0 g）于100 mL具塞三角瓶中，加入40 mL提取液，加塞后于搖床上振蕩50 min（120 r/min），超聲萃取5 min，布氏漏斗抽濾，濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用提取液清洗、轉(zhuǎn)移并定容至50 mL。取20 mL上述溶液在40℃水浴中減壓濃縮至10 mL，再加10 mL pH2.0的磷酸鹽緩沖液并調(diào)節(jié)終點(diǎn)pH為2.0-3.0，待凈化（提取液：pH7.8的磷酸鹽緩沖液與甲醇等體積混合）。

（2）依次用5 mL甲醇→5 mL水→5 mL提取液預(yù)淋洗固相萃取柱（Oasis HLB：200 mg，6 mL），然后將上述待凈化液上柱，抽干。再用6 mL乙腈洗脫，收集到試管中，40℃下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL流動相進(jìn)行溶解，過0.45 μm濾膜，待測。

液質(zhì)聯(lián)用相關(guān)參數(shù)：處理好的樣液用高效液相色譜—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。流動相：［A相（0.1%甲酸+3 mmol/L甲酸銨），B相（甲醇），50%+50%等度洗脫］，質(zhì)譜采集參數(shù)：［母離子388，子離子141/167，F(xiàn)ragmentor電壓125 V，碰撞氣能量10 V/10 V］。

1.2.3 降解菌接種體的準(zhǔn)備 在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)篩選出的噻吩磺隆降解菌株，采用離心的方式收集菌體（5 000 r/min離心10 min），收集到的菌體用無菌生理鹽水洗滌兩遍后再用無菌水重懸至OD600=1.5，該懸浮液作為后續(xù)降解實(shí)驗(yàn)的接種體。

1.2.4 溫度對菌株LXL-7降解噻吩磺隆的影響 在含噻吩磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（噻吩磺隆濃度100 mg/L，pH7.5）中接種3%的上述接種體，然后置于不同溫度下（25℃-45℃）振蕩培養(yǎng)，每隔12 h以無菌操作方式取樣測定噻吩磺隆殘留濃度及OD600值。

1.2.5 pH對菌株LXL-7降解噻吩磺隆的影響 調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含有100 mg/L噻吩磺?。┑膒H至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，然后分別接種3%的接種體，并在35℃下振蕩培養(yǎng)，定時取樣測定噻吩磺隆降解量及OD600值。

1.2.6 菌株LXL-7對噻吩磺隆的耐受性 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加噻吩磺隆，使其濃度分別為100、200、400、800和1 600 mg/L，再分別接入菌株LXL-7，然后在35℃下振蕩培養(yǎng)，定時取樣測試OD600，用以評價菌株LXL-7對噻吩磺隆的耐受性。

1.2.7 菌株LXL-7對NaCl的耐受性 配制含有不同濃度NaCl的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含有100 mg/L噻吩磺隆），使其中的NaCl含量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%和16.0%，然后在各培養(yǎng)基中接種等量的菌株LXL-7接種體，在35℃下振蕩培養(yǎng)，定時取樣測OD600觀測其生長狀態(tài)，評價菌株LXL-7對NaCl的耐受性。

1.2.8 應(yīng)用菌株LXL-7降解土壤中的噻吩磺隆 土壤樣品取自四川省遂寧市農(nóng)田，分4組，a組：滅菌土壤（121℃下滅菌30 min）；b組：新鮮土壤；c組：滅菌土壤中添加菌株LXL-7；d組：新鮮土壤中添加菌株LXL-7；另外，各組中噻吩磺隆濃度均為100 mg/kg。最后將其置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定噻吩磺隆的濃度。

1.2.9 應(yīng)用菌株LXL-7配制農(nóng)用微生物制劑 應(yīng)用菌株LXL-7改良已有的微生物制劑，使其兼有降解噻吩磺隆的新功能。制備含菌株LXL-7的微生物制劑的過程如下：按照體積比1/10將準(zhǔn)備好的接種體與滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基混合，然后在35℃下以120 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30 h。最后，以HaotianTM微生物制劑（一種商品土壤改良劑）作為載體，在每200 g載體中混入50 mL之前預(yù)先制備的混合液和20 g秸稈粉，混合均勻后，將混合物放在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h（培養(yǎng)期間需適度翻動），再將其放入無菌玻璃瓶中0℃下保存。

應(yīng)用包含菌株LXL-7的微生物制劑降解土壤中的噻吩磺?。禾砑余绶曰锹〉叫迈r土壤中，使噻吩磺隆的濃度為100 mg/kg，然后將土壤分裝在20 cm×30 cm的盒子中，裝土深度為10 cm，并使每個盒子所裝土壤的重量基本一致。15盒土壤被分成3組；a組，添加HaotianTM微生物制劑到土壤中（1 g微生物制劑與30 mL無菌水混合，然后將其全部灑入到一盒土壤中）；b組，包含菌株LXL-7的微生物制劑被添加到土壤中（添加方式同a組）；c組作為對照組（每盒土壤中加30 mL無菌水）。最后將3組土壤置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔6 h翻動一次，并適度補(bǔ)水，每隔24 h取樣測定噻吩磺隆濃度。

2 結(jié)果

2.1 噻吩磺隆降解菌株的鑒定及特性

從農(nóng)田土壤中分離到一株能以噻吩磺隆為唯一碳源和能源的菌株，將其命名為LXL-7。該菌為略有彎曲的桿狀菌，大小為（0.7-0.8）×（2.0-3.0）μm，無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動。革蘭氏陽性菌，芽孢（0.6-0.9）×（1.0-1.5）μm，橢圓或柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。好氧生活，在營養(yǎng)肉湯平板上形成表面粗糙不透明菌落，呈微黃色。淀粉水解、接觸酶、明膠液化實(shí)驗(yàn)及V.P.實(shí)驗(yàn)均呈陽性，而吲哚實(shí)驗(yàn)呈陰性。經(jīng)BiologTM微生物鑒定系統(tǒng)鑒定菌株LXL-7為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（與枯草芽孢桿菌的相似度為99%），鑒定結(jié)果與按照16S分析方法所得到的結(jié)果一致（菌株LXL-7的16S分析委托上海生工公司完成，GenBank登錄號KP125319）。

2.2 溫度和pH對于菌株LXL-7生長及降解噻吩磺隆的影響

菌株LXL-7在30-35℃溫度條件下的生長狀況要優(yōu)于其它溫度條件，在30℃或35℃下培養(yǎng)1-2 d的OD600值顯著高于其它實(shí)驗(yàn)溫度下的測試值（P<0.05）；若溫度為25℃或40℃，菌株LXL-7也能維持較高水平的生長，但45℃時會導(dǎo)致該菌株生長緩慢甚至停止生長（圖1）。在30-40℃溫度范圍內(nèi)，菌株LXL-7降解噻吩磺隆的降解速率變化不顯著（P>0.05），培養(yǎng)3 d后噻吩磺隆（起始濃度100 mg/L）降解率均能達(dá)到99.5%以上；若溫度降至25℃，其起始階段的降解速率會顯著降低，但3 d降解率仍可達(dá)到99.5%（圖2）。

圖1 溫度對菌株LXL-7生長的影響

圖2 溫度對菌株LXL-7降解噻吩磺隆的影響

微生物的生長狀況及降解能力等通常會受到pH值的影響，因此在不同pH值的培養(yǎng)基中測試了菌株LXL-7的噻吩磺隆降解能力，結(jié)果表明，pH值為7.5時，菌株LXL-7的生長量大于其它pH條件下的生長量（圖3）；而適宜于菌株LXL-7降解噻吩磺隆的pH值為7.0-8.0，當(dāng)pH值為6.0或6.5時，其降解起始速率有較明顯的降低，但其3 d降解率并未下降，達(dá)到99.6%（圖4）。另外，在5種不同的供試pH條件下，菌株LXL-7降解噻吩磺隆的3 d降解率都可達(dá)到99.6%以上（圖4）。

圖3 pH對菌株LXL-7生長的影響

圖4 pH對菌株LXL-7降解噻吩磺隆的影響

2.3 噻吩磺隆濃度對菌株LXL-7生長的影響

我國糧食作物主要為水稻、小麥、玉米、大豆等，因而近紅外光譜技術(shù)在這些農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用較為廣泛。本文主要對小麥和水稻在檢測中應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行研究分析。

當(dāng)噻吩磺隆濃度從100 mg/L升高至400 mg/L時，所測得的OD600值有降低的趨勢，但統(tǒng)計(jì)表明其差異不顯著（P>0.05）；若濃度提高至800 mg/L或1 600 mg/L時，OD600值會顯著下降，菌株的生長受到明顯抑制，但仍然可以生長。初步判定菌株LXL-7在實(shí)驗(yàn)條件下至少能耐受濃度為400 mg/L的噻吩磺隆，在這一濃度下，菌株LXL-7的生長不會受到顯著影響。

圖5 噻吩磺隆濃度對菌株LXL-7生長的影響

2.4 NaCl濃度對菌株LXL-7生長的影響

培養(yǎng)基中NaCl濃度從0.5%提高到4.0%，菌株LXL-7的OD600值未出現(xiàn)顯著變化（差異不顯著，P>0.05）（圖6），NaCl濃度進(jìn)一步升高至8.0%時，菌株LXL-7的生長受到了一定影響，但OD600值仍維持在較高水平，菌株仍然能較好的生長，這表明菌株LXL-7至少能耐受4.0%的NaCl。另外，即使NaCl濃度提高至16.0%，菌株LXL-7仍可維持低水平的生長。

圖6 NaCl濃度對菌株LXL-7生長的影響

2.5 土壤中噻吩磺隆的降解

圖7結(jié)果表明，直接應(yīng)用菌株LXL-7降解土壤中的噻吩磺隆是可行的，在含有噻吩磺隆的土壤中添加菌株LXL-7能顯著提高噻吩磺隆的降解率，施用了菌株LXL-7的土壤中噻吩磺隆（濃度為100 mg/kg）的7 d降解率可達(dá)到98%以上。然而，在未添加菌株LXL-7的土壤中其7 d降解率僅為21%和11%。另外，新鮮土壤中噻吩磺隆的降解率要稍高于其在滅菌土壤中的降解率，存在于新鮮土壤中的某些擁有噻吩磺隆降解能力的天然微生物可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因，部分天然微生物還可能會以共代謝的方式參與噻吩磺隆的降解。在滅菌土壤中，經(jīng)歷7 d后其噻吩磺隆的含量也下降了11%（圖7），這一現(xiàn)象可能是由水解和光解作用所造成。

圖7 經(jīng)不同方式處理的土壤中噻吩磺隆的降解曲線

2.6 含菌株LXL-7的微生物制劑對土壤中噻吩磺隆的降解

圖8 應(yīng)用微生物制劑降解土壤中噻吩磺隆的降解曲線

3 討論

3.1 噻吩磺隆降解菌株的鑒定

分離到的噻吩磺隆降解菌株LXL-7經(jīng)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），另外通過16S rRNA分析也表明菌株LXL-7與枯草芽孢桿菌高度同源（99%），因?yàn)榛趦煞N不同的菌種鑒定原理的結(jié)果都指向了枯草芽孢桿菌，故認(rèn)為菌株LXL-7應(yīng)是枯草芽孢桿菌。

3.2 溫度和pH對菌株LXL-7的影響

圖1、圖2以及相關(guān)數(shù)據(jù)表明了溫度能影響到菌株LXL-7的生長及其降解噻吩磺隆的速率；溫度除了通過影響微生物的生長而導(dǎo)致降解能力變化，也能直接影響相關(guān)降解酶的活性，溫度升高一般會導(dǎo)致酶促降解反應(yīng)速度加快，但過高的溫度又會導(dǎo)致降解酶以及其它酶類失活；另外，除去生物降解作用，溫度也會直接影響磺酰脲類除草劑的化學(xué)水解作用［12，13］。根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可初步判定菌株LXL-7生長及降解噻吩磺隆的適宜溫度是30-35℃，該菌株不能耐受45℃的溫度。

圖3和圖4的結(jié)果表明pH會在一定程度上影響菌株LXL-7的生長和噻吩磺隆的生物降解，但其3 d降解率的數(shù)據(jù)也表明pH對于菌株LXL-7降解噻吩磺隆的影響在降解后期并不十分顯著，在5種不同的pH值條件下，菌株LXL-7降解噻吩磺隆的3 d降解率都可達(dá)到99.6%以上，這暗示了菌株LXL-7擁有極強(qiáng)的噻吩磺隆降解能力。已有的研究成果表明，噻吩磺隆在pH中性時較穩(wěn)定，在pH為酸性時則有利于噻吩磺隆的水解，但在本實(shí)驗(yàn)中并未觀察到這一現(xiàn)象，故可推測這里的降解行為主要是菌株LXL-7的生物降解作用［14-16］。

3.3 菌株LXL-7對噻吩磺隆和NaCl的耐受性

依據(jù)圖5可初步判定菌株LXL-7在實(shí)驗(yàn)條件下至少能耐受濃度為400 mg/L的噻吩磺隆，在這一濃度下，菌株LXL-7的生長不會受到顯著影響。參照文獻(xiàn)資料，在推薦的劑量下使用噻吩磺隆這類磺酰脲類除草劑，其在土壤或農(nóng)作物中的殘留濃度大約在0-15 mg/kg，在超劑量使用除草劑等特殊條件下一般也不會超過100 mg/kg［3，17，18］。據(jù)此可認(rèn)為菌株LXL-7不僅可以用于治理農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用噻吩磺隆所致的環(huán)境污染，還可望用于治理在除草劑的生產(chǎn)及儲運(yùn)等環(huán)節(jié)中可能會出現(xiàn)的高濃度污染。LXL-7所擁有的噻吩磺隆降解能力可能與分離該菌株的農(nóng)田土壤長期使用噻吩磺隆農(nóng)藥密切相關(guān)，按照記錄，相關(guān)農(nóng)田已經(jīng)有使用噻吩磺隆5年以上的歷史。一般來說，土壤微生物長期持續(xù)接觸某種異源的人工有機(jī)物可能會誘導(dǎo)出降解該有機(jī)物的能力，這些具備了新的降解特性的微生物可能與相關(guān)土壤中農(nóng)藥的快速失活密切相關(guān)［19］。

菌株LXL-7至少能耐受4.0%的NaCl，并且在高鹽壓力下仍可保持對噻吩磺隆的降解能力；即使NaCl濃度提高至16.0%，菌株LXL-7仍可維持低水平的生長，因此認(rèn)為該菌株的耐鹽程度為中等以上。菌株LXL-7的耐鹽性可能與采樣地點(diǎn)的鹽堿化土壤有一定關(guān)系，微生物持續(xù)處于滲透壓脅迫環(huán)境下，可誘導(dǎo)產(chǎn)生耐鹽性能，這一般通過滲透調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)這兩種方式實(shí)現(xiàn)［20］。

3.4 菌株LXL-7及其含菌株LXL-7的微生物制劑對土壤中噻吩磺隆的降解

菌株LXL-7可直接應(yīng)用于土壤中噻吩磺隆的降解，施用了菌株LXL-7的土壤中噻吩磺?。舛葹?00 mg/kg）的7 d降解率可達(dá)到98%以上；但在天然土壤中，微生物降解噻吩磺隆會受到多種因素的影響，一些存在于土壤中的擁有噻吩磺隆降解能力的天然微生物也會參與其中，另外，化學(xué)水解和光解作用也會造成噻吩磺隆降解，因此，在將降解菌株用于處理土壤中噻吩磺隆時需要關(guān)注這一系列因素。Andersen和戰(zhàn)力等［21-23］的研究表明，噻吩磺隆等磺酰脲類除草劑的降解行為受多種因素影響，如溫度、pH、光、微生物、土壤類型以及施用的肥料等，一般來說，高溫以及酸性環(huán)境會導(dǎo)致其分解速度加快。

為了便于儲運(yùn)和應(yīng)用，利用菌株LXL-7在已有活菌制劑的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種多功能活菌制劑，新的制劑在原有功能的基礎(chǔ)上增加了降解噻吩磺隆的新功能。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，其在農(nóng)業(yè)應(yīng)用過程中未顯現(xiàn)不利影響，原有功能也得到了有效保留，這些可能歸因于菌株LXL-7的土壤學(xué)來源。另外，在微生物制劑中降解菌株與原有菌株之間的相互作用和合適配比還有待于進(jìn)一步研究，特別是它們之間復(fù)雜的相互作用應(yīng)該被關(guān)注。另外，諸如基質(zhì)的物理化學(xué)特征、營養(yǎng)狀況、pH、溫度以及生物因子等環(huán)境因素都會對生物修復(fù)過程造成影響［24，25］；已有的研究結(jié)果也表明了pH、溫度以及農(nóng)藥濃度等因素都會在一定程度上影響菌株LXL-7對噻吩磺隆的生物降解，因此，在應(yīng)用研究中還需關(guān)注其具體的應(yīng)用環(huán)境條件。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離到一株能高效降解噻吩磺隆的枯草芽孢桿菌LXL-7（Bacillus subtilis）。菌株LXL-7降解噻吩磺隆的適宜pH值為7.0-8.0，適宜溫度為30-35℃，該菌株還對噻吩磺隆和NaCl有很好的耐受性。菌株LXL-7能被直接應(yīng)用于被噻吩磺隆污染的土壤，并在其中發(fā)揮降解噻吩磺隆的作用，施用了菌株LXL-7的土壤中噻吩磺隆（濃度為100 mg/kg）的7 d降解率可達(dá)到98%以上。另外，利用菌株LXL-7和已有的活菌制劑開發(fā)了一種多功能活菌制劑，新的制劑在原有功能的基礎(chǔ)上增加了降解噻吩磺隆的新功能。

［1］李影. 微生物降解磺酰脲類除草劑的研究進(jìn)展［J］. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2013, 34（2）：19-23.

［2］李新安, 趙華, 李廣領(lǐng), 等. 噻吩磺隆在不同類型土壤中的降解行為［J］. 農(nóng)藥, 2012, 51（1）：55-57.

［3］熊興明, 黎理, 劉春來, 等. 噻吩磺隆在小麥和土壤中的殘留降解動態(tài)研究［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2009, 35（1）：104-106, 110.

［4］Brashi I, Calamai L, Cremonini MA, et al. Kinetic and hydrolysis mechanism of triasulfuron［J］. J Agri Food Chem, 1997, 45（11）：4495-4499.

［5］Andersen SM, Hertz PB, Holst T. Mineralisation studies of14C-labelled metsulfuron-methyl, tribenuron-methyl, chlorsulfuron and thifensulfuron-methyl in one Danish soil and groundwater sediment profile［J］. Chemosphere, 2001, 45：775-782.

［6］Jean P, Cambon JB. Mechanism of thifensulfuron-methyl transformation in soil［J］. J Agric Food Chem, 1998, 46（3）：1210-1216.

［7］Hugh M, Brown M. Degradation of thifensulfuron-methyl in soil：role of microbial carboxy esterase activity［J］. J Agric Food Chem, 1997, 45（5）：995-961.

［8］Geraldine P, Danielle V, Jean B. Microbial hydrolysis of methyl aromatic esters by Burkholderia cepacia isolated from soil［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 37：251-258.

［9］東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2001.

［10］Holt JG. Bergey’s manual of determinative bacteriology［M］. 9th Edition. Lippincott Williams & Wilkins, 1993.

［11］NY/T 2067-2011. 土壤中13種磺酰脲類除草劑殘留量的測定/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

［12］Singles SK, Dean GM, Kirkpatrick DM. Fate and behavior of flupyrsulfuron-methyl in soil and aquatic systems［J］. Pestic Sci, 1999, 55：288- 300.

［13］Dinelli G, Vicari A, Bonetti A, Catizone P. Hydrolytic dissipation of four sulfonylurea herbicides［J］. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 1997, 4（45）：1940-1945.

［14］鄒月利, 陶波. 磺酰脲類除草劑的降解機(jī)制及代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展［J］. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2011, 32（10）：24-31.

［15］Cambon JP, Bastide J. Hydrolysis kinetics of thifensulfuron methyl in aqueous buffer solutions［J］. J Agric Food Chem, 1996, 44：333-337.

［16］劉春來. 噻吩磺隆在小麥上的殘留分析方法及殘留動態(tài)研究［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

［17］崔昕, 張微, 魏昌貴. 噻吩磺隆的殘留分析及其在玉米田的殘留規(guī)律研究［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 9（3）：291-296.

［18］葉發(fā)兵, 王建明, 歐陽天贄. 磺酰脲類除草劑在土壤中的殘留研究動態(tài)和趨勢［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 5：88-90.

［19］Felsot A, Maddox JV, Bruce W. Enhanced microbial degradation of carbofuran in soils with histories of carbofuran use［J］. Bull Environ Contam Toxicol, 1989, 26：781-788.

［20］艾海新. 耐鹽硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克?。跠］.大連：大連理工大學(xué), 2008.

［21］Andersen SM, Hertz PB, Holst T, et al. Mineralisation studies of14C-labelled metsulfuron-methyl, tribenuron-methyl, chlorsulfuron and thifensulfuron-methyl in one danish soil and groundwater sediment profile［J］. Chesphere, 2001, 45：775-782.

［22］Menne HJ, Berger BM. Influence of straw management, nitrogen fertilization and dosage rates on the dissipation of five sulfonylureas in soil［J］. Weed Res, 2001, 41：229-244.

［23］戰(zhàn)力. 噻吩磺隆在水體中降解的影響因素研究［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013（11）：33-36.

［24］肖艷松, 譚琳, 陳桂華. 磺酰脲類除草劑的微生物降解［J］.農(nóng)藥研究與應(yīng)用, 2007, 11（3）：15-19.

［25］Ajit KS, Jean S. Hydrolysis of sulfonylurea herbicides in soils and aqueous solutions：a review［J］. J Agric Food Chem, 2002, 50（22）：6253-6265.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation and Utilization of a Thifensulfuron-methyl-degrading Bacterium，Bacillus subtilis LXL-7

LI Xiao-lou
（Department of Architecture and Environmental Engineering Department，Sichuan Vocational and Technological College，Suining 629000）

A strain LXL-7 isolated from soil highly degrades thifensulfuron-methyl，and was identified as Bacillus subtilis. The degradation rate by LXL-7 reached 99.6% in mineral salt medium of thifensulfuron-methyl（100 mg/L）after 72 h. The optimal pH value and temperature were 7.5 and 30-35℃. The strain tolerated well to thifensulfuron-methyl and salt，at least to 400 mg/L of thifensulfuron-methyl and 4.0% NaCl. In addition，adding strain LXL-7 in the commercial preparation for soil amendment，a new multiple-function microbial preparation was developed，and it had an additional new function of degrading thifensulfuron-methyl residue in soil except original functions. Therefore，the strain LXL-7 could be considered for bioremediation of thifensulfuron-methyl pollution and development of microbial preparation.

thifensulfuron-methyl；Bacillus subtilis；biodegradation；microbial preparation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.023

2015-09-14

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZA0036）

李曉樓，男，碩士，副教授，研究方向：環(huán)境微生物及微生物應(yīng)用；E-mail：3141024328@qq.com