王艷霞 王紅玲 王敏 駱健美

（天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學）天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

簡單節(jié)桿菌groEL基因表達對大腸桿菌抗逆性能的影響

王艷霞 王紅玲 王敏 駱健美

（天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學）天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

以簡單節(jié)桿菌（Arthrobacter simplex）TCCC 11037基因組為模板，通過PCR方法進行g(shù)roEL基因克隆，結(jié)果表明，該菌株中GroEL的核苷酸和氨基酸序列與Nocardioides sp. JS614來源的GroEL同源性最高，分別為89%和95%。通過pET-22b（+）將其在大腸桿菌BL21（DE3）中進行異源表達，結(jié)果表明，重組菌株在甲醇、高滲和強酸這3種壓力高濃度沖擊條件下的存活能力和適當壓力條件下的生長性能均明顯提高。

簡單節(jié)桿菌；groEL；異源表達；大腸桿菌；抗逆性能

采用微生物細胞工廠生產(chǎn)各種化學品的過程中，有機化學品產(chǎn)物或有害的環(huán)境（高溫和低溫、極端pH、滲透壓、營養(yǎng)饑餓、有害的底物、有毒的污染物、高濃度的代謝產(chǎn)物或者副產(chǎn)物等）往 往會對微生物細胞或胞內(nèi)酶產(chǎn)生嚴重的毒害效應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞死亡或酶催化劑失活，進而嚴重影響生物催化轉(zhuǎn)化過程的生產(chǎn)效能。因此，提高微生物的環(huán)境耐受性是構(gòu)建高效生產(chǎn)菌株的重要策略之一。

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSP）也被稱作分子伴侶，是細胞在外界物理化學刺激下產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，在胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運、折疊和降解過程中發(fā)揮著重要作用［1，2］。近年來，研究者利用基因工程技術(shù)將各種熱激蛋白的編碼基因進行異源表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宿主菌對不同脅迫條件的耐受性均得到明顯的提高［3-6］。

簡單節(jié)桿菌（Arthrobacter s implex）是工業(yè)上普遍使用的甾體C1，2脫氫反應(yīng)菌株，轉(zhuǎn)化體系中常通過添加乙醇促進疏水性底物的溶解。本課題組在前期工作中，以簡單節(jié)桿菌TCCC 11037生物轉(zhuǎn)化醋酸可的松生成醋酸潑尼松的C1，2脫氫反應(yīng)為研究模型，考察了有機溶劑—乙醇對菌體生長、細胞形態(tài)和細胞生理性質(zhì)的影響，結(jié)果表明，乙醇的加入對菌體的生長、細胞形態(tài)和生理活性 都產(chǎn)生了顯著的影響［7，8］。通過LC-MS/MS和生物信息學分析，進一步鑒定得到了一些與乙醇脅迫相關(guān)的差異顯著蛋白，如熱激蛋白GroEL［9］。在此基礎(chǔ)上，本研究以Arthrobacter simplex TCCC 11037基因組為模板，采用PCR的方法克隆groEL基因，通過表達載體pET-22b（+）將其在大腸桿菌BL21（DE3）中進行異源表達。并對重組菌的生長和抗逆性能進行初步的分析，旨為深入研究該菌株中熱激蛋白GroEL的生物學功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方 法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 簡單節(jié)桿菌（Arthrobacter simplex）TCCC 11037，天津科技大學微生物制藥研究室保存。宿主菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，Transgen公司，載體pMD19-T（simple）和pET-22b（+）分別購自TaKaRa公司和Novagen公司。

1.1.2 酶和試劑 HiFi DNA Polymerase購自Transgen公司，限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ/EcoR I和T4 DNA連接酶來自TaKaRa公司，細菌基因組提取試劑盒質(zhì)粒購自Tiangen公司，抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因的克隆 參照天根的細菌基因組提取試劑盒提取方法提取Arthrobacter s implex TCCC 11037的基因組，根據(jù)16S RNA比對結(jié)果選取與Arthrobacter simplex TCCC 11037親緣關(guān)系最近的Nocardioi des sp. J54在GenBank登錄的groEL序列（WP_028656707.1）設(shè)計用于簡單節(jié)桿菌groEL基因擴增的引物。上游引物5'-CCGGAATT CATGTCGAAGCTGATTGCTTTC-3'，下游引物5'-CCC AAGCTTTCAGCGCAGGTCCCAGCG-3'（下劃線部分分別為EcoRⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點）。以簡單節(jié)桿菌總DNA為模板，使用HiFi DNA Polymerase酶進行PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T（simple）載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，分別經(jīng)菌液PCR及EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切驗證，將陽性克隆送至深圳華大基因公司測序。

1.2.2 序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 用NCBI的ORF finder程序?qū)ふ褼NA片段中的開放讀碼框并確定其編碼的氨基酸序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast軟件將目的基因編碼的氨基酸序列與GenBank中的氨基酸序列進行比對和相似性搜索，獲得相似性在60%以上的7株菌株的序列，利用MEGA5軟件，運用Neighbor-Joining，采用Poisson校正模型，自舉1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 GroEL重組大腸桿菌的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物與pMD19-T（simple）載體連接，經(jīng)EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切獲得黏性末端基因片段，與經(jīng)過相同處理pET-22b（+）連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-22b（+）-groEL，經(jīng)菌液PCR及EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，將驗證正確的重組質(zhì)粒采用化學法轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞。挑取單克隆，通過重提質(zhì)粒、PCR和EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，篩選出GroEL重組大腸桿菌。

1.2.4 GroEL蛋白的誘導(dǎo)表達 分別將重組菌E.coli BL21（DE3）/pET-22b（+）-groEL和含有空質(zhì)粒的對照菌株E.coli BL21（DE3）/pET-22b（+）接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)。以1%接種量接入50 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6，此時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達6 h，6 000 r/min離心10 min收集適量菌體，加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，10 000 r/min離心5 min后取上清液，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 簡單節(jié)桿菌GroEL表達對大腸桿菌無壓力條件下生長特性的影響 分別將重組菌株E.coli BL21/ p ET-22b（+）-groEL和對照菌株E.coli BL21/pET-22b（+）接種一環(huán)到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素）的250 mL三角瓶中，37℃180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以1%的接種量將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素和1 mmol/L IPTG）的250 mL三角瓶中，用LB液體培養(yǎng)基將兩個菌株的初始OD600值均調(diào)為0.02，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔一定時間取樣測定OD600值，繪制生長曲線。

1.2.6 簡單節(jié)桿菌GroEL表達對大腸桿菌抗逆性能的影響

1.2.6.1 熱激蛋白GroEL表達對大腸桿菌高濃度壓力沖擊條件下存活情況的影響 按照1.2.4的方法進行GroEL蛋白的誘導(dǎo)表達，將收集得到的菌體用新鮮的LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素）懸浮并將菌液的OD600值均調(diào)節(jié)至0.8。取培養(yǎng)液1 mL，6 000 r/min離心10 min收集菌體，將其懸浮在5 mL含有不同壓力（包括10%乙醇、50℃、15%甲醇、3 mol/L山梨醇和pH=3.0）的LB液 體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素）中，37℃，180 r/min振蕩30 min。將上述培養(yǎng)液采用10倍逐級稀釋法在LB平板（含有100 μg/mL氨芐青霉素）上進行涂布，37℃培養(yǎng)一定時間后觀察平板上的菌落數(shù)。實驗中以不加壓力的條件作為對照組，按照下述公式計算存活率。同時將對照菌株接種到含氨芐青霉素（100 μg/mL）的L B培養(yǎng)液中，按照相同的方法進行培養(yǎng)和測定存活率。

存活率（%）=菌株壓力條件下的菌落數(shù)/菌株無壓力條件下的菌落數(shù)×100%

1.2.6.2 熱激蛋白GroEL表達對大腸桿菌適當壓力條件下生長特性的影響 分別將重組菌株E.coli BL21/pET-22b（+）-groEL和對照菌株E.coli BL21/ pET-22b（+）接種一環(huán)到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素）的250 mL三角瓶中，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以1%的接種量將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL氨芐青霉素和1 mmol/L IPTG）的250 mL三角瓶中，用LB液體培養(yǎng)基將兩個菌株的初始OD600值均調(diào)為0.02。然后在不同壓力條件下（包括4%乙醇、42℃、5%甲醇、1 mol/L山梨醇和pH 5.0）180 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)（除42℃外，其他壓力條件下的培養(yǎng)溫度均為37℃），每隔一定時間取樣測定OD600值。實驗中以不加壓力的條件作為對照組，按照下述公式計算 相對OD600。

相對OD600=菌株壓力條件下的OD600值/菌株無壓力條件下的OD600值

2 結(jié)果

2.1 簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因的克隆

以Arthrobacter simplex TCCC 11037基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴增目標基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分析，約在1 600 bp處有特異性的單一條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。

圖1 簡單節(jié)桿菌groEL基因的PCR擴增產(chǎn)物

2.2 簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由測序結(jié)果可知，已成功克隆得到A. simplex TCCC 11037中g(shù)roEL基因，其全長為1 632 bp，編碼544個氨基酸。將此groEL基因進行同源比對，結(jié)果（圖2，圖3）表明，A. simplex TCCC 11037中Gro EL的核苷酸和氨基酸序列與Nocardioides sp. JS614的同源性最高，分別達到89%和95%。不同微生物來源的groEL基因的親緣關(guān)系非常接近，氨基酸序列與核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹基本是一致的。進化分析表明A. simple TCCC 11037的groEL基因與Nocardioides聚為一枝，與諾卡氏菌屬的進化關(guān)系最近。該基因的序列信息已經(jīng)在GenBank上注冊，登錄號為KJ854907。

圖2 groEL核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 GroEL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 groEL在大腸桿菌中的表達

2.3.1 重組表達載體pET-22b（+）-groEL的構(gòu)建 表達載體pET-22b（+）-groEL經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果（圖4）表明獲得了與預(yù)期大小相同的目的片段，說明表達載體pET-22b（+）-groEL已經(jīng)構(gòu)建成功。

2.3.2 groEL在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 與含有空質(zhì)粒的對照菌株相比，重組菌株E.coli BL21（DE3）/ pET-22b（+）-groEL在57 kD處出現(xiàn)一條明顯的特異條帶（圖5），其分子量與目的蛋白基本吻合，說明groEL已在大腸桿菌中成功表達。

2.4 簡單節(jié)桿菌GroEL表達對大腸桿菌無壓力條件下生長特性的影響

圖6顯示，無壓力添加的條件下，重組菌株和對照菌株的生長階段沒有明顯的差異，延滯期均為0-4 h，對數(shù)生長期是4-14 h，但重組菌株在對數(shù)期的生長速率略高于對照菌株。之后兩個菌株的生長均進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)14 h后OD600達到最大，為0.77。

2.5 簡單節(jié)桿菌GroEL表達對大腸桿菌抗逆性能的影響

2.5.1 熱激蛋白GroEL表達對大腸桿菌壓力沖擊條件下存活情況的影響 圖7顯示，10%（V/V）乙醇及50℃高溫處理條件下，重組菌株和對照菌株的存活率無明顯差別，而重組菌株在15%甲醇、3 mol/L山梨醇的高滲壓力及強酸條件（pH=3.0）等壓力沖擊條件下的存活率與對照組相比分別提高了9.94%、16.70%和30.79%。以上結(jié)果說明，簡單節(jié)桿菌中的groEL基因的表達能夠不同程度的提高大腸桿菌在甲醇、高滲和強酸等壓力沖擊條件下的存活能力。

圖4 表達載體pET-22b（+）-groEL的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果

圖5 groEL在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

圖6 菌株無壓力條件下的生長曲線

圖7 各種沖擊條件下菌株存活情況

2.5.2 熱激蛋白GroEL表達對大腸桿菌適當壓力條件下生長情況的影響 圖8顯示，4%（V/V）乙醇和42℃條件下，重組菌株和對照菌株的生長均無明顯差別。在5%（V/V）甲醇、1 mol/L山梨醇和pH=5.0的條件下，重組菌株的相對OD600值較對照菌株均有所提高。其中，5%（V/V）甲醇條件下培養(yǎng)30 h后，重組菌株相對OD600達到了0.64，比對照菌株提高了6.72%；1 mol/L山梨醇條件下培養(yǎng)30 h時，重組菌株相對OD600達到了1.07，與對照菌株相比提高了22.53%；pH=5.0條件下培養(yǎng)30 h時，重組菌株相對OD600達到了0.86，與對照菌株相比提高了33.03%。這說明簡單節(jié)桿菌中GroEL的表達能夠提高大腸桿菌在甲醇、高滲和強酸這3種壓力條件下的生長性能。

3 討論

簡單節(jié)桿菌（Arthrobacter simplex）是工業(yè)上普遍使用的用于甾體化合物C1，2脫氫反應(yīng)的生產(chǎn)菌株，轉(zhuǎn)化體系中多采用添加有機溶劑（如乙醇）的方法促進疏水性底物的溶解［10］。但有機溶劑的用量卻因為其對微生物的不利影響受到嚴格控制，這大大限制了轉(zhuǎn)化體系中底物的投料量，最終影響轉(zhuǎn)化效率。因此，迫切需要提高現(xiàn)有菌株的有機溶劑耐受性，而充分認識簡單節(jié)桿菌在有機溶劑條件下的適應(yīng)行為是完成上述工作的重要基礎(chǔ)。課題組前期工作中，通過LC-MS/MS和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白GroEL與菌體乙醇脅迫條件下的適應(yīng)行為密切相關(guān)［9］。在此基礎(chǔ)上，本研究克隆得到了簡單節(jié)桿菌中GroEL基因的全序列，序列同源性分析結(jié)果表明，該菌株中GroEL的核苷酸和氨基酸序列與Nocardioides sp. JS614來源的GroEL同源性最高，分別為89%和95%。

圖8 E.coli BL21/pET-22b（+）和E.coli BL21/pET-22b（+）-groEL在適當壓力下的生長情況

GroEL是一種熱激蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)，簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因的異源表達對大腸桿菌的抗逆性能產(chǎn)生了明顯的影響，重組菌株在甲醇、高滲和強酸這3種壓力高濃度沖擊條件下的存活能力和適當壓力條件下的生長性能均明顯提高。這一結(jié)果與文獻報道的情況相似。2013年，Zingaro等［14］將groESL在大腸桿菌中進行過表達，結(jié)果表明，與對照菌株相比，重組菌株分別在4%（V/V）乙醇、0.75%（V/V）正丁醇、1.25%（V/V）2-丁醇、20%（V/V）1，2，4-丁三醇中培養(yǎng)48 h后，菌體濃度分別增大了12、2.8、3和4倍。這說明熱激蛋白groESL對于提高微生物的有機溶劑耐受性具有良好效果。2014年，孫翔英等［15］將騰沖嗜熱菌（Thermoanaerobacter tengcongensis MB4）中的groEL基因在大腸桿菌中表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌株43℃培養(yǎng)3 h后的OD600是對照菌株的1.39倍，同時，乙酸耐受性提高了16%。這些結(jié)果都說明，熱激蛋白的異源表達在改善細胞受到應(yīng)激脅迫時的生存能力和提高細胞環(huán)境耐受性方面表現(xiàn)出良好的效果，但不同微生物來源的groEL基因在影響微生物抗逆性能方面的作用存在一定差異。目前本課題組正在建立適合簡單節(jié)桿菌的遺傳表達體系，下一步將通過groEL基因的過表達，進一步明確該基因在簡單節(jié)桿菌乙醇脅迫條件下適應(yīng)行為中發(fā)揮的生物學功能。該工作是簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因克隆與表達的首次報道，也為深入研究該菌株中熱激蛋白GroEL的生物學功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過PCR技術(shù)成功從A. simplex TCCC 11037基因組中擴增出groEL基因的全序列，該序列信息已提交GenBank注冊，登錄號為KJ854907。簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因的全長1 632 bp，編碼544個氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與Nocardioides sp. JS614來源的GroEL同源性最高，分別為89%和95%。通過pET-22b（+）表達載體將該基因在大腸桿菌中進行異源表達，蛋白大小為57 kD左右。進一步考察groEL異源表達對大腸桿菌生長和抗逆性能的影響。結(jié)果表明，簡單節(jié)桿菌中g(shù)roEL基因的表達對大腸桿菌無壓力條件下生長特性無明顯影響，但重組菌株在甲醇、高滲和強酸這3種壓力高濃度沖擊條件下的存活能力和適當壓力條件下的生長性能均明顯提高。

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（責任編輯 馬鑫）

The Effects of Heterologous Expression of groEL from Arthrobacter simplex on the Resistance Performance of Escherichia coli

WANG Yan-xia WANG Hong-ling WANG Min LUO Jian-mei
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology（Tianjin University of Science &Technology）of Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Arthrobacter simplex，a strain with steroid C1，2 dehydrogenation ability，has been widely used in the steroid industry，usually adding ethanol in the transforming system may catalyze the dissolution of hydrophobic substrates. Our prior work by LC-MS/MS and bioinformatics analysis found that heat shock protein（HSP）GroEL was closely correlated to the cell adaptive behavior under ethanol stress condition. Based on this concept，groEL gene was cloned by PCR while using A. simplex TCCC 11037 genome as a template. The results showed that the homologies of nucleotide and amino acid sequence of GroEL in the strain were the highest with that from Nocardioides sp. JS614 by the ratio of 89% and 95%，respectively. Then its heterologous expression was conducted in Escherichia coli BL21（DE3）with the vector pET-22b（+），and the results showed that the recombinant strain presented the significant increase on the survival performance under the shock condition with high-concentration of methanol，hypertonicity and superacid，as well as the growth performance under the proper stresses of them. The study was the first report on the cloning and expression of gene groEL from A. simplex，and also provided fundamental data for exploring the biological function of HSP protein GroEL from A. simplex.

Arthrobacter simplex；groEL；heterologous expression；Escherichia coli；resistance performance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.024

2015-08-12

國家自然科學基金項目（21306138），天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（自然科學基金（13JCYBJC20600））

王艷霞，女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物育種；E-mail：wangyanxia323@126.com

駱健美，女，博士，教授，研究方向：工業(yè)微生物育種；E-mail：luojianmei@tust.edu.cn