趙曉燕，吳曉青，周紅姿，張廣志，張新建

(山東省科學(xué)院生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東　濟南　250014)

側(cè)耳木霉T9對褐煤的生物降解作用

趙曉燕，吳曉青，周紅姿，張廣志，張新建*

(山東省科學(xué)院生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東濟南250014)

摘要：采用微生物降解方法，以煤樣粒度、菌液用量、煤漿濃度和生物降解時間為影響因子，測定側(cè)耳木霉T9對山西褐煤的生物降解作用。結(jié)果表明：各因素對褐煤生物降解率的影響大小依次為：煤樣粒度>菌液用量>煤漿濃度>生物降解時間。采用正交試驗，篩選出最優(yōu)組合為：煤粒度0.1 mm、菌液用量10 mL、煤漿濃度2%和生物降解時間14 d，對褐煤的生物降解率最高達60.00%。

關(guān)鍵詞：側(cè)耳木霉；褐煤；粒度；生物降解率

中國的煤炭資源特別是褐煤等低質(zhì)煤資源十分豐富，已探明的褐煤保有儲量達1 303億t,占全國煤炭儲量的13%[1]。但褐煤的應(yīng)用比較困難，中國的褐煤資源主要由于發(fā)電，但是直接燃燒不僅嚴重污染環(huán)境，而且也不利于實現(xiàn)經(jīng)濟效益的最大化。采用微生物對褐煤進行生物降解，具有工藝簡單、低能耗、無污染和綠色環(huán)保等優(yōu)點[2]，使褐煤成為清潔的燃料、化工原料和有特殊價值的化學(xué)品意義重大，因此褐煤的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)目前已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。

煤的生物降解技術(shù)研究始于20世紀80年代[3-4]，雖然研究時間不長，但其發(fā)展速度很快。目前，研究者發(fā)現(xiàn)細菌、放線菌、真菌類中的多個種屬對褐煤、風(fēng)化煤等低變質(zhì)煤具有生物降解作用[5-7]。真菌生物降解煤的研究主要集中在青霉、曲霉、毛霉、裂褶、云芝等種屬上[8-11]。木霉是國際公認的一種高效廣譜環(huán)境友好型的生防真菌，近幾年國外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾株深綠木霉生物降解褐煤的研究[12-13]。目前國內(nèi)還未見木霉生物降解褐煤的報道，開展相關(guān)研究對于擴大木霉應(yīng)用范圍和促進褐煤的清潔轉(zhuǎn)化有著重要意義。

1材料與方法

1.1煤樣

褐煤取自山西臨汾煤場，將煤樣粉碎、篩分制成0.1、0.3、0.8 mm粒級的樣品備用。用6 mol·L-1的硝酸浸泡各粒級的褐煤24 h后，真空過濾出褐煤，再用去離子水反復(fù)清洗至pH=7.0，烘干后采用紫外消毒30 min后備用。

1.2菌種

側(cè)耳木霉TrichodermapleuroticolaT9為山東省應(yīng)用微生物重點實驗室保存菌種。固體培養(yǎng)基采用常規(guī)PDA培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基采用最小無機鹽培養(yǎng)基[0.1%(NH4)2SO4，0.052% MgSO4·7H2O，0.5% KH2PO4，0.0005% FeSO4·7H2O，0.0003% ZnSO4·7H2O，0.5%葡萄糖，pH5.5]，培養(yǎng)基中加入6 mm玻璃珠打散菌體。菌體培養(yǎng)溫度30℃，液體培養(yǎng)搖床的轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

1.3試驗方法

1.3.1種子液的制備將菌株T9從保存的PDA斜面轉(zhuǎn)接至新鮮試管斜面,于30℃ 培養(yǎng) 12 h。取培養(yǎng)好的斜面,接種于盛有50 mL無菌種子培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，然后置于全溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，HZQ-Q)中30℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，至活菌數(shù)為108cfu·mL-1備用。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)采用正交設(shè)計方案，考查因素包括煤樣粒度A、菌液用量B、煤漿濃度C、生物降解時間D。試驗因素及水平如表1所示。正交試驗表頭設(shè)計采用L9( 34)。試驗中不考慮各因素間的交互作用。每個處理都是采用250 mL的三角瓶裝液量50 mL(培養(yǎng)液115℃高壓滅菌20 min)，每個處理分別加入定量煤樣和定量菌液，放入30℃全溫振蕩器中分別振蕩培養(yǎng)7、14、21 d，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，每個處理重復(fù)3次，另設(shè)不加煤的培養(yǎng)基為對照。

表1　試驗因素水平

1.3.3褐煤生物降解率計算方法參照李俊旺[14]的方法略有變動。將上述培養(yǎng)一定天數(shù)的褐煤培養(yǎng)基進行離心、過濾，從煤渣中小心挑出菌絲體，取其未溶物(煤渣)烘干、稱重，按照下列公式計算褐煤生物降解率。取褐煤生物降解率最高的搖瓶進行拍照和顯微鏡檢觀察。

褐煤生物降解率/%=[(加入的煤樣質(zhì)量-生物降解后的煤渣質(zhì)量)/加入的煤樣質(zhì)量]×100%

2結(jié)果與分析

2.1側(cè)耳木霉T9生物降解褐煤的正交試驗

生物降解褐煤的最佳組合為A1B2C2D2，即煤樣粒度為0.1 mm，菌液用量為10 mL，煤漿濃度為2%，生物降解時間為14 d的時候，褐煤的生物降解率最大，達60.00% (表2)。

表2　L9( 34 )正交試驗結(jié)果

2.2側(cè)耳木霉T9生物降解褐煤的正交試驗影響因素

各處理搖瓶培養(yǎng)14 d后的培養(yǎng)液和菌體顏色都發(fā)生了變化。褐煤對照培養(yǎng)液(不加T9)培養(yǎng)14 d后顏色仍然為不透明的純黑色(圖1-C)，褐煤生物降解14 d后培養(yǎng)液的黑色變淡變透明，且明顯能看到褐煤上面長出了綠色的側(cè)耳木霉T9(圖1-A)，T9對照培養(yǎng)液中聚集的菌體為綠色(圖1-B)，通過上述的顏色對比上就能直觀看出T9對褐煤具有生物降解作用。

各處理搖瓶培養(yǎng)14 d對菌絲分別進行顯微鏡檢。從T9降解褐煤14 d(圖2-A)和T9對照 (圖2-B)的顯微圖片對比中，能夠明顯看出T9生物降解褐煤14 d后菌絲體上富集了很多黑色的褐煤，菌體也因為吸收褐煤開始變?yōu)楹谏?，而T9對照中的菌絲在顯微鏡下為透明中空狀，從顯微鏡檢結(jié)果也能明顯看出T9對褐煤的生物降解作用。

煤樣粒度、菌液用量、煤漿濃度和生物降解時間與T9生物降解率的關(guān)系見圖3～6。T9生物降解率隨著煤樣粒度的增加下降趨勢明顯(圖3)，說明煤樣粒度對生物降解率影響很大，粒度越大越難生物降解。T9生物降解率隨菌液用量的變化呈先升高后降低的趨勢(圖4)，當菌液用量為10 mL的時候，T9生物降解率最高達43.61%，隨后逐漸減少。煤漿濃度與T9生物降解率之間的關(guān)系總體來看也是先增后減的趨勢(圖5)，當煤漿濃度達到2%的時候，T9生物降解率最高，為43.06%，隨后生物降解率呈緩慢下降的趨勢。降解時間與T9生物降解率的關(guān)系也是先增后減(圖6)，降解時間為14 d時，T9生物降解率最高達41.56%，隨后降解率呈下降趨勢，這可能是因為隨時間的延長T9生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少導(dǎo)致生物降解率逐漸降低。

3討論與結(jié)論

通過正交試驗優(yōu)化出T9降解褐煤的最佳組合為A1B2C2D2，各因素對褐煤微生物降解率的影響大小依次為煤樣粒度>菌液用量>生物降解時間>煤漿濃度。圖3～6中可以看出煤的粒度對生物降解的影響最大,粒度越大生物降解越難,這可能是因為煤粒度越大孔隙度越小,微生物釋放的各種活性物質(zhì)和煤的接觸面積就越小,煤的溶解程度和生物降解速率也越小。菌液用量是褐煤微生物降解率的第二大影響因素，但菌液用量并非越多越好，這可能與菌種互相之間的空間競爭和營養(yǎng)競爭有關(guān)系，菌量過多造成培養(yǎng)后期生長緩慢，造成T9對褐煤的生物降解率降低。煤漿濃度關(guān)系到液體培養(yǎng)基中的碳源含量的高低，褐煤為T9的生長提供了碳源，但當煤漿濃度過高時，T9消耗不了的褐煤反而會占據(jù)菌體的生存空間進而影響到褐煤的生物降解率。

目前對于煤生物降解方法的前處理多采用硝酸氧化和鹽酸氧化的方法[15-16]，前處理的目的是提高煤炭的含氧量，有利于微生物產(chǎn)生的各種酶能斷開煤結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵，進一步促進微生物對煤的降解。本研究中也采用了硝酸對褐煤進行前處理，對環(huán)境有一定的污染性[17]，導(dǎo)致該方法只能局限于實驗室內(nèi)的研究而無法大面積的推廣應(yīng)用。本研究從搖瓶培養(yǎng)和顯微鏡檢(圖1和圖2)兩方面的結(jié)果表明側(cè)耳木霉T9對褐煤具有富集和生物降解的雙重作用。T9的富集作用未來也可應(yīng)用于褐煤水體污染方面的研究，這為褐煤的水污染的處理提供了一種新的方法和途徑。

褐煤是由芳香環(huán)組成并由鹽橋、脂肪鏈等連接起來的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)化合物，一般很難進入微生物細胞內(nèi)。褐煤的生物降解主要是靠微生物分泌到細胞外的一些活性物質(zhì)起作用，不同的微生物代謝產(chǎn)物也不同，迄今研究者主要提出了3種煤的微生物降解機理，包括堿作用機理、生物螯合劑作用機理及酶作用機理[18]。國外有報道表明木霉對褐煤的生物降解機理是酶的作用。Laborda F等發(fā)現(xiàn)在含煤培養(yǎng)基中生長起來的木霉菌絲體的溶解作用是由于菌體細胞的存在而促進了煤的溶解，也就是說，木霉對褐煤的生物降解作用是胞外酶和細胞壁共同作用的結(jié)果[19]。本試驗僅研究了側(cè)耳木霉T9對褐煤的初步生物降解作用，至于T9對褐煤的生物降解機理是否也是酶作用機理，或是酶與細胞壁的共同作用有待于以后進一步的研究。

參考文獻：

[1]張振華，陳增強，趙躍民，等. 細粒褐煤干燥的影響因素研究[J]. 煤炭工程，2014，46(1)：115-121.

[2]尹艷. 多粘類芽孢桿菌對褐煤的生物降解轉(zhuǎn)化試驗研究[J]. 煤炭加工與綜合利用，2013，(2)：50-53.

[3]姚菁華，肖雷，紀洪敏. 褐煤的分級萃取及生物解聚研究[J]. 中國礦業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，43(1)：151-155.

[4]徐敬堯，張明旭. 黃孢原毛平革菌原生質(zhì)體的紫外誘變育種及對義馬褐煤的生物降解轉(zhuǎn)化[J]. 安全與環(huán)境學(xué)報，2015，15(4)：227-230.

[5]DU Y，TAO XX，SHI KY，et al. Biodegradation of lignite model compounds by the action of white rot fungi[J]. Mining Science and Technology，2010，(20)：76-81.

[6]徐敬堯，張明旭. 球紅假單胞菌原生質(zhì)體的微波誘變及其煤炭生物降解轉(zhuǎn)化[J]. 中國礦業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，43(1)：132-138.

[7]王愛寬. 褐煤本源菌生氣特征及其作用機理[J]. 煤炭學(xué)報，2012，37(2)：355-356.

[8]劉瑩，趙杰，魏丹，等. 褐煤生物轉(zhuǎn)化高效菌株的研究及其發(fā)展前景[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，(12):157-159.

[9]徐敬堯. 球紅假單胞菌生物降解褐煤的條件研究[J]. 安徽理工大學(xué)學(xué)報，2008，28(3):46-51.

[10]YAO J H，XIAO L，WANG LQ. Separation and analysis of lignite bioconversion products[J]. International Journal of Mining Science and Technology， 2012，(22): 529-532.

[11]KEDVES M，PARDUTZ A. Ultrastructure of partially degraded hungarian lignites [J]. Taiwannia，2001，46(2): 135-144.

[12]HOLKER U，SCHMIERS H，GROBE S，et al. Solubilization of low-rank coal by Trichoderma atroviride: Evidence for the involvement of hydrolytic and oxidative enzymes by using 14C-labelled lignite [J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2002，(28): 207-212.

[13]SILVA-STENICO M E，VENGADAJELLUM C J, Janjua H A, et al. Biodegradation of low rank coal by Trichoderma atroviride ES11[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2007，(34): 625-631.

[14]李俊旺，張明旭，葉金龍.黃孢原毛平革菌生物降解褐煤工藝條件的研究[J]. 潔凈煤技術(shù)，2008，14(4)：82-84.

[15]韓威，佟威，楊海波，等. 煤的微生物溶(降)解及其產(chǎn)物研究 [J]. 大連理工大學(xué)學(xué)報，1994，34(6)：56-58.

[16]柳麗芬，陽衛(wèi)軍，成瑩，等. 鶴崗風(fēng)化煤的微生物降解研究 [J]. 大連理工大學(xué)學(xué)報，1996，36(4)：43-44.

[17]譙興國. 有關(guān)硝酸煙氣治理現(xiàn)狀及對策分析[J]. 資源節(jié)約與環(huán)保，2015，(11)：27.

[18]李俊旺. 白腐真菌降解褐煤的研究[D]. 淮南：安徽理工大學(xué)，2009.

[19]LABORDA F, MONISTROL I F，LUNA N，et al. Processes of liquefaction/ solubilization of Spanish coals by microorganisms[J]. Applied Microbiology and Biotech-nology，1999，52: 49-56.

(責任編輯：林海清)

iodegradation of Lignite byTrichodermapleuroticolaT9

ZHAO Xiao-yan, WU Xiao-qing, ZHOU Hong-zi, ZHANG Guang-zhi, ZHANG Xin-jian*

(ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedMicrobiology,InstituteofEcology,ShandongAcademyofSciences,Ji′nan,Shandong250014,China)

Abstract：Biodegradation by Trichoderma pleuroticola T9 on lignite from Shanxi province was studied aiming to optimize the process in regard to the particle size and slurry concentration of the coal, as well as the inoculum quantity and fermentation time. The results indicated that the biodegradation was affected in the order of particle size >inoculum quantity>concentration of coal slurry>duration of fermentation. The optimized conditions to achieve the maximum degrading rate of 60% were determined to be (a) a use of lignite with a particle size of 0.1 mm, (b) a coal slurry concentration of 2%, (c) the inoculation of 10 mL of T. pleuroticola T9 fermentation broth, and (d) incubation for 14 d.

Key words：Trichoderma pleuroticola; lignite; particle size; biodegradation rate

收稿日期：2016-03-08初稿；2016-04-01修改稿

作者簡介：趙曉燕(1978-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：面源污染修復(fù)與生物防治 *通訊作者：張新建(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：面源污染修復(fù)與生物防治(E-mail: zhangxj@sdas.org)

基金項目：國家自然基金項目(31572044 )；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研基金項目(BS2015SW029)；山東省科學(xué)院青年基金項目(2014QN019)；山東省科技攻關(guān)項目(2014GSF121028)

中圖分類號：S 476

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0384(2016)04-415-04

趙曉燕，吳曉青，周紅姿，等.側(cè)耳木霉T9對褐煤的生物降解作用[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(4)：415-418.

ZHAO X-Y，WU X-Q，ZHOU H-Z，et al.Biodegradation of Lignite byTrichodermapleuroticolaT9[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(4)：415-418.