賈瑞博，周文斌 ，陳竟豪，李　燕 ，劉凱麗 ，趙　慧，劉　斌 ，呂旭聰，3*

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建　福州　350002; 2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建　福州　350002；3.陽光國際集團科技發(fā)展有限公司，福建　泉州　362000)

高產(chǎn)色素紅曲菌的篩選鑒定及其液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

賈瑞博1,2，周文斌1,2，陳竟豪2，李燕1,2，劉凱麗1,2，趙慧1,2，劉斌1,2，呂旭聰1,2，3*

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350002; 2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350002；3.陽光國際集團科技發(fā)展有限公司，福建泉州362000)

摘要：從福建永春、安溪、古田、南平、三明、龍巖等地收集的紅曲米中分離篩選得到了1株高產(chǎn)色素紅曲菌L03，利用形態(tài)學和分子生物學的方法對其進行鑒定，結(jié)果表明為紫色紅曲菌Monascus purpureus。同時通過單因素和正交優(yōu)化試驗確定了其最佳的液態(tài)發(fā)酵條件：以8%的甘油為碳源、1.5%蛋白胨為氮源、硫酸鎂0.1%、磷酸二氫鉀0.25%、接種量6%、發(fā)酵溫度32℃、時間9 d、搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1、250 mL容器中裝液量100 mL，在此液態(tài)發(fā)酵條件下其總色價平均值為1 578 U·mL-1。

關(guān)鍵詞：色素；紅曲菌；篩選；鑒定；液態(tài)發(fā)酵；優(yōu)化

紅曲色素是紅曲菌重要的次級代謝產(chǎn)物之一[1]，具有抗氧化、抗疲勞、抑菌、增強免疫力、調(diào)節(jié)血壓血脂等多重功能活性，是一種安全無毒的天然色素[2-3]。目前，紅曲色素已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域[4]，然而，紅曲菌的產(chǎn)色素能力普遍偏低，這是限制紅曲色素廣泛應用的主要原因之一。國內(nèi)外提高色素產(chǎn)量主要包括以下2種技術(shù)途徑：第一，利用菌種篩選、誘變或基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)色素的紅曲菌菌株[5-8]；第二，通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和控制提高紅曲菌發(fā)酵液色價或達到高產(chǎn)某種色素的目的[9-10]。雖然通過誘變和基因工程的方法的確能提高色素的產(chǎn)量，但突變的機制不明確，突變位點難以控制，沒有一定的方向性，因此工作量很大，而且不一定能保證效果，突變菌株也很可能再發(fā)生回復突變?；蚬こ谭椒ㄋ@得的菌株還需要進行安全性評估，所以通過基因改造獲得的紅曲色素產(chǎn)品作為天然食用色素的應用前景有著較大是局限性。

為此本研究從福建南平、三明、龍巖、古田等地收集的紅曲米中分離純化得到了20株紅曲菌，以總色價為指標篩選得到1株高產(chǎn)色素菌株，并進一步利用形態(tài)學結(jié)合分子生物學方法進行菌種鑒定，并通過單因素和正交試驗對碳源、氮源及發(fā)酵溫度等3關(guān)鍵條件進行優(yōu)化，確定該菌株的最佳液態(tài)發(fā)酵條件，為該紅曲菌菌株的進一步開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株從福建永春、安溪、古田、南平、三明、龍巖等地收集的紅曲米中分離純化得到20株紅曲菌，編號L1～L20。

1.1.2培養(yǎng)基

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基：量取甘油80 mL，豆粉10 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀2.5 g，加去離子水溶解并定容至1 000 mL，取100 mL于250 mL錐形瓶分裝，包扎，121℃滅菌20 min。

(2)菌種鑒定培養(yǎng)基[11]：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(Wa)、麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(MEA)、察氏酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基(CYA)、甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(G25N)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.1.3主要藥品試劑和儀器 甘油、蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、蔗糖、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、七水硫酸鎂，購于國藥集團有限公司；酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)、DNA Maker、Taq酶、goldview核酸染料、瓊脂糖，購于上海生工生物工程有限公司。

超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；THZ-C恒溫振蕩器(北京同正生物技術(shù)發(fā)展公司)；高壓滅菌鍋(廈門精藝興業(yè)科技有限公司)；PCR儀T3(Thermocrcler Biometra)；電泳儀(BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE GENEGENIUS)；Nanodrop 2000(北京東林昌盛生物科技有限公司)；分光光度計(上海精科儀器有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1紅曲菌的分離純化 參考吳巧玉等[12]報道的高產(chǎn)淀粉紅曲霉菌的分離純化方法，從福建永春、安溪、古田、南平、三明、龍巖等地的紅曲米中分離純化得到20株紅曲菌。

1.2.2高產(chǎn)色素紅曲菌的篩選 將純化得到的20株紅曲菌株分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d，參考童愛均等[13]的方法測定發(fā)酵液總色價。

1.2.3高產(chǎn)色素紅曲菌的鑒定

(1)形態(tài)學觀察：將純化的高產(chǎn)色素菌采用點種法接種于Wa、PDA、MEA、CYA和G25N 5種培養(yǎng)基上。在25℃培養(yǎng)7 d，觀察目標菌株在上述5中培養(yǎng)基上的菌落大小、邊緣特征、顏色等。顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、分生孢子、閉囊殼等顯微形態(tài)特征，參照李忠慶等[14]的分類方法對篩選的紅曲菌菌株進行分類鑒定。

(2)分子生物學鑒定：參照李鐘慶等[14]的DNA提取方法提取高產(chǎn)色素菌總DNA,基因的擴增引物見表1，反應體系參照張穎慧等[15],PCR擴增程序為：95℃ 5 min，94℃ 40 s，52℃ 40 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃ 1 h。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，并將所得的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司經(jīng)純化后，在ABI-PRISM3730型DNA自動測序儀上進行直接雙向測序，測序結(jié)果采用美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information)提供的比對搜索程序BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行相似性分析。

表1　引物名稱及序列

1.2.4高產(chǎn)色素紅曲菌液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)單因素試驗：①不同碳源對色素產(chǎn)量的影響：選擇甘油、蔗糖、可溶性淀粉、大米粉、燕麥粉、α-乳糖6種碳源，添加量為6%，1%大豆粉為氮源，0.1%的硫酸鎂，0.25%的磷酸二氫鉀，在250 mL錐形瓶中裝液量100 mL，接種量為5%，轉(zhuǎn)速 180 r·min-1，32℃條件下培養(yǎng)10 d，參考童愛均等[13]的方法測定發(fā)酵液總色價；②不同氮源對色素產(chǎn)量的影響：選擇蛋白胨、大豆粉、酵母粉、硝酸鈉、硝酸銨等6 種不同氮源，添加量 1.0%，6%甘油為碳源，0.1%的硫酸鎂，0.25%的磷酸二氫鉀，在250 mL錐形瓶中裝液量100 mL，接種量為5%，轉(zhuǎn)速 180 r·min-1，32℃ 條件下培養(yǎng)10 d，參考童愛均等[13]的方法測定發(fā)酵液總色價；③不同溫度對色素產(chǎn)量的影響：以6%甘油為碳源，1%大豆粉為氮源，0.1%的硫酸鎂，0.25%的磷酸二氫鉀，在250 mL錐形瓶中裝液量為100 mL，接種量為5%，轉(zhuǎn)速 180 r·min-1，培養(yǎng)時間為10 d，考察不同溫度(26、28、30、32、34、36℃)對色素產(chǎn)量的影響。

(2)正交優(yōu)化試驗： 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取甘油添加量、蛋白胨添加量、溫度3個因素，以發(fā)酵液總色價為指標，進行三因素三水平的正交優(yōu)化試驗，因素水平表見表2。

表2　正交試驗的因素和水平

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Design Expert軟件進行正交試驗設(shè)計與分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)高色素紅曲菌的篩選

將分離得到的20株菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)6d后，測定發(fā)酵液總色價，結(jié)果如圖1所示。不同的紅曲菌菌株的產(chǎn)色素能力差異顯著，大多數(shù)產(chǎn)色能力較弱，總色價不超過1 000 U·mL-1。菌株L03、L13、L16產(chǎn)色能力較強，總色價分別為1 190、1 090、1 037 U·mL-1。平行試驗發(fā)現(xiàn)，L03相對L13及L16而言，產(chǎn)色能力更穩(wěn)定。所以本研究選取產(chǎn)色能力最強的菌株L03進行深入研究。

2.2菌株形態(tài)觀察

紅曲菌L03于Wa、PDA、MEA、CYA和G25N等5種培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d的菌落大小、邊緣特征、顏色等見表3。根據(jù)菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落特征和菌落直徑，參照李忠慶等[14]的分類方法，初步推斷L03可能為紫色紅曲菌。

表3　菌株L03的菌落特征

2.3光學顯微鏡觀察

紅曲菌的菌落形態(tài)主要包括三方面：菌絲、有性生殖、無性生殖。紅曲菌的菌絲有的無色透明，有的含深淺不同的紅色色素，有的含深淺不同是褐色色素，含有橫隔，是多細胞構(gòu)造，具有不規(guī)則的分枝，菌絲之間常出現(xiàn)網(wǎng)結(jié)聯(lián)合現(xiàn)象(圖2-A)。紅曲菌在有性生殖的過程中產(chǎn)生球狀的閉囊殼(圖2-B)，其過程首先是在菌絲或側(cè)枝的頂端形成一個多核的雄器，隨后在雄器下面的細胞再長出雌性器官，最后兩性器官周圍生出的許多纏繞在一起的菌絲將二者包圍，形成的閉囊殼。成熟之后的閉囊殼外壁很薄，一般只有一兩層細胞，無孔口，內(nèi)含有大量的子囊孢子，閉囊殼破裂后會將其散出，萌發(fā)后形成多核的菌絲體。紅曲菌在無性生殖的過程中產(chǎn)生分生孢子(圖2-C)。一般著生在菌絲或側(cè)枝小梗的頂端，單生或者以向基式形成鏈。分生孢子是單細胞，多核，球形或倒梨形，通常透明或含少量色素。

2.4菌株的分子生物學鑒定

菌株L03的DNA提取結(jié)果如圖3-A所示，利用Nanodrop 2000測定L03的DNA質(zhì)量濃度為510 ng·μL-1，由于PCR擴增要求DNA質(zhì)量濃度在30～50 ng·μL-1，所以需用雙蒸水稀釋至要求的濃度。4對引物的PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示(圖3-B)不同的引物擴增得到的產(chǎn)物片段大小不同，ITS1/ITS4、ITS4/ITS5和NL1/LS2三對引物擴增片段大小為600～800 bp，擴增片段條帶單一，說明引物擴增效果較好；β-tubulin-F/β-tubulin-R擴增片段大小為1 000～1 500 bp，所有擴增出的條帶均清晰、明亮，說明PCR擴增程序合適，可用于序列的測定。

用NCBI提供的比對搜索程序BLAST與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行相似性分析，從每對引物的比對結(jié)果中選擇相似度≥99%的菌株進行分析(表4).引物ITS1/ITS4的PCR擴增比對結(jié)果的相似性最高的3株，分別為紅色紅曲菌、紫色紅曲菌、 高粱紅曲菌；引物ITS4/ITS5的PCR擴增比對結(jié)果的相似性最高的4株，分別為紅色紅曲菌、紫色紅曲菌、 高粱紅曲菌、橙色紅曲菌；引物NL1/LS2的PCR擴增比對結(jié)果的相似性最高的4株，分別為紅色紅曲菌、紫色紅曲菌、 旱生紅曲菌、紅曲菌屬，L03與這些菌株的相似度都達到99%，所以無法從比對結(jié)果中斷定L03的分類學地位；而β-tubulin-F/β-tubulin-R的PCR擴增比對結(jié)果的相似性最高的6株均為紫色紅曲菌，L03與其相似度達到99%，結(jié)合不同DNA區(qū)域序列的鑒定結(jié)果，可以確定本試驗的目標菌株L03即是紫色紅曲菌，這與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。

2.5高產(chǎn)色素紅曲菌液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1不同碳源對菌株L03色素產(chǎn)量的影響 甘油、蔗糖、燕麥粉、米粉等碳源比較適合菌株L03產(chǎn)色素，其中以甘油處理的色素含量最高，達到1 113 U·mL-1(圖4)，其顏色呈深紫紅色；以蔗糖、燕麥粉和米粉為碳源時顏色均呈紫紅色，以可溶性淀粉為碳源時呈橘紅色。但以α-乳糖作為碳源時呈橘黃色，菌絲生長緩慢，原因可能是L03不能有效的利用α-乳糖，也可能是α-乳糖對菌絲的生長有抑制作用。

表4　菌株L03的PCR擴增測序結(jié)果的比對

2.5.2不同氮源對菌株L03色素產(chǎn)量的影響 在不同的氮源中，以蛋白胨為氮源的色價最高，達到了1 293 U·mL-1，硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨作為氮源時菌絲生長緩慢，色價較低(圖5)。不同的氮源條件下其發(fā)酵液的顏色差別也很明顯，以蛋白胨為碳源時顏色呈深紫紅色，以豆粉和酵母粉為氮源時呈紫紅色，以硝酸鈉為氮源時呈橘紅色。

2.5.2不同溫度對菌株L03色素產(chǎn)量的影響隨著發(fā)酵溫度的上升，菌株L03的產(chǎn)色能力逐漸增強，溫度達到32℃時，發(fā)酵產(chǎn)物總色價達到1 020 U·mL-1。當溫度超過32℃時，產(chǎn)色能力略有下降，因此選取32℃為菌株L03的最佳發(fā)酵溫度。

2.6正交優(yōu)化試驗

從正價試驗結(jié)果(表5)和方差分析結(jié)果(表6)可知，3個因素對L03液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的影響程度大小為：甘油添加量>蛋白胨添加量>發(fā)酵溫度，其中，甘油添加量和蛋白胨添加量對總色價的影響達顯著水平，而溫度對其影響不顯著。最優(yōu)的組合方案是A2B2C2，即甘油的添加量8%、蛋白胨的添加量1.5%、發(fā)酵溫度32℃。

2.7驗證試驗

通過優(yōu)化試驗確定了最優(yōu)的液態(tài)發(fā)酵條件為：以8%的甘油為碳源、1.5%蛋白胨為氮源、0.1%的硫酸鎂、0.25%的磷酸二氫鉀、接種量6%、發(fā)酵溫度32℃、時間9 d、轉(zhuǎn)速180 r·min-1、在250 mL錐形瓶中裝液量100 mL。在此液態(tài)發(fā)酵條件下進行3次穩(wěn)定性驗證試驗，測得發(fā)酵液總色價平均值為1 578 U·mL-1。

表5　正交試驗結(jié)果

表6　方差分析

3討論與結(jié)論

絲狀真菌的分類通常是依據(jù)形態(tài)學和生理生化特征相結(jié)合的方法，但這類方法工作量大，相對繁瑣，而且其準確性有待提高，況且不同學者的分類方法也不同，目前還沒有一個確定統(tǒng)一的方法。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，其應用也逐漸擴展到了紅曲菌菌種鑒定等領(lǐng)域，但是，紅曲菌的親緣關(guān)系非常相似，僅憑借分子生物學的方法也很難將此類菌區(qū)分開，呂旭聰?shù)萚16]從福建紅曲中分離得到了17種紅曲菌，通過結(jié)合形態(tài)學和分子生物學的方法對其進行鑒定，取得了較理想的結(jié)果。

在紅曲菌的形態(tài)鑒定方面以中科院微生物研究所李忠慶和郭芳的方法較為常用，其方法是依據(jù)紅曲菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征、色澤、菌落直徑等。而在分子鑒定方面，所選的DNA片段、引物對鑒定的結(jié)果影響較大，在具體鑒定的過程中，選擇DNA片段及引物，應通過比較測序結(jié)果來確定。對于本試驗的目標菌株L03來說，β-tubulin-F/β-tubulin-R是最適合的分子鑒定引物，其PCR擴增比對結(jié)果的相似性最高的10株均為紫色紅曲菌Monascuspurpureus，L03與其相似度達到100%。

紅曲菌液體發(fā)酵產(chǎn)色素的影響因素很多，如培養(yǎng)基的成分、水分含量、pH、發(fā)酵時間、溫度、接種量、種齡、搖床轉(zhuǎn)速等，發(fā)酵條件的不同會導致紅曲菌產(chǎn)色素種類和產(chǎn)量的明顯差異。其中，碳源和氮源是紅曲菌生長的必需營養(yǎng)物質(zhì)，兩者的種類和含量會對發(fā)酵產(chǎn)生決定性影響。目前，在紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)的過程中常見的碳源有：甘油、蔗糖、米粉等，常見氮源有：蛋白胨、豆粉、酵母粉等。Dikshit R等[21]的研究發(fā)現(xiàn)：以甘油為碳源時可促進色素的產(chǎn)生并提升紅曲菌的生物量，添加甘油并不僅僅是能夠提升培養(yǎng)基中的滲透壓，還能作為一種重要的碳源參與紅曲菌的代謝，這與本研究的結(jié)果一致。就氮源而言，大多數(shù)研究報道了無機氮源更有利于紅曲菌株產(chǎn)色能力的提高，并且無機氮源相對有機氮源產(chǎn)的色素純度更高，介于不同色素之間的雜色素成分較少[16-21]。但本研究的目標菌株L03的最佳氮源為蛋白胨，這可能是由于不同的菌種對氮源的要求和利用能力不一樣造成的。

本研究以胞內(nèi)外總色價為指標，從福建南平、三明、龍巖、古田等地的紅曲米分離純化得到的20株紅曲菌中篩選得到了一株高產(chǎn)色素菌L03。利用形態(tài)學和分子生物學的方法對其進行鑒定，確定了該目標菌株為紫色紅曲菌。并通過單因素和正交優(yōu)化試驗確定了其最佳的液態(tài)發(fā)酵條件：甘油的添加量8%、蛋白胨的添加量1.5%、0.1%的硫酸鎂、0.25%的磷酸二氫鉀、溫度32℃、最適發(fā)酵時間9 d、轉(zhuǎn)速180 r·min、接種量6%、在250mL錐形瓶中裝液量100 mL。

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(責任編輯：黃愛萍)

Screening and Identifying a High Pigment-producingMonacusStrain, and Optimizing Its Liquid Fermentation

JIA Rui-bo1,2,ZHOU Wen-bin1,2,CHEN Jing-hao2，LI Yan1,2,LIU Kai-li1,2,ZHAO Hui1,2,LIU Bin1,2,Lü Xu-cong1,2，3*

(1.NationalEngineeringResearchCenterofJUNCAOTechnology,Fuzhou,Fujian350002,China;2.CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China；3.SunshineInternationalGroupTechnologyDevelopmentCO.,Quanzhou,Fujian362000,China)

Abstract：The Monascus strain, L03, was isolated from the red kojic rice samples collected from Yongchun, Anxi, Gutian, Nanping, Sanming, and Longyan in Fujian for its high red-pigment-producing ability. Based on the morphology and molecular biology of L03, it was identified to be M. purpureus. Subsequently, single factor and orthogonal experiments were conducted to optimize the conditions for the liquid fermentation of the yeast. Color of the fermented suspension reached 1,578 U/mL when the yeast was inoculated 6% by weight into a liquid medium consisting of 8% of glycerol, 1.5 % of peptone, 0.1% of Mg2SO4, and 0.25% of KH2PO4 in a loading volume of 100 mL/250 mL and incubated at 32℃ with constant agitation at the speed of 180 rpm for 9 days.

Key words：red pigment; Monascus; selection; identification; liquid fermentation; optimization

收稿日期：2015-12-12初稿；2016-02-14修改稿

作者簡介：賈瑞博(1991-)，男，在讀碩士生，研究方向：食品生物技術(shù)(E-mail:13044599915@163.com) *通訊作者：呂旭聰(1984-)，男，助理研究員，博士，研究方向：食品生物技術(shù)(E-mail:xucong1154@qq.com)

基金項目：中國博士后科學基金項目(2015M570549)；福建省教育廳科技計劃項目A類課題(JA14107)；福建省自然科學基金項目(2016J01095)

中圖分類號：S 646

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0384(2016)04-424-07

賈瑞博，周文斌，陳竟豪，等.高產(chǎn)色素紅曲菌的篩選鑒定及其液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2016，31(4)：424-430.

JIA R-B，ZHOU W-B，LI Y，et al.Screening and Identifying a High Pigment-producingMonacusStrain, and Optimizing Its Liquid Fermentation[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(4)：424-430.