孫　珍，　劉雅文，　王　迪，　孫玉梅

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034

對(duì)產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的發(fā)酵性絲孢酵母超聲波透性化處理的條件優(yōu)化

孫珍，劉雅文，王迪，孫玉梅*

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034

摘要：發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶，為了把細(xì)胞整體作為脂肪酶催化劑，需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透性化處理。利用超聲波進(jìn)行細(xì)胞透性化的適宜條件為：超聲波輸出功率180 W，每次輻射時(shí)間2 s(間歇時(shí)間5 s)，工作總時(shí)間1.2 min，菌體濃度40 g/L，此條件下細(xì)胞通透性可明顯改善，透性化細(xì)胞脂肪酶表現(xiàn)出較高活力。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵性絲孢酵母； 脂肪酶； 超聲波； 細(xì)胞透性

脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，能夠在非水相系統(tǒng)中催化酯化、轉(zhuǎn)酯、醇解和胺解等反應(yīng)，催化效率高而副反應(yīng)少，反應(yīng)安全無(wú)毒，不需要輔助因子，這些優(yōu)點(diǎn)使得脂肪酶被廣泛應(yīng)用在油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域[1-4]。發(fā)酵性絲孢酵母常用于發(fā)酵產(chǎn)油脂研究[5]，其胞內(nèi)產(chǎn)脂肪酶。細(xì)胞透性化技術(shù)是指不造成細(xì)胞裂解，在不破壞細(xì)胞內(nèi)部有機(jī)結(jié)構(gòu)的情況下改變細(xì)胞膜的通透性，使小分子量物質(zhì)和一些較大分子物質(zhì)能夠自由進(jìn)出細(xì)胞的技術(shù)。經(jīng)過(guò)透性化處理的細(xì)胞稱為透性化細(xì)胞，其在保持細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完整的情況下提高了細(xì)胞的通透性，從而可使胞內(nèi)酶在原位較好地發(fā)揮催化作用，又因胞內(nèi)酶有一定保護(hù)作用，可延長(zhǎng)酶的使用壽命[6,7]。細(xì)胞透性化處理包括化學(xué)法，生物法和物理法。

為了使發(fā)酵性絲孢酵母的胞內(nèi)脂肪酶在不提取的情況下直接催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，我們使用物理法中的超聲法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透性化處理，以脂肪酶活力為考察指標(biāo)，應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行透性化處理?xiàng)l件的優(yōu)化。

1材料與方法

1.1材料與儀器

722-型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司； PHS-3C精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；78-1型磁力加熱攪拌器，江蘇金壇國(guó)華儀器廠；超聲波破碎儀(JY99-2D)，寧波新芝科器研究所。

實(shí)驗(yàn)用發(fā)酵性絲孢酵母菌種(CICC1368)來(lái)自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

1.2.1.1固體斜面培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨10，瓊脂20，pH自然。于0.1 MPa滅菌15 min。

1.2.1.2種子培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖100，蛋白胨5.3，酵母浸粉2，尿素2，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。除尿素外的其余成分于0.08 MPa 滅菌20 min，尿素在0.05 MPa 滅菌15 min。

1.2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖100，蛋白胨1.8，酵母浸粉0.5，KH2PO42，植物油8.5，吐溫-80 4.6，pH自然。于0.08 MPa 滅菌20 min。

1.2.2細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

將4℃保存的菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48 h。取兩環(huán)斜面培養(yǎng)的菌絲接入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10% (v/v)的液體種子，于30 ℃、160 r/min搖床發(fā)酵60 h，所得發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體，用0.067 mol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，離心收集菌體。

1.2.3超聲波法細(xì)胞透性化條件的研究

1.2.3.1透性化細(xì)胞的制備

按“1.2.2”所述方法，收集菌體,再與磷酸鹽緩沖液混合，制得20 g/L的菌懸液。于冰水浴中，在設(shè)定條件下進(jìn)行超聲處理，溫度設(shè)置4 ℃，10 000 r/min離心10 min，收集上清液。用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體沉淀2次，即為透性化細(xì)胞。

1.2.3.2超聲波輸出功率對(duì)細(xì)胞透性化的影響

設(shè)置超聲波輻射時(shí)間為2 s、間隙時(shí)間為5 s、工作總時(shí)間為2 min，考察超聲波輸出功率分別為80 W、120 W、160 W、200 W和240 W的條件下進(jìn)行透性化處理的效果。離心洗滌后得到上清液和透性化細(xì)胞，分別測(cè)定上清液和透性化細(xì)胞脂肪酶活力。

1.2.3.3超聲波每次輻射時(shí)間對(duì)細(xì)胞透性化的影響

設(shè)置超聲波輸出功率為160 W、間隙時(shí)間為5 s，工作總時(shí)間為2 min，考察超聲輻射時(shí)間分別為1 s、1.5 s、2 s、2.5 s和3 s的條件下進(jìn)行透性化處理的效果。離心洗滌后得到上清液和透性化細(xì)胞，分別測(cè)定上清液和透性化細(xì)胞脂肪酶活力。

1.2.3.4超聲波工作總時(shí)間對(duì)細(xì)胞透性化的影響

設(shè)置超聲波輸出功率為160 W、超聲波每次輻射時(shí)間為2 s，間隙時(shí)間為5 s，考察超聲工作總時(shí)間分別為0.2 min、0.5 min、1 min、2 min和3 min的條件下進(jìn)行透性化處理的效果，離心洗滌后得到上清液和透性化細(xì)胞，分別測(cè)定上清液和透性化細(xì)胞脂肪酶活力。

1.2.3.5菌體濃度對(duì)細(xì)胞透性化的影響

按“1.2.2”所述方法，稱取5份不同克數(shù)的菌體分別與25 mL磷酸鹽緩沖液混合，制成菌體濃度為20 g/L、25 g/L、30 g/L、50 g/L和100 g/L的菌懸液，置于冰水浴中，在超聲輸出功率為160 W、輻射時(shí)間為2 s，間隙時(shí)間為5 s，工作總時(shí)間為1 min的條件下進(jìn)行透性化處理，離心洗滌后得到上清液和透性化細(xì)胞，分別測(cè)定上清液和透性化細(xì)胞脂肪酶活力。

1.2.3.6細(xì)胞透性化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以透性化細(xì)胞脂肪酶活性大小為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)[8]。

1.2.4測(cè)定方法

1.2.4.1脂肪酶活力測(cè)定

(1) 反應(yīng)底物(PVA)的制備：40 g聚乙烯醇(PVA)加熱溶解在800 mL水中，冷卻后定容至1 000 mL。用干凈的雙層紗布過(guò)濾。量取上述濾液150 mL，加入50 mL橄欖油，用高速勻漿機(jī)處理6 min(分兩次處理，間隔5 min，每次3 min)，即得乳白色PVA乳化液。該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配[9]。

(2) 脂肪酶活力測(cè)定：采用酸堿滴定法定量測(cè)定。取兩個(gè)100 mL三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中加入4 mL PVA橄欖油乳化液和5 mL磷酸鹽緩沖液(0.067 mol/L，pH 6.8)，再于A瓶中加入95%乙醇15 mL，于38 ℃水浴中預(yù)熱5 min，然后于A、B瓶中各加入1 mL待測(cè)酶液，立即混勻，反應(yīng)10 min，于B瓶中加15 mL 95%乙醇終止反應(yīng)。于空白和樣品溶液中各加兩滴酚酞指示劑，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定水解產(chǎn)生的脂肪酸[10]。

(3) 脂肪酶活力定義：在38 ℃、pH 6.8的反應(yīng)條件下，將每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需酶量，即被定義為一個(gè)脂肪酶活力單位[11]。

2結(jié)果與討論

2.1細(xì)胞透性化單因素試驗(yàn)

2.1.1超聲波輸出功率對(duì)細(xì)胞透性化的影響

如圖1可見(jiàn)，超聲波輸出功率對(duì)細(xì)胞透性化的影響較大。隨著輸出功率的增加，透性化細(xì)胞脂肪酶活力先升高后降低，在160 W達(dá)到極大值。輸出功率反映了超聲波能量的大小，輸出功率的增加，有利于改善細(xì)胞通透性；但是輸出功率過(guò)大，則會(huì)引起細(xì)胞破碎，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪酶釋放到胞外，從而降低了透性化細(xì)胞的脂肪酶活力[12]。因此，選定超聲波透性化的輸出功率為160 W。

圖1　超聲波輸出功率對(duì)透性化細(xì)胞脂肪

2.1.2超聲波每次輻射時(shí)間對(duì)細(xì)胞透性化的影響

如圖2所示，透性化細(xì)胞脂肪酶活性隨每次輻射時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，每次輻射時(shí)間為2 s的透性化效果最好。每次輻射時(shí)間太短，空化效應(yīng)起不到透性化作用；但輻射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空化效應(yīng)增加細(xì)胞破碎，使細(xì)胞內(nèi)的脂肪酶釋放到胞外，降低了透性化細(xì)胞的脂肪酶活力[13]。因此，選定超聲波透性化的每次輻射時(shí)間為2 s。

圖2　超聲波每次輻射時(shí)間對(duì)透性化細(xì)胞脂肪

2.1.3超聲波工作總時(shí)間對(duì)細(xì)胞透性化的影響

由圖3可見(jiàn)，透性化細(xì)胞脂肪酶活性隨工作總時(shí)間的增加而增加，工作總時(shí)間為1 min的脂肪酶表現(xiàn)出最大活力，透性化效果最好。進(jìn)一步提高工作總時(shí)間，透性化細(xì)胞脂肪酶活力則顯著下降[12]。因此，選定超聲波透性化的工作總時(shí)間為1 min。

2.1.4菌體濃度對(duì)細(xì)胞透性化的影響

由圖4可知，透性化細(xì)胞脂肪酶活性隨菌體濃度的增加先升高后降低，菌體濃度為50 g/L的酶活力最大。這是因?yàn)榫w濃度較低時(shí)，總蛋白量較小，并且超聲波在水中傳遞的損失較大，透性化效果相應(yīng)較差；菌體濃度的提高使液體總蛋白質(zhì)的量增大，在超聲波作用后透性化細(xì)胞蛋白質(zhì)的量也就增大。但菌液濃度過(guò)高時(shí)，液體粘稠度的增加，不利于空化作用，導(dǎo)致透性化效果較差[14]。因此，選定超聲波透性化的菌體濃度為50 g/L。

圖3　超聲波工作總時(shí)間對(duì)透性化細(xì)胞脂肪

圖4　菌體濃度對(duì)透性化細(xì)胞脂肪酶活性的影響

2.2細(xì)胞透性化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1細(xì)胞透性化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以透性化細(xì)胞脂肪酶活性大小為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)表3的方差分析可以看出，C的平方和非常小，則用其作為誤差估計(jì)項(xiàng)。在所設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi)，A和B對(duì)透性化細(xì)胞酶活有顯著的影響(p < 0.05)。各因素對(duì)酶活的影響程度依次為D > A > B > C，綜合表2的K值并直接比較可知，最佳工藝參數(shù)為D3A3B2C3，即菌體濃度為40 g/L，超聲波輸出功率為180 W，每次輻射時(shí)間2 s(間歇時(shí)間5 s)，工作總時(shí)間1.2 min時(shí)透性化效果最好。

表1　細(xì)胞透性化L9(34)正交因素設(shè)計(jì)水平表

表2　細(xì)胞透性化正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3　細(xì)胞透性化正交試驗(yàn)的方差分析

2.2.1細(xì)胞透性化驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)確定的最佳透性化條件D3A3B2C3，以透性化細(xì)胞脂肪酶活性為指標(biāo)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此最優(yōu)條件下三次測(cè)得酶活的平均值為30.12 U/g，高于正交試驗(yàn)結(jié)果的最大值，因此認(rèn)為正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)水平是可靠的。在這里要說(shuō)明一下，因?yàn)閱我蛩卦囼?yàn)和正交試驗(yàn)所用非同一批次細(xì)胞，不同批次細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)存在差異，因此細(xì)胞經(jīng)透性化處理后的脂肪酶活力也會(huì)有差異，從而導(dǎo)致單因素試驗(yàn)中透性化細(xì)胞的脂肪酶活力較正交試驗(yàn)的還要高的現(xiàn)象。

3結(jié)論

發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶，本實(shí)驗(yàn)利用超聲波技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透性化處理，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)確定了利用超聲波進(jìn)行細(xì)胞透性化的適宜條件為：超聲波輸出功率180 W，每次輻射時(shí)間2 s(間歇時(shí)間5 s)，工作總時(shí)間1.2 min，菌體濃度40 g/L，在上述工藝條件下可以使發(fā)酵性絲孢酵母透性化并使其中的脂肪酶活力較高。

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Optimization of conditions of ultrasonic permeabilization for intracellular lipase-producingTrichosporonfermentans

SUN Zhen, LIU Ya-wen, WANG Di, SUN Yu-mei

School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

AbstractThe lipase from Trichosporon fermentans was intracellular enzyme. The permeability of Trichosporon fermentans cell was improved by treating cells with ultrasonication. The intracellular lipase activity after permeabilization was enhanced under the optimal treating conditions: output power 180 W, irradiation duration 2 s per each time (with a 5 s interval), total irradiation time 1.2 min, cell concentration 40 g/L.

Key wordsTrichosporon fermentans; lipase; ultrasonication; cell permeabilization

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31401681)，遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2015049)。

作者簡(jiǎn)介：孫珍(1986～)，女，博士，講師。E-mail: sunzhen@dlpu.edu.cn。 *通訊作者：孫玉梅(1962～)，女，博士，教授。電話：0411-86318692，E-mail: sunyumei62@163.com。