張　燕，　刁寧寧，　黃勛娟，　張建國,2*

1.上海理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093,2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津 300457

發(fā)酵罐中利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水的研究

張燕1，刁寧寧1，黃勛娟1，張建國1,2*

1.上海理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093,2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津 300457

摘要：利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水的優(yōu)點(diǎn)是黑曲霉安全性好、菌絲球易收獲、利于降低成本且可以減少傳統(tǒng)處理方式所產(chǎn)生的污泥量。在前期研究的基礎(chǔ)之上，在攪拌式發(fā)酵罐中考察了黑曲霉菌絲球降低豆制品廢水化學(xué)需氧量(COD)的條件。研究結(jié)果表明，當(dāng)豆制品廢水初始COD在2×103 mg/L，黑曲霉孢子濃度為1.44×103/L時，黑曲霉的菌絲能夠在攪拌式發(fā)酵罐中形成形態(tài)均一的菌絲球，同時可將廢水的COD降至842 mg/L，COD去除率達(dá)55.7%。該研究結(jié)果為在攪拌式發(fā)酵罐中利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豆制品廢水； 黑曲霉； 菌絲球； 化學(xué)需氧量

黑曲霉是一種菌絲體呈絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀的絲狀真菌，在工業(yè)上應(yīng)用廣泛。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)由黑曲霉生產(chǎn)的產(chǎn)物是食品級安全的產(chǎn)品(Generally Regard As Safe)[1]。黑曲霉被廣泛用于生產(chǎn)胞外酶和有機(jī)酸[2]，如葡糖淀粉酶、果膠酶和半乳糖苷酶等。在深層發(fā)酵過程中，黑曲霉形成菌絲球形態(tài)使檸檬酸產(chǎn)量提高[3]，控制菌絲形態(tài)能有效的控制黑曲霉的代謝產(chǎn)物[4]。黑曲霉還可用于污水處理[5]，能夠有效降解廢水中的有機(jī)物質(zhì)，吸附色素并降低廢水的化學(xué)需氧量(COD)[6]。黑曲霉的菌絲球具有厭氧顆粒污泥和好氧顆粒污泥所不具備的諸多優(yōu)點(diǎn)[7]，例如沉降速度快、易于固液分離、應(yīng)用廣泛等。Silva等利用黑曲霉菌株AN400在間歇反應(yīng)器中處理乳品廢水[8]。Hernandez等利用黑曲霉菌株UO-1處理不同淀粉濃度的啤酒和肉制品廢水[9]。

在工業(yè)發(fā)酵越來越流行的今天，發(fā)酵工程也越來越目標(biāo)化、精細(xì)化、自動化[10]。這要求對發(fā)酵工藝的數(shù)學(xué)模型和優(yōu)化技術(shù)進(jìn)行研究，并考慮形態(tài)上培養(yǎng)液流變學(xué)和質(zhì)量傳遞的影響，從而實(shí)現(xiàn)按比例放大發(fā)酵工藝，并建立完善的控制工藝參數(shù)[11, 12]?？紤]到各種生物反應(yīng)器的流動模式有所區(qū)別，可以假設(shè)，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液能混合完全，而在用于工業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模生物反應(yīng)器中則需一定混合時間才能達(dá)到95%的均一性[13]。培養(yǎng)液混合程度、葡萄糖、pH值和溫度梯度對發(fā)酵過程均有顯著影響[14, 15]。如果培養(yǎng)液混合程度過低，會影響培養(yǎng)基的氧含量，進(jìn)而影響發(fā)酵[16]。本文對發(fā)酵罐中黑曲霉降低豆制品廢水COD的培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，確定黑曲霉形成菌絲球同時降低豆制品廢水COD的條件，為后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1廢水、試劑和設(shè)備

豆制品廢水取自上海清美綠色食品有限公司?；瘜W(xué)藥品購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。發(fā)酵罐(BLBIO-2L，2L)購自上海百倫生物科技有限公司。

1.1.2菌株與培養(yǎng)基

黑曲霉菌株(TCCC4002)取自工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基固體55，115 ℃滅菌20 min。察氏培養(yǎng)基(g/L)：無水葡萄糖2.5，NaNO33，K2HPO4·3H2O 1，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，pH 5.6，115 ℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1菌體保藏

用無菌蒸餾水洗下PDA培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子，制備孢子懸浮液。將懸浮液與50%甘油按1∶1(v/v)混合均勻，分裝后置-70 ℃保存。每月重新活化后保存。

1.2.2黑曲霉菌絲球的制備

1.5 L豆制品廢水用NaOH溶液調(diào)pH至5.5后倒入發(fā)酵罐，115 ℃滅菌20 min。冷卻后接種。發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量1 vvm，溫度30 ℃?？疾戽咦訚舛葘谇菇档投怪破窂U水COD的影響時，孢子接種濃度分別為3.52×104、1.41×104、3.52×103、7.04×102和70.4 /L。考察轉(zhuǎn)速的影響時，轉(zhuǎn)速梯度選取150 r/min、200 r/min、250 r/min、400 r/min，30 ℃，pH 4.5，通氣量1vvm，孢子濃度7.04×102/L?？疾於怪破窂U水濃度的影響時采用稀釋的方法，向不同稀釋倍數(shù)的廢水中添加營養(yǎng)元素(表1)，黑曲霉孢子濃度1.44×103/L。

表1　不同稀釋倍數(shù)豆制品廢水中營養(yǎng)

1.2.3孢子濃度對豆制品廢水處理的影響

發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速200 r/min，初始pH 5.5，溫度30 ℃。豆制品廢水稀釋10倍后添加營養(yǎng)元素(見表1)。孢子濃度分別為1.44×107、1.44×106、1.44×105、7.20×104、1.44×103/L。其它條件同1.2.2。

2結(jié)果與分析

2.1孢子濃度對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響

黑曲霉孢子濃度對降低豆制品廢水COD的影響見圖1。從圖中可看出，培養(yǎng)72 h，當(dāng)孢子濃度在70.4～3.52×104/L范圍內(nèi)時，可不同程度的降低豆制品廢水的COD。五個批次(孢子濃度從高到低)的COD降低幅度分別為20.9%、20%、46%、32.9%、35.8%。孢子濃度為3.52×103/L時COD降低幅度最大。但五個批次的培養(yǎng)均未能形成均一的菌絲球。

圖1　孢子濃度對黑曲霉降低豆

2.2轉(zhuǎn)速對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響

分別采用轉(zhuǎn)速150 r/min、200 r/min、250 r/min和400 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，72 h后菌絲均呈無序狀。豆制品廢水COD降低幅度依次為3.2%、21.1%、16.6%、-2.2%。200 r/min～250 r/min之間黑曲霉生長狀況較好，廢水COD有較顯著的降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min時，COD沒有降低，這可能是因過高轉(zhuǎn)速影響了菌絲的生長(圖2)。

2.3稀釋倍數(shù)對黑曲霉在豆制品廢水中降低COD的影響

將豆制品廢水稀釋不同倍數(shù)后添加營養(yǎng)元素(硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、七水合硫酸鎂)至初始豆制品廢水中主要營養(yǎng)元素的濃度。黑曲霉孢子的接種濃度為1.44×103/L。培養(yǎng)72 h之后，稀釋2、5和10倍的豆制品廢水和原豆制品廢水的COD降低幅度分別為4.3%、22.8%、10.4%、24.2%。經(jīng)過168 h培養(yǎng)后稀釋5、10倍的豆制品廢水COD分別為47.0%和37.3%。最終COD分別降低到842 mg/L和1.74×103mg/L(圖3)。觀察菌絲球的形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，稀釋倍數(shù)越大，菌絲球形態(tài)越均勻。提高稀釋倍數(shù)降低了培養(yǎng)液的粘度，改善了培養(yǎng)液的流動特性，因此可以形成更加均勻的菌絲球。

圖2　轉(zhuǎn)速對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響

圖3　稀釋倍數(shù)對黑曲霉在豆制品廢

2.4孢子濃度對稀釋后豆制品廢水COD的影響

將豆制品廢水稀釋10倍后添加營養(yǎng)元素(硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、七水合硫酸鎂)，調(diào)整pH至5.5。孢子濃度對稀釋后豆制品廢水COD的影響見圖4。從圖中可看出，廢水COD隨時間延長顯著降低。72 h培養(yǎng)后，按孢子濃度從高到低，廢水COD降低幅度分別為22.7%、19.1%、22.4%、22.5%、24.2%。孢子濃度為7.20×104/L時，經(jīng)過144 h培養(yǎng)，COD降低至821 mg/L。孢子濃度為1.44×103/L時，經(jīng)168 h的培養(yǎng)，COD降低至842 mg/L。菌絲球形態(tài)均勻，直徑?jīng)]有明顯變化。孢子濃度高于1.44×105/L時，孢子濃度越高形成的菌絲球越多，經(jīng)過84 h培養(yǎng)后，菌絲球出現(xiàn)裂解、分散的現(xiàn)象。這可能是攪拌槳對菌絲球造成破壞的結(jié)果。圖5是稀釋10倍后豆制品黃降水中形成的黑曲霉菌絲球，以及經(jīng)過處理后的豆制品廢水。從圖中可看出，菌絲球形態(tài)均一，易于收獲，經(jīng)菌絲球處理后的豆制品廢水澄清。

圖4　孢子濃度對稀釋后豆制品廢水COD的影響

(a)

(b)　　　　　　(c)　　　　　　(d)

3結(jié)論

當(dāng)前有關(guān)絲狀真菌菌絲球形態(tài)的研究報(bào)道較多，尤其是關(guān)于黑曲霉的菌絲形態(tài)[17]。黑曲霉可被用于發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，不少學(xué)者關(guān)注400 μm直徑的黑曲霉菌絲球[18]，是因?yàn)楹谇股a(chǎn)檸檬酸時最佳形態(tài)是形成400 μm直徑的菌絲球，當(dāng)直徑超過400 μm時會出現(xiàn)氧氣傳遞的限值[19]。絲狀真菌在搖瓶中形成較大菌絲球的現(xiàn)象比較普遍，但在發(fā)酵罐中形成菌絲球的報(bào)道較少，是目前研究的一個熱點(diǎn)。黑曲霉菌可以代謝豆制品廢水中的營養(yǎng)物質(zhì)，且菌絲球體積較大、易于收獲，本研究利用黑曲霉菌來處理豆制品廢水，在發(fā)酵罐條件下，對影響黑曲霉菌菌絲球形成的條件進(jìn)行了研究?；诙怪破窂U水簡單操作的原則，考察了孢子濃度、轉(zhuǎn)速、營養(yǎng)水平對黑曲霉形成菌絲球的影響。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)整豆制品廢水的營養(yǎng)水平可使黑曲霉形成形態(tài)均一的菌絲球。當(dāng)豆制品廢水COD為2×103mg/L，孢子濃度為1.44×103/L時，在攪拌式發(fā)酵罐中黑曲霉能形成形態(tài)均一的菌絲球，此時COD可降至842 mg/L，COD去除率55.7%。在豆制品企業(yè)中，高濃度廢水經(jīng)板框過濾、初沉池后，COD約為(2～3)×103mg/L，所以本研究中黑曲霉形成菌絲球時的營養(yǎng)水平與豆制品企業(yè)的實(shí)際工藝參數(shù)相近。不足之處是COD去除率較低，這可能是由于小型發(fā)酵罐中溶氧的限制，導(dǎo)致黑曲霉菌代謝速率較慢。在后繼研究中，將發(fā)酵規(guī)模放大，改善溶氧水平后，有望提高豆制品廢水的COD去除率。

參考文獻(xiàn)

[1]Schuster E, Dunn-Coleman N, Frisvad JC,etal. On the safety ofAspergillusniger-a review [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 59(4): 426-435.

[3]Papagianni M. Advances in citric acid fermentation byAspergillusniger: Biochemical aspects, membrane transport and modeling [J]. Biotechnology Advances, 2007, 25(3): 244-263.

[4]牛坤, 毛健, 鄭裕國. 無機(jī)微粒添加對絲狀微生物發(fā)酵過程的影響 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2015, 55(3): 258-263.

[5]黃勛娟, 張建國,刁寧寧. 優(yōu)化黑曲霉菌絲球形成條件提高豆制品廢水處理效率 [J]. 工業(yè)微生物, 2014. 44(3): 41-48.

[6]黃勛娟, 刁寧寧,張建國. 黑曲霉菌絲球的形成及應(yīng)用研究綜述 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(11): 171-176.

[7]朱虹. 菌絲球形成過程及其影響因素的研究 [D]. 2007, 哈爾濱工業(yè)大學(xué).

[8]Silva LVCE, Andrade MVF, Rodrigues K,etal. Treatment of synthetic dairy wastewater in batch reactors inoculated withAspergillusnigerAN400 [J]. Engenharia Sanitaria e Ambiental, 2013, 18(4): 371-380.

[9]Hernández MS, Rodrígueza MR, Guerra NP,etal. Amylase production byAspergillusnigerin submerged cultivation on two wastes from food industries [J]. Journal of Food Engineering, 2006, 73(1): 93-100.

[10]劉建忠,翁麗萍,張黔玲等. 黑曲霉過氧化氫酶發(fā)酵過程的數(shù)學(xué)模型 [J]. 工業(yè)微生物, 2002(3), 32: 6-9.

[11]Formenti LR, N?rregaard A, Bolic A,etal. Challenges in industrial fermentation technology research [J]. Biotechnology Journal, 2014, 9(6): 727-738.

[12]熊曉輝, 張李陽, 韋策等. 固體發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的動力學(xué)模型 [J]. 工業(yè)微生物, 2003, 33(4): 27-31.

[13]Gabelle JC, Augier F, Carvabo A,etal. Effect of tank size on kLa and mixing time in aerated stirred reactors with non-newtonian fluids [J]. Canadian Journal of Chemical Engineering, 2011, 89(5): 1139-1153.

[14]Larsson G, T?rnkvist M, St?hl Wernersson E,etal. Substrate gradients in bioreactors: origin and consequences [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 1996, 14(6): 281-289.

[15]Beltran G, Novo M, Guillamón JM,etal. Effect of fermentation temperature and culture media on the yeast lipid composition and wine volatile compounds [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(2): 169-177.

[16]Zhang HT, Zhu L, Liu D,etal. Model-based estimation of optimal dissolved oxygen profile inAgrobacteriumsp. fed-batch fermentation for improvement of curdlan production under nitrogen-limited condition [J]. Biochemical Engineering Journal, 2015, 103: 12-21.

[17]Grimm LH, Kelly R, Krull R,etal. Morphology and productivity of filamentous fungi [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 69(4): 375-384.

[18]Whitaker A, Long P. Fungal pelleting [J]. Process Biochemistry, 1973, 8(11): 27-31.

[19]Batt CA, Tortorello ML. Encyclopedia of food microbiology [M]. 2014, Academic Press.

Soybean product wastewater treatment byAspergillusnigerthrough pellet formation in fermentor

ZHANG Yan1, DIAO Ning-ning1，HUANG Xun-juan1，ZHANG Jian-guo1,2

1.Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, P.R.China；2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology (Tianjin University of Science & Technology,Ministry of Education, Tianjin, 300457, P.R.China

AbstractAspergillus niger pellet is a good approach for soybean wastewater treatment because of its good safety record, easy recovery of pellets morphology, low cost and low sludge production. On the basis of previous research, Aspergillus niger was cultivated in mechanical agitated fermentor to form pellets and treat soybean wastewater. The condition of reducing chemical oxygen demand (COD) of wastewater by using Aspergillus niger pellets was investigated. Research results showed that when the initial COD of wastewater and initial spore concentration were 2×103 mg/L and 1.44×103/L respectively, the uniform mycelium pellets could be observed in the fermentor. COD reduced to 842 mg/L and the removal rate of COD reached 55.7%. This result provided a reference basis for treating soybean wastewater using Aspergillus niger pellets in stirring-type fermentor.

Key wordssoybean products wastewater; Aspergillus niger; pellets; chemical oxygen demand

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No.21306112)；上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.13ZR1429100)；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃(No.slg14037)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金；工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))開放基金資助項(xiàng)目(No.2013IM002);上海市研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助。

作者簡介：張燕(1991～)，女，碩士研究生；研究方向：微生物過程工程。E-mail：zhangyan399@foxmail.com。 *通訊作者：張建國，男，副教授。Tel：86-21-55803272，E-mail：jgzhang@usst.edu.cn。