鄭立浪,陳月圓,盧鳳來,李典鵬**

(1.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林　541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所,廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，廣西桂林　541006)

尾巨桉化感作用對廣金錢草化學成分的影響*

鄭立浪1,2,陳月圓2,盧鳳來2,李典鵬2**

(1.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所,廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，廣西桂林541006)

摘要:【目的】研究尾巨桉Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis對廣金錢草Desmodium styracifolium(Osb.) Merr.藥材化學成分的影響，探索尾巨桉-廣金錢草復合經(jīng)營模式的可行性。【方法】在試驗田中,以不同類型和重量的尾巨桉落葉鋪蓋在土壤上并種植廣金錢草,同時另在尾巨桉人工林中直接套種廣金錢草，待藥材成熟后統(tǒng)計其產(chǎn)量，并利用HPLC指紋圖譜法及含量測定法檢測其化學成分變化?！窘Y果】廣金錢草在尾巨桉林下種植時,產(chǎn)量稍有下降，但藥材指紋圖譜與正常種植無顯著差異?！窘Y論】廣金錢草可以套種在尾巨桉人工林下。

關鍵詞：尾巨桉廣金錢草化學成分HPLC

0引言

【研究意義】尾巨桉(Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis)[1]具有生長迅速、產(chǎn)量高和木材品質穩(wěn)定等特點[2]，是近年我國南方地區(qū)大力度推廣種植的速生桉良種之一，大范圍種植于廣東、廣西、海南等地[3]。目前，桉樹人工林快速發(fā)展，帶來了巨大的經(jīng)濟利益，但是其對環(huán)境的影響也越來越受到關注[4]。種植大面積桉樹林可能會嚴重降低土壤中的水分、生物多樣性和N、P、K等礦質元素養(yǎng)分。通過開展桉樹人工林復合經(jīng)營模式的研究，以解決大面積種植桉樹純林的負面效應，一直是桉樹人工林科學發(fā)展的重要課題[5]?！厩叭搜芯窟M展】廣金錢草Desmodium styracifolium (Osb. ) Merr.具有清熱除濕，利尿通淋的功效，用于治療各種熱病，水腫等疾病。該藥材在廣西不同地區(qū)均有規(guī)?；N植[6]。目前已有桉樹-藥材復合等經(jīng)營模式的研究工作?；凶饔檬侵参锘蛭⑸锏拇x分泌物對環(huán)境中其它植物或微生物產(chǎn)生的有利或不利的作用。桉樹的化感作用會抑制其林下生物的生長[7]?！颈狙芯壳腥朦c】在桉樹林地內套種廣金錢草，對其生長、藥效基礎物質(次生代謝產(chǎn)物的改變)的影響，目前未見有相關報道。【擬解決的關鍵問題】通過在試驗田中,以不同類型和重量的尾巨桉葉子鋪蓋其土壤之上種植廣金錢草,和在尾巨桉人工林中直接套種廣金錢草的方式,比較藥材的產(chǎn)量,及HPLC指紋圖譜法檢測主要化學成分的影響，為桉樹-廣金錢草復合經(jīng)營模式提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，中藥粉碎機，R210型旋轉蒸發(fā)儀(Buchi)，KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑

水(娃哈哈純凈水)，乙腈(美國fisher公司)，三氟乙酸(上海源葉科技)，甲醇(西隴化工)，夏佛塔苷標準品(成都瑞芬思生物科技有限公司)。

1.3材料

前期化學成分分析發(fā)現(xiàn)，尾巨桉的不同葉子，即綠葉、黃葉、灰葉的化學成分有較明顯的差異。綠葉為直接從樹上采摘風干，保持原有綠色；黃葉為掉落不久的桉樹葉，為金黃色；灰葉為從林地收集的桉樹枯落葉，為灰色。于廣西黃冕林場同一林地內采集3種葉子，并室內陰干以備用。廣金錢草幼苗由當?shù)剞r(nóng)民提供，另外從市場上購買10個批次的合格廣金錢草藥材(編號為1～10)，作為對照用。所有材料經(jīng)過廣西植物研究所分類室韋發(fā)南研究員鑒定。

1.4方法

1.4.1不同種植條件對廣金錢草生長的影響

分別在廣金錢草種植地上鋪尾巨桉葉(試驗1),及在尾巨桉林地內種植廣金錢草(試驗2)。開展試驗1的試驗田位于廣西桂林市雁山區(qū)廣西植物研究所平地，首先將試驗地劃分為1 m×1 m的小塊，間隔40 cm，每個小塊等間距種植廣金錢草幼苗9株，并分別鋪灰葉、綠葉和黃葉，每種葉子設置800 g/m2(尾巨桉人工林自然凋落量[8])和1 600 g/m2兩個濃度，每個處理設置5個重復。試驗2在廣西黃冕林場波寨分場進行，所在地為坡地，桉樹為4年生二代林，平均株距1.5 m。將試驗地內所有雜草及灌木鏟除，松動土壤，設置3個重復，每塊地面積為6.9 m×5.8 m。種植密度與試驗1相同，均在6月份的陰雨天，選擇長勢健壯，大小一致的幼苗進行移栽,具體見表1。日常管理參考當?shù)剞r(nóng)民的管理方法。于10月初收割其所有地上部分，稱量鮮重后自然陰干并稱干重。

表1不同種植條件的樣品編號

Table1Sample of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.under different planting conditions

樣品編號SampleNo.種植條件Plantingcondition樣品編號SampleNo.種植條件Plantingcondition1～10市場上購買Buyingonthemarket15大田,土表鋪尾巨桉綠葉1600g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreenleaves1600g/m211尾巨桉樹林下E.urophylla×E.grandisartificialforest16大田,土表鋪尾巨桉綠葉800g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreenleaves800g/m212大田,土表鋪尾巨桉葉0g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisleaves0g/m217大田,土表鋪尾巨桉黃葉1600g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisyellowleaves1600g/m213大田,土表鋪尾巨桉灰葉1600g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreyleaves1600g/m218大田,土表鋪尾巨桉黃葉800g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisyellowleaves800g/m214大田,土表鋪尾巨桉灰葉800g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreyleaves800g/m2

1.4.2HPLC法測定不同種植條件下廣金錢草的主要成分

供試品溶液的制備[8]：取廣金錢草陰干樣品(編號1～18)，稱取20 g，加500 mL水，超聲30 min，倒出，殘渣加300 mL水，超聲30 min，合并兩次提取液用布氏漏斗和兩層濾紙抽濾，取100 mL濃縮至干，用50%(V/V)甲醇2 mL溶解，過0.45 μm濾膜，置于樣品瓶內備用。

色譜條件：色譜柱使用Poroshell 120 SB-AQ(4.6 mm×100 mm，2.7-micron)，柱溫30℃，檢測波長270 nm，進樣量10 μL，流速0.7 mL/min，流動相為A(乙腈)-B(水，含0.005 mol/L三氟乙酸)，采用梯度洗脫程序：0～10 min，5%～10% A；10～40 min，10%～15% A；40～50 min，15%～16% A；50～55 min，16%～100% A。

色譜儀精密度實驗：取1號樣品，自動進樣器連續(xù)進樣5次；穩(wěn)定性實驗：取1號樣品，分別在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h進樣測定；重復性實驗：取1號樣品5份，自動進樣檢測。

指紋圖譜的建立：取1～10號樣品進行指紋圖譜測定。樣品的 HPLC圖譜數(shù)據(jù)以AIA格式文件導出，將文件導入國家藥典委員會2004A版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，按多點校正，自動匹配，以中位數(shù)法，生成對照圖譜，導出對照圖譜。取11～18號樣品,獲得HPLC圖譜數(shù)據(jù)的AIA文件并導入對照圖譜(設置為參照譜)，選擇若干主要峰，手工多點校正，自動匹配，獲得相似度數(shù)據(jù)。

夏佛塔苷含量的測定：參照2015版《中國藥典》的方法[9]，使用液相色譜法，以夏佛塔苷標準品為對照建立標準曲線，R=99.999%，依次測量各樣品的夏佛塔苷含量。

2結果和分析

2.1不同種植條件對廣金錢草產(chǎn)量的影響

以樣品12為對照(表2)，種植在尾巨桉人工林下的廣金錢草產(chǎn)量較低，為32%；樣品13～18，雖然其產(chǎn)量有稍微降低，但未有統(tǒng)計學意義，因此可認為在模擬試驗中,尾巨桉葉子對廣金錢草的生長未產(chǎn)生明顯影響。

2.2不同種植條件下廣金錢草HPLC指紋圖譜

色譜儀精密度、穩(wěn)定性、重復性實驗結果顯示，各主要色譜峰的相對保留時間的RSD和相對峰面積的RSD均小于5%，說明儀器精密度良好，在96 h內穩(wěn)定，獲得的指紋圖譜真實可靠，重復性良好，實驗結果可靠。

表2不同種植條件下廣金錢草的產(chǎn)量

Table 2Yield of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.under different planting conditions

樣品編號SampleNo.地上部分鮮重Freshweightontheground(g/m2)地上部分干重Dryweightontheground(g/m2)地上部分干濕重比Dryandwetweightratioontheground(%)產(chǎn)量百分比Outputpercentage(%)1114924633132124675141530100133500128834911436251325349415450013503096163950131326931750001383289818400013732997

HPLC色譜圖顯示(圖1)，各樣品的色譜峰沒有顯著改變。通過相似度軟件計算分析得出(表3)，以樣品1～10為對照，樣品11～18的HPLC指紋圖譜相似度最低達到0.813，種植在尾巨桉人工林下的廣金錢草(樣品11)相似度達到了0.948，圖譜的主要峰都可以檢測得到，差異主要表現(xiàn)在含量上。

圖1廣金錢草各樣品HPLC指紋圖譜

Fig.1HPLC fingerprint of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.under different planting conditions

表3廣金錢草各樣品與對照圖譜的相似度

Table 3The similarity of each sample to the control of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.

樣品Sample與對照圖譜的相似度Similaritytothereferencespectrum樣品Sample與對照圖譜的相似度Similaritytothereferencespectrum110.948150.958120.857160.813130.866170.868140.981180.867

2.3不同處理廣金錢草的夏佛塔苷含量

由表4可看出，各樣品的夏佛塔苷含量均達到了2015版《中國藥典》最低標準≥0.13%。種植在尾巨桉林下的廣金錢草(樣品11)夏佛塔苷含量與正常種植(樣品1～10)的含量較接近，實驗田種植中大濃度尾巨桉葉處理的廣金錢草(樣品13,15,17)比低濃度組(樣品14,16,18)的夏佛塔苷含量略低。

表4廣金錢草各樣品夏佛塔苷含量

Table 4Content of schaftoside in each sample of Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.

樣品Sample含量Content(W/W,%)樣品Sample含量Content(W/W,%)10.22100.2120.29110.2430.15120.2140.21130.1750.29140.2860.27150.1470.19160.2180.42170.1890.28180.20

3討論

本文選用廣西規(guī)模化種植的廣金錢草與桉樹進行套種，對比不同種植模式的廣金錢草HPLC指紋圖譜，探索廣金錢草藥材套種在桉樹林下的可行性。與廣金錢草套種桉樹類似的林草復合模式做為一種生態(tài)恢復方法,其作用已在長江上游生態(tài)屏障的植被恢復中得到驗證[10-11]。而在桉樹套種廣金錢草的過程中，本文著重檢驗的是尾巨桉化感作用對廣金錢草化學成分的影響。

在各種植條件下，廣金錢草的主要化學成分沒有顯著改變，但是各成分的含量有一定的變化，這可能與化感作用的復雜性有關?；形镔|的種類幾乎涵蓋所有植物化學物質，目前研究的較多的是酚類和烯類。其作用機理也同樣復雜多樣，可在多個層次對植物產(chǎn)生影響，如影響細胞膜的通透性，植物激素的代謝，光合作用，酶活性等。

尾巨桉發(fā)揮化感作用的一個重要途徑是通過枯落物，而枯落物中大部分是凋落葉，有研究表明，尾巨桉凋落葉成分會隨時間變化發(fā)生變化。因此為了更好的控制條件，找出桉樹對廣金錢草可能的影響，本文除了在尾巨桉人工林下種植廣金錢草外，在試驗田中使用不同時期的尾巨桉凋落葉處理廣金錢草，并且加大了濃度。對各種植條件下的廣金錢草,進行的HPLC指紋圖譜研究表明,廣金錢草主要成分沒有發(fā)生大的改變。

雖然在林下種植的廣金錢草產(chǎn)量有所下降，但是廣金錢草種植時幾乎不需要管理，無其它投入，作為改善桉樹林下環(huán)境的補償措施是適合的。同時發(fā)現(xiàn)廣金錢草種植當年采收后，任其自然過冬及生長，來年無須額外的管理，仍能收獲到與前一年相似的產(chǎn)量。在尾巨桉造林初期，林下光線尚充足時，廣金錢草的產(chǎn)量應會有所增加，此時桉樹林裸露度大，廣金錢草對土壤生態(tài)化境的保護作用也更明顯。

試驗中，廣金錢草幼苗成活后至收獲期靠自然降雨即可良好生長，耐夏季烈日暴曬。各種植條件的光照強度為試驗田最強，尾巨桉林次之，土壤濕度尾巨桉林最大，試驗田最小，而廣金錢草的產(chǎn)量試驗田最大，尾巨桉林次之，這也顯示廣金錢草的產(chǎn)量可能主要受光照影響，光照越足，產(chǎn)量越高。這間接表明在桉樹林地套種廣金錢草的主要約束條件是光照等，而非桉樹的化感物質。

4結論

通過不同種植條件的廣金錢草產(chǎn)量及化學成分分析，廣金錢草在尾巨桉林下種植時產(chǎn)量稍有下降，但藥材指紋圖譜與正常種植無顯著差異，為桉樹-廣金錢草復合經(jīng)營模式的生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

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(責任編輯：竺利波)

Effect of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis Allelopathy on Chemical Components of Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.

ZHENG Lilang1,2,CHEN Yueyuan2,LU Fenglai2,LI Dianpeng2

(1.Colleage of Life Sciences,Guangxi Normal University,Guilin,Guangxi,541004,China;2.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization,Guangxi Institute of Botany,Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences Guilin,Guangxi,541006,China)

Abstract:【Objective】The chemical component variation of Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. intercropping in Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis plantation was studied to explore the feasibility of E.urophylla×E.grandis and Desmodium styracifolium(Osb.) Merr. composite model.【Methods】Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. was planted in a bare land with different weight of E.urophylla×E.grandis leaves covering on soils, which was also cultivated in E.urophylla×E.grandis plantation. The yield of Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. was recorded after harvesting. Moreover,HPLC fingerprint method and determination of schaftoside were established to detect its chemical component variation.【Results】The yield of D.styracifolium (Osb.) Merr.cultivated in Eucalyptus forest decreased slightly,but its chemical fingerprints showed no obvious difference compared with the material which was normally cultivated.【Conclusion】D.styracifolium (Osb.) Merr.can interplant in Eucalyptus Plantations.

Key words:Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis，Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.，chemical component,HPLC

收稿日期：2015-10-18

作者簡介：鄭立浪(1990-)，男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學研究。

中圖分類號：R931.6

文獻標識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)02-0184-05

修回日期：2016-01-29

*廣西重大專項項目(桂科重1347001)和廣西自然科學基金項目(1123014，2010GXNSFD169007)資助。

**通訊作者：李典鵬(1968-)，博士，研究員，主要從事中藥、天然藥物和植物化學研究，E-mail：ldp@gxib.cn。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(2):184～188

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-12

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160512.0944.014.html