曹　原，汪文俊，梁洲瑞，劉福利，孫修濤，姚海芹，李曉蕾，王飛久

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島　266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上?！?01306；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島　266000)

“黃優(yōu)1號(hào)”條斑紫菜新品系遺傳背景和營(yíng)養(yǎng)成分分析*

曹原1,2,3，汪文俊1,3**，梁洲瑞1,3，劉福利1,3，孫修濤1,3，姚海芹1,2,3，李曉蕾1,2,3，王飛久1,3

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島266000)

摘要：【目的】豐富我國(guó)北方紫菜(Pyropia)栽培種質(zhì)，培育優(yōu)良新品系。【方法】以山東長(zhǎng)島縣砣磯島野生紫菜作為親本，經(jīng)過(guò)選育，分別采集在南通、日照和砣磯島海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”紫菜成體進(jìn)行遺傳背景(rbcL和細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(Cycochrome oxidase subunit Ⅰ，CO Ⅰ)基因)和營(yíng)養(yǎng)成分(藻膽蛋白、葉綠素a Chl a、類胡蘿卜素Car和可溶性蛋白TSPs)分析?！窘Y(jié)果】依據(jù)rbcL基因序列(約1 200 bp)進(jìn)行遺傳多樣性分析，僅砣磯島養(yǎng)殖繩上全沉水生長(zhǎng)的野生紫菜群體與其他品系(群體)具有1.1%的遺傳差異，而其栽培群體(“黃優(yōu)1號(hào)”)的rbcL基因序列與對(duì)照條斑紫菜品系完全一致；依據(jù)CO Ⅰ基因序列(約680 bp)，僅南通的兩栽培品系(“黃優(yōu)1號(hào)”和培育品系2)具有2 bp差異，其他品系(群體)的CO Ⅰ基因序列與對(duì)照條斑紫菜完全一致。日照海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”紫菜其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量比其他海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”紫菜、野生親本以及培育品系2高；南通海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”條斑紫菜品質(zhì)一般，大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均低于日照栽培藻體?！窘Y(jié)論】由rbcL和CO Ⅰ基因序列推斷砣磯島岸邊和養(yǎng)殖繩上的野生紫菜大部分為條斑紫菜，選育品系“黃優(yōu)1號(hào)”為條斑紫菜；在不同海區(qū)進(jìn)行栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”條斑紫菜營(yíng)養(yǎng)成分均優(yōu)于其野生親本；初步研究結(jié)果表明該品系更適于在日照海區(qū)栽培。

關(guān)鍵詞：條斑紫菜藻膽蛋白葉綠素a可溶性蛋白rbcL基因CO Ⅰ基因

0引言

【研究意義】據(jù)2001年刊登在聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織網(wǎng)站上的文章統(tǒng)計(jì)，大型海藻年產(chǎn)值約5.6億美元，其中僅紫菜(Pyropia)創(chuàng)造的價(jià)值就占1.18億美元[1]。因此，紫菜作為產(chǎn)值最大的栽培海藻，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種(系)對(duì)其開(kāi)發(fā)利用起關(guān)鍵作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】藻膽蛋白、類胡蘿卜素(Car)、葉綠素(Chl a)和可溶性蛋白(TSPs)含量都是評(píng)價(jià)紫菜品質(zhì)的重要指標(biāo)。藻膽蛋白是紅藻、藍(lán)藻和某些甲藻中一類特有的光合作用天然色素，可分為藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白3大類[2]。藻膽蛋白具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，既可以作為天然色素用于工業(yè)生產(chǎn)，也可以制成熒光試劑用于醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[3]。葉綠素是較早開(kāi)發(fā)的一種金屬卟啉化合物天然綠色色素，在臨床治療、食品、日用化工上都有很大用途[4]。藻膽蛋白和葉綠素組成不僅關(guān)系到紫菜品質(zhì)，它們作為主要的光合作用色素還影響紫菜的生長(zhǎng)速度以及產(chǎn)量。類胡蘿卜素作為重要的氧化還原物質(zhì)，對(duì)紫菜的逆境應(yīng)急反應(yīng)具有重要貢獻(xiàn)。紫菜是一類高蛋白的優(yōu)質(zhì)海洋蔬菜，其蛋白質(zhì)含量約占藻體干重的20%～40%?？扇苄缘鞍椎暮渴呛饬孔喜藸I(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。許多可溶性蛋白是植物中酶的重要組成部分，參與植物多種生理生化代謝過(guò)程的調(diào)控，與其生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老、抗病性、抗逆性密切相關(guān)[5]。紫菜除了有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，還有很高的科學(xué)研究?jī)r(jià)值。紫菜是定植于潮間帶的大型海藻，隨著潮汐作用，周期性的經(jīng)歷海水和空氣兩種截然不同的環(huán)境變化。漲潮時(shí)，藻體淹沒(méi)在海水里，低潮時(shí)，藻體干出失水[6]。不同海域所經(jīng)歷的潮汐周期不等，所受的脅迫不同，其適應(yīng)過(guò)程的基因表達(dá)模式也可能存在差異。此外，紫菜藻體外形較為簡(jiǎn)單，且隨生長(zhǎng)環(huán)境等呈現(xiàn)差異，因此，僅根據(jù)外部形態(tài)無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行種質(zhì)鑒定，尤其對(duì)于遺傳混雜的野生群體。分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱，不利于紫菜養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為豐富紫菜栽培種質(zhì)，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種，我們從從未進(jìn)行紫菜栽培的長(zhǎng)島海區(qū)采集優(yōu)質(zhì)紫菜作為親本，初步培育出優(yōu)質(zhì)品系“黃優(yōu)1號(hào)”。為了解“黃優(yōu)1號(hào)”紫菜在品質(zhì)上對(duì)比其親本的優(yōu)越性，掌握不同栽培海區(qū)對(duì)新品系品質(zhì)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文以條斑紫菜優(yōu)質(zhì)品系為對(duì)照，比較不同海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”品系與野生親本在遺傳背景(rbcL和細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)基因)和營(yíng)養(yǎng)成分(藻膽蛋白、葉綠素a、類胡蘿卜素和可溶性蛋白)含量上的差異，以期為進(jìn)一步優(yōu)化培育“黃優(yōu)1號(hào)”品系，直至形成性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的栽培新品種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

以分別采自生長(zhǎng)在山東長(zhǎng)島縣砣磯島岸邊經(jīng)歷周期性干出日曬的野生紫菜與生長(zhǎng)在養(yǎng)殖繩上全沉水生活的野生紫菜為種菜，采用選育手段，培育出后代，然后分別在不同海區(qū)進(jìn)行栽培，藻體長(zhǎng)成后，采集樣本進(jìn)行比較分析，以日照海區(qū)的優(yōu)質(zhì)條斑紫菜品系為對(duì)照。樣品來(lái)源與特征見(jiàn)表1，其中，培育品系1a～c為“黃優(yōu)1號(hào)”在不同海區(qū)的栽培群體。

表1本研究中7個(gè)品系(群體)的來(lái)源與特征

Table 1The origin and characteristics of the 7 varieties (groups) in this study

品系(群體)Varieties(Groups)來(lái)源Origin特征Characteristics野生群體1Wild1砣磯島養(yǎng)殖繩上AttachingtothefarmingropesinTuojiIs-land全沉水生長(zhǎng),藻體寬、大、厚,深紅色Growingunderwater;wide,large,thickanddeepred野生群體2Wild2砣磯島岸邊DistributedalongtheTuojiIslandshore周期性干出日曬,藻體較小、薄、基部窄、偏綠色,上部紫色略帶綠色Periodicallyemersed,small,thin,narrowbaseandgreen.Up-perispurpleandslightlygreen培育品系1aBreed1a親本野生品系1,砣磯島海區(qū)栽培Wild1asparents,cultivatedinTuojiIsland藻體較寬、大、厚,深紅色Wide,large,thickanddeepred培育品系1bBreed1b親本野生品系1,日照海區(qū)栽培Wild1asparents,cultivatedinRizhao藻體較寬、大、厚,深紅色Wide,large,thickanddeepred培育品系1cBreed1c親本野生品系1,南通海區(qū)栽培Wild1asparents,cultivatedinNantong藻體較寬、大、厚,深紅色Wide,large,thickanddeepred培育品系2Breed2親本野生品系2,南通海區(qū)栽培Wild2asparents,cultivatedinNantong藻體較寬、薄,基部偏綠色,上部紫色略帶綠色Small,thinalgae;thebasalisgreen.Theupperispurpleandslightlygreen.對(duì)照品系Control日照海區(qū)條斑紫菜良種QualifiedPyropiayezoensisstrainscultivat-edinRizhao藻體細(xì)、長(zhǎng)、薄,基部偏綠色,上部紫色略帶綠色,黑亮Thin,fineandlongalgae;thebasalisgreen.Theupperispurple,slightlygreenandshiningblack.

考馬斯亮藍(lán)試劑CBB的配置：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 90%(V/V)乙醇中，加入85%(W/V)的磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容到1 000 mL，此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。

1.2方法

1.2.1基因克隆與測(cè)序

1.2.1.1基因組DNA提取

選用天根(TIANGEN)植物基因組DNA提取試劑盒 (DP305-02)提取7種紫菜品系(群體)的基因組DNA，每個(gè)品系(群體)取5棵分別提取DNA進(jìn)行基因克隆、測(cè)序和序列分析。

1.2.1.2基因組片段的PCR擴(kuò)增與回收

用于擴(kuò)增7種紫菜品系(群體)的1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亞基基因(rbcL)和CO Ⅰ基因片段的引物分別為rbcL F:5′-GTAATTCCATATGCTAAAATGGG-3′，rbcL R:5′-ATCTTTCCATAGATCTAAAGC-3′；CO ⅠF:5′-TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,CO ⅠR:5′-ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，制備成濃度為100 μmol/L的儲(chǔ)存液，分裝置于-20℃。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含1×Taq MasterMix(Dye)(康為世紀(jì))，引物0.4 μmol/L，DNA模板5 ng。以上反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照，即不加DNA模板的反應(yīng)體系，以排除DNA污染的情況。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于紫外燈下切割目的條帶，用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化回收，送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。CO Ⅰ基因片段較短(約680 bp)，采用單向測(cè)序；rbcL基因片段較長(zhǎng)(約1 200 bp)，采用雙向測(cè)序。

1.2.2藻膽蛋白含量測(cè)定

藻膽蛋白含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[8]，略有改動(dòng)。稱取適量藻體，液氮研磨，然后加入10倍(V/W)0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值為6.8)；室溫放置3 min后置于-20℃冷凍40 min，室溫解凍，反復(fù)凍融3次，在4℃放置3 h；4℃，3 500 g離心10 min，取上清稀釋一定倍數(shù)；分別于650 nm、618 nm、560 nm處測(cè)定吸光度值(A)。提取過(guò)程必須在避光條件下進(jìn)行。每個(gè)品系(群體)取3個(gè)重復(fù)。計(jì)算公式如下：

CR-PE(藻紅蛋白)=0.123A560-0.07A618+0.015A650；

CR-PC(藻藍(lán)蛋白)=0.187A618-0.089A650；

CAPC(別藻藍(lán)蛋白)=0.171A650-0.006A560-0.004A618；

Content=C*V*n。

其中，Content：藻膽蛋白的含量(mg)；C：藻膽蛋白的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V：稀釋后的待測(cè)液體積(mL)；n：上清液稀釋倍數(shù)。

1.2.3葉綠素a和類胡蘿卜素含量測(cè)定

葉綠素a(Chl a)和類胡蘿卜素(Car)用100%甲醇提?。?℃條件下，避光自提24 h，然后5 000 g離心10 min取上清，稀釋一定倍數(shù)；分別于750 nm、665 nm、652 nm、510 nm、480 nm處測(cè)定吸光度值(A)。每個(gè)品系(群體)取3個(gè)重復(fù)。根據(jù)Parsons和Strickland[9]的公式計(jì)算Chl a和Car的含量。

1.2.4可溶性蛋白含量測(cè)定

可溶性蛋白(TSPs)的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]，略有改動(dòng)。取0.05 g藻體研磨，蒸餾水定容至5 mL，室溫自提40 min；4 000 g離心10 min得到提取液(V)；取1 mL提取液+5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑(CBB)混勻，靜置2 min，于595 nm 處測(cè)定其吸光度(A)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量，對(duì)照液為1 mL蒸餾水+5 mL CBB。每個(gè)品系(群體)取3個(gè)重復(fù)。計(jì)算公式如下：

TSPs含量(mg/g)=(C*V/a)/W，

式中，C：每管蛋白質(zhì)含量(mg)；V：提取液總體積(mL)；a：測(cè)定所取液體積(mL)；W：樣品鮮重(g)。

1.3數(shù)據(jù)處理

用OriginPro8.5作圖進(jìn)行品系之間不同物質(zhì)含量的對(duì)比，并用SPSS進(jìn)行顯著性差異分析。用ClustalX和MEGA4.1進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2結(jié)果與分析

2.1遺傳多樣性分析

經(jīng)過(guò)基因組總DNA提取、基因片段特異性的PCR擴(kuò)增和純化、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收以及DNA測(cè)序，得到不同品系(群體)的rbcL和COⅠ基因序列。然后利用ClustalX軟件對(duì)幾個(gè)品系的兩個(gè)基因片段進(jìn)行剪切和編輯。由于品系(群體)間的基因相似度高，多態(tài)性低，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可信度較低，所以我們僅進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的7個(gè)紫菜品系(群體)CO Ⅰ基因片段長(zhǎng)680 bp，僅南通栽培的培育品系2和“黃優(yōu)1號(hào)”出現(xiàn)兩個(gè)堿基的變異，其他品系(群體)與對(duì)照條斑紫菜序列完全一致。獲得的rbcL基因片段長(zhǎng)約1 200 bp，經(jīng)過(guò)ClustalX比對(duì)發(fā)現(xiàn)13個(gè)差異位點(diǎn)(10處轉(zhuǎn)換，3處顛換)，且差異均存在于野生群體1中，野生群體2、培育品系2、“黃優(yōu)1號(hào)”與對(duì)照條斑紫菜的rbcL基因序列完全一致(表2)。這說(shuō)明砣磯島的野生紫菜中條斑紫菜較多。養(yǎng)殖繩上的紫菜其遺傳多樣性水平比岸邊生長(zhǎng)的高，野生群體1中rbcL序列差別較大的個(gè)體是否為其他紫菜物種，還需結(jié)合形態(tài)、生殖特性、生活史和其他分子標(biāo)記進(jìn)一步驗(yàn)證，因?yàn)閞bcL基因序列發(fā)生變異的個(gè)體其COⅠ基因序列卻完全相同?？傊包S優(yōu)1號(hào)”和培育品系2均為條斑紫菜。

表27紫菜品系(群體)基于rbcL基因序列計(jì)算的遺傳距離

Table 2Genetic distances among seven Pyropia varieties (populations) based on rbcL gene fragments

培育品系1aBreed1a野生群體2Wild2培育品系1cBreed1c培育品系1bBreed1b培育品系2Breed2對(duì)照品系Control野生群體1Wild1培育品系1aBreed1a野生群體2Wild20.000培育品系1cBreed1c0.0000.000培育品系1bBreed1b0.0000.0000.000培育品系2Breed20.0000.0000.0000.000對(duì)照品系Control0.0000.0000.0000.0000.000野生群體1Wild10.0110.0110.0110.0110.0110.011

2.2營(yíng)養(yǎng)成分含量

由圖1a～c可知，“黃優(yōu)1號(hào)”在不同海區(qū)栽培藻體的藻膽蛋白含量均高于其親本野生群體1，其中于日照海區(qū)培育的藻體其各類藻膽蛋白含量最高，呈顯著性差異(P<0.05)。但日照海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”藻膽蛋白含量相較于作為同海區(qū)優(yōu)質(zhì)條斑紫菜對(duì)照品系略低，但與之差異不顯著(P>0.05)。

以砣磯島岸上野生群體2為種菜，其選育后代培育品系2的藻膽蛋白含量卻小于其野生群體，尤其是藻紅蛋白，呈顯著性差異(P<0.05)。相較于日照栽培藻體，“黃優(yōu)1號(hào)”在南通的栽培藻體具有顯著較低的藻膽蛋白含量。南通與砣磯島地區(qū)同期水溫相差約5～6℃，而日照與砣磯島地區(qū)同期溫差較小，說(shuō)明通過(guò)選育的手段從北方野生種質(zhì)中篩選的紫菜品系可適當(dāng)南移，但不適合移至溫差過(guò)大的南方海域進(jìn)行栽培。這可能也解釋了不同海區(qū)栽培的同一品系“黃優(yōu)1號(hào)”，來(lái)自日照海區(qū)的栽培藻體其藻膽蛋白含量高于南方海區(qū)栽培藻體的原因。

日照海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”藻體的Chl a和Car含量高于其他品系(群體)(P<0.05)(圖1d～e)，而其他品系(群體)的Chl a含量均較低。野生群體2的Chl a含量比其后代培育品系2高很多，與之前藻膽蛋白(圖1a～c)結(jié)果類似。同時(shí)，其Chl a和Car含量比同海區(qū)優(yōu)質(zhì)條斑紫菜對(duì)照品系分別高出47.7%和106.4%。影響Chl a含量的因素很多，主要有氮、磷、水溫、透明度和降水等[11]，結(jié)果說(shuō)明日照海域的總環(huán)境相較于同期的南通、砣磯島來(lái)說(shuō)，更適合“黃優(yōu)1號(hào)”生長(zhǎng)。

經(jīng)顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)紫菜品系(群體)根據(jù)TSPs含量，可以分為兩個(gè)子集，野生群體2、培育品系1b和對(duì)照品系為一個(gè)子集，其余品系為一個(gè)子集，子集之間存在顯著性差異(P<0.05)(圖1f)。其中，培育品系1b比對(duì)照品系的可溶性蛋白含量更高，這說(shuō)明日照海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”相較于同海區(qū)生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)條斑紫菜品質(zhì)更高。

依據(jù)本研究分析的幾大物質(zhì)含量，可見(jiàn)選育品系“黃優(yōu)1號(hào)”的品質(zhì)高于其親本，且遺傳背景單一、穩(wěn)定(基于相同的rbcL和COⅠ序列)。說(shuō)明從野生群體中采用選育手段培育品質(zhì)更佳的栽培品系(群體)具有可行性。而不同海區(qū)對(duì)“黃優(yōu)1號(hào)”栽培藻體的品質(zhì)有很大影響，三海區(qū)中以日照海區(qū)最優(yōu)(圖1)。與同海區(qū)(日照)栽培的對(duì)照品系條斑紫菜相比，“黃優(yōu)1號(hào)”紫菜具有更高的TSPs、Chl a、Car含量，較低的藻膽蛋白含量和藻膽蛋白∶TSPs比值(P<0.05)。

同在南通海域栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”和培育品系2的各物質(zhì)含量相差不大，這說(shuō)明來(lái)自北方的紫菜種質(zhì)不適于生長(zhǎng)在溫差較大的南方海域。而“黃優(yōu)1號(hào)”在其親本發(fā)源地砣磯島進(jìn)行栽培，各物質(zhì)含量雖高于野生親本，但比日照海區(qū)栽培藻體低很多，可能由于兩海區(qū)的水質(zhì)狀況不同造成，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

圖1不同品系(群體)間營(yíng)養(yǎng)成分含量對(duì)比

Fig.1Comparison of nutrition among different strains (populations)

3討論

我國(guó)已記錄的紫菜有24種(3壇紫菜養(yǎng)殖變種)，包含從冷溫帶到暖溫帶的特征種類[12]。我國(guó)進(jìn)行規(guī)?；耘嗟淖喜朔N類主要為壇紫菜和條斑紫菜[13]。中國(guó)現(xiàn)代紫菜栽培業(yè)發(fā)起于20世紀(jì)六、七十年代，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，形成江蘇條斑紫菜主產(chǎn)區(qū)和浙江、福建壇紫菜主產(chǎn)區(qū)，年栽培面積近600 km2，占大型經(jīng)濟(jì)海藻總栽培面積的50%以上[13]。紫菜栽培采用半浮動(dòng)筏式或支柱式，只能在淺海進(jìn)行。在海區(qū)有限的情況下，長(zhǎng)期、密集栽培同一種紫菜導(dǎo)致病爛頻發(fā)、品質(zhì)下降。這說(shuō)明同一種紫菜在多年的栽培生產(chǎn)中，歷經(jīng)累代選育，導(dǎo)致遺傳背景單一、抗病能力下降。雖然我們擁有多個(gè)生產(chǎn)品系，但這些品系基本上是從栽培種菜中選擇或加以誘變?cè)龠x育而來(lái)。而且，條斑紫菜野生資源主要分布于山東以北，其主產(chǎn)區(qū)在江蘇，栽培種質(zhì)與野生種質(zhì)的遺傳交換被完全地理隔離。加上條斑紫菜栽培前期殼孢子幼體放散大量的無(wú)性孢子(單孢子，archeospore)，單孢子甚至成為生產(chǎn)中主要的苗種來(lái)源[14]。野生資源的缺乏和大量的無(wú)性繁殖進(jìn)一步導(dǎo)致栽培種質(zhì)遺傳背景單一化。山東半島紫菜野生資源豐富，種類較多，從中開(kāi)發(fā)新的具有生產(chǎn)潛能的種質(zhì)對(duì)保持栽培紫菜的遺傳多樣性、豐富紫菜產(chǎn)品的種類、提高紫菜產(chǎn)業(yè)的抗風(fēng)險(xiǎn)能力具有重要意義。

基于將優(yōu)質(zhì)野生種質(zhì)引入生產(chǎn)培育新的栽培品系目的，我們從從未進(jìn)行紫菜栽培的長(zhǎng)島縣砣磯島海域采集到野生紫菜種質(zhì)。從形態(tài)外觀和生長(zhǎng)方式上，將該海區(qū)的野生種質(zhì)區(qū)分為野生群體1和野生群體2，其中前者比后者藻體大、寬，肉眼觀察顏色更紅，口感也佳，與現(xiàn)有栽培品系相比差別巨大，因此成為我們的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。前期通過(guò)大量的研究工作，攻克了野生群體1生產(chǎn)性育苗關(guān)鍵技術(shù)，初步培育出性狀一致、穩(wěn)定的新品系“黃優(yōu)1號(hào)”，在日照地區(qū)與對(duì)照品系比對(duì)，產(chǎn)量相當(dāng)。

由于野生紫菜遺傳背景混雜，僅從外觀上難以進(jìn)行精確的種質(zhì)鑒定和遺傳背景評(píng)估，比如條斑紫菜和甘紫菜[15]。本研究中的培育品系來(lái)源于長(zhǎng)島的野生紫菜，生長(zhǎng)在養(yǎng)殖繩上的和生長(zhǎng)在岸邊的藻體在形態(tài)和口感上差別顯著。為了明確親本所屬物種、了解砣磯島野生紫菜群體的遺傳多樣性及其培育后代的遺傳變化情況，本文對(duì)野生親本和培育品系進(jìn)行遺傳多樣性分析。rbcL和COⅠ基因具有進(jìn)化速率適中的特點(diǎn)，是進(jìn)行種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記[16-17]。因此，本文采用rbcL和COⅠ基因分析幾種品系(群體)之間的遺傳距離。Rubisco存在于所有高等植物的葉綠體中，參與卡爾文循環(huán)中CO2的固定，是光合植物葉片中含量最豐富的蛋白質(zhì)，也是光合作用中的關(guān)鍵酶[18]，它主要由8個(gè)大亞基和8個(gè)小亞基組成，其中大亞基由葉綠體DNA編碼，這段基因即為rbcL基因。COⅠ基因是線粒體DNA上的一段蛋白質(zhì)編碼基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生群體2和“黃優(yōu)1號(hào)”的rbcL和COⅠ基因序列與對(duì)照條斑紫菜品系完全相同，可以斷定為條斑紫菜。而野生群體1中除了條斑紫菜，40%個(gè)體的rbcL基因與其他品系(群體)具有1.1%的遺傳差異(表2)，是否為其他種還需結(jié)合其他手段進(jìn)行鑒定。

通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分分析，發(fā)現(xiàn)不同海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號(hào)”藻體各物質(zhì)含量普遍比野生群體高或相當(dāng)，其中日照海區(qū)“黃優(yōu)1號(hào)”栽培藻體內(nèi)幾種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量均遠(yuǎn)大于南通和砣磯島海區(qū)的栽培藻體。相較于同海區(qū)優(yōu)質(zhì)條斑紫菜對(duì)照品系，其葉綠素和可溶性蛋白的含量更高；藻膽蛋白含量和藻膽蛋白∶TSPs比值較低，但兩者之間并無(wú)顯著性差異(P<0.05)。低光下紫菜藻體積累藻膽蛋白，以提高光能利用效率，另外還充當(dāng)?shù)闹饕獌?chǔ)存庫(kù)，占TSPs的比例可達(dá)70%以上[15]?！包S優(yōu)1號(hào)”的親本野生群體1生長(zhǎng)在養(yǎng)殖繩上，整個(gè)生命周期營(yíng)沉水生活，而對(duì)照品系經(jīng)過(guò)多代“插竿式”栽培方式，在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)歷周期性的干露日曬，其適應(yīng)的光照強(qiáng)度明顯高于野生群體1。在日照海區(qū)，“黃優(yōu)1號(hào)”與對(duì)照品系的栽培方式一致，均經(jīng)歷周期性的干露日曬，相同的光照條件于對(duì)照品系而言是合適的，對(duì)“黃優(yōu)1號(hào)”而言可能產(chǎn)生高光脅迫。藻膽蛋白作為紫菜主要的外周捕光色素，是感應(yīng)光強(qiáng)變化的重要指示物質(zhì)，低光下含量較高，高光下含量降低。推測(cè)這可能是導(dǎo)致“黃優(yōu)1號(hào)”中藻膽蛋白含量比對(duì)照品系中低的原因。藻膽蛋白是TSPs的主要成分之一，相同栽培條件下，“黃優(yōu)1號(hào)”比對(duì)照品系具有較低的藻膽蛋白，較高的TSPs，說(shuō)明“黃優(yōu)1號(hào)”中其他蛋白積累效率明顯高于對(duì)照品系。

總之，與親本以及對(duì)照品系比較，無(wú)論是產(chǎn)量還是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，“黃優(yōu)1號(hào)”可與之相當(dāng)甚至更高，說(shuō)明從野生種質(zhì)中僅采取選育的手段即可培育出比親本性狀顯著優(yōu)良的品系，但僅用選育手段培育的藻體其耐高溫性狀的提高不明顯。由本研究結(jié)果推測(cè)，“黃優(yōu)1號(hào)”經(jīng)過(guò)后續(xù)幾代的栽培，一方面進(jìn)一步強(qiáng)化選育的目標(biāo)性狀，同時(shí)適應(yīng)了“插竿式”栽培方式后，將比目前日照海區(qū)的主導(dǎo)條斑紫菜推廣品系具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和更大的應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：陸雁)

Genetic and Nutrient Analysis of New Pyropia yezoensis Strain “Huangyou No.1”

CAO Yuan1,2,3，WANG Wenjun1,3，LIANG Zhourui1,3，LIU Fuli1,3，SUN Xiutao1,3，YAO Haiqin1,2,3，LI Xiaolei1,2,3，WANG Feijiu1,3

(1.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fishery of Ministry of Agriculture,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao,Shandong，266071,China；2.College of Fisheries and Life Science of Shanghai Ocean University,Shanghai,201306,China；3.Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes,Qingdao,Shandong，266000,China)

Abstract：【Objective】New and high qualified Pyropia strains were screened to enrich the Pyropia strains resources in north China and provide fundamental data for their successful cultivation.【Methods】New strain of “Huangyou No.1” was obained by selective breeding of the wild germplasm from the farming ropes of Tuoji Island and cultivated in Nantong,Rizhao,and Tuoji Island,respectively.The genetic background (based on rbcL and COⅠ genes) and nutrient components (phycobiliprotein,chlorophyll a,carotenoid and soluble protein) were analyzed in “Huangyou No.1” from different farming areas together with its parent,the control stain of Pyropia yezoensis in Rizhao,the wild Pyropia from the shore of Tuoji Island and its cultivated offsprings.【Results】Based on the sequence of rbcL gene (about 1 200 bp),there were about 1.1% variation occurring in the population of the wild Pyropia growing on farming rope,compared to the other populations.All the other 6 populations had completely same rbcL gene sequence.According to genetic diversity analysis of COⅠ gene sequence (about 680 bp),only two cultivars(“Huangyou No.1” and Breeding 2) of Nantong had 2 bp difference,and the others were completely consistent.The nutrient content of “Huangyou No.1” cultivated in Rizhao was generally higher than the other cultivars and their wild germplasm,and the quality of seaweed cultivated in the Nantong was the lowest.【Conclusion】Based on the rbcL and COⅠ gene sequence,most of the wild Pyropia on Tuoji Island were Pyropia yezoensis,and the nutrient compositions of the “Huangyou No.1” cultivated in different areas were superior to that of its wild parents.The results show that “Huangyou No.1” is more applicable for cultivation in the sea area of Rizhao.

Key words：Pyropia yezoensis，phycobiliprotein，chlorophyll a，soluble protein，rbcL genes，COⅠ genes

收稿日期：2016-04-23

作者簡(jiǎn)介：曹原(1991-)，女，在讀研究生，主要從事紫菜新品種培育研究。 **通訊作者：汪文俊(1979-)，女，博士，副研究員，主要從事海藻遺傳育種與開(kāi)發(fā)利用研究，E-mail：wjwang@ysfri.ac.cn。

中圖分類號(hào)：Q319,S917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-9164(2016)02-0131-07

*中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015A02)和中央級(jí)科研院所(黃海所)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(20603022013023)資助。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(2):131～137

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-11

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