董　燕　杜開(kāi)先(通訊作者)　賈天明　張曉莉　張　燕　宋麗麗

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　鄭州　450052　　2)河南省紅十字血液中心　鄭州　450000

不同濃度肺炎鏈球菌造成大鼠腦膜炎模型的實(shí)驗(yàn)研究

董燕1)杜開(kāi)先1)(通訊作者)賈天明1)張曉莉1)張燕2)宋麗麗1)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州4500522)河南省紅十字血液中心鄭州450000

【摘要】目的通過(guò)不同濃度肺炎鏈球菌造成大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型，選出最合適的造模菌株。方法3周齡SD大鼠40只隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(10只)、細(xì)菌性腦膜炎模型組(模型組分3組，每亞組各10只)。應(yīng)用不同濃度(106、107、108 cfu/mL)肺炎鏈球菌Ⅲ型對(duì)大鼠腦池穿刺建立細(xì)菌性腦膜炎模型，應(yīng)用等體積生理鹽水替代肺炎鏈球菌作對(duì)照組，觀(guān)察終點(diǎn)為動(dòng)物自然死亡或造模5 d。比較各組大鼠病死率、生理指標(biāo)變化、Loeffler神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦組織形態(tài)學(xué)改變表達(dá)。結(jié)果高濃度組較低濃度組病死率高，體質(zhì)量增長(zhǎng)慢，體溫升高快；Loeffler神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低，腦組織水腫明顯(P均<0.05)。結(jié)論腦池內(nèi)直接注射細(xì)菌后，能誘導(dǎo)出細(xì)菌性腦膜炎。通過(guò)控制菌株濃度，可造成不同程度的腦膜炎模型。107 cfu/mL為最佳造模濃度。

【關(guān)鍵詞】大鼠；肺炎鏈球菌；腦膜炎；模型；實(shí)驗(yàn)研究

細(xì)菌性腦膜炎是兒科中常見(jiàn)的危急重病，病死率和致殘率極高[1-2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外采用多種方式造成動(dòng)物細(xì)菌性腦膜炎模型[3-5]，以此研究腦膜炎的發(fā)病機(jī)制及治療。而對(duì)不同濃度菌株造成模型的輕重程度的評(píng)估，目前國(guó)內(nèi)外尚不統(tǒng)一。肺炎鏈球菌腦膜炎是我國(guó)最常見(jiàn)的細(xì)菌性腦膜炎之一，嬰兒期較多。本實(shí)驗(yàn)旨在建立不同濃度菌株造成細(xì)菌腦膜炎的模型，為找出造模的最佳條件奠定基礎(chǔ)，有利于細(xì)菌性腦膜炎的防治研究。

1材料和方法

1.1細(xì)菌懸液的制備菌株購(gòu)自中國(guó)藥品食品檢定研究院中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(菌號(hào)31003)，接種于血瓊脂糖培養(yǎng)基，在37 ℃ 5%二氧化碳環(huán)境中生長(zhǎng)過(guò)夜，再接種于VITAL AER肉湯里，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期收菌，離心，用生理鹽水沖洗，再離心，用鹽水稀釋105～108cfu/mL。

1.2腦膜炎的誘導(dǎo)取自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心3周齡SD大鼠50只，雌雄不限。隨機(jī)分為鹽水對(duì)照組(S組，n=10)、實(shí)驗(yàn)組(E1、E2、E3，n=10)。用10%水合氯醛液2 mL/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀，腦膜炎的誘導(dǎo)改進(jìn)于劉心潔、Diab等[4-7]的方法，小腦延髓池穿剌，移去50 μL腦脊液并培養(yǎng)，試驗(yàn)組注入50 μL 106～108cfu/mL肺炎鏈球菌懸液，對(duì)照組注射50 μL生理鹽水，置籠中喂養(yǎng)，每日記錄大鼠體溫、體質(zhì)量，觀(guān)察臨床表現(xiàn)。觀(guān)察終點(diǎn)為動(dòng)物自然死亡或造模5 d，深麻醉后再?gòu)哪X池取腦脊液50 μL做培養(yǎng)，斷頭處死大鼠。

1.3大鼠Loeffler的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分按5分制評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)估。5分：抓住背部時(shí)能正常運(yùn)動(dòng)，5 s內(nèi)翻身；4分：自主運(yùn)動(dòng)減少，5 s內(nèi)能翻身；3分：>5 s翻身；2分：不能翻身；1分：不能運(yùn)動(dòng)。

1.4HE染色切片觀(guān)察斷頭后肉眼觀(guān)察腦組織，取左側(cè)大腦4%多聚甲醛固定過(guò)夜，脫水、冠狀切片石蠟包埋，切成5 μm厚切片，做HE染色切片。顯微鏡下觀(guān)察組織細(xì)胞學(xué)形態(tài)。

2結(jié)果

2.1臨床表現(xiàn)及病死率E1組大鼠僅表現(xiàn)精神稍差、進(jìn)食少，無(wú)死亡大鼠；E2組大鼠出現(xiàn)精神差、拒食、嗜睡、反應(yīng)遲鈍，4例死亡(2例造模第2天死亡，1例造模第3天死亡，1例第4天死亡)，病死率40%；E3組運(yùn)動(dòng)失調(diào)，原地打轉(zhuǎn)，四肢發(fā)紺，最終昏迷伴全身抽搐、死亡，造模1 d內(nèi)全部死亡，病死率100%。E2、E3組病死率較S組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E3組病死率較E2組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2腦脊液培養(yǎng)E組感染前腦脊液無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，感染后24 h腦脊液培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌。S組注射前后均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3體溫、體質(zhì)量的改變見(jiàn)表1、2。初始各組體溫比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，E1、E2組體溫均趨于上升趨勢(shì)(P<0.05)，造模24 h、48 h、5 d體溫E2組較E1組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　各組大鼠體溫比較，℃)

注：與S組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與E1組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與同組初始時(shí)間點(diǎn)比較，@P<0.05；與同組24 h比較，%P<0.05

表2　各組大鼠體質(zhì)量比較±s，g)

注：與S組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與E1組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05

各組初始體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，48 h、5 d體質(zhì)量E1組較同時(shí)間點(diǎn)S組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，24 h、48 h、5 d體質(zhì)量E2組較同時(shí)間點(diǎn)S組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4Loeffler神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分見(jiàn)表3。同時(shí)間點(diǎn)比較E1、E2組較S組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E2與E1相同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3　各組大鼠Loeffler神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

注：與S組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與E1組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05

2.5腦組織肉眼觀(guān)察及病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察造模5 d處死大鼠取腦組織肉眼觀(guān)察，S組無(wú)異常，E組水腫明顯，有炎癥粘連和灶性出血。HE染色切片觀(guān)察：S組無(wú)病理性損傷，造模組大鼠腦組織形態(tài)發(fā)生明顯改變，E1組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)固縮，細(xì)胞及血管周?chē)霈F(xiàn)腔隙；E2組神經(jīng)元細(xì)胞固縮明顯，血管周?chē)幌睹黠@增寬，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

對(duì)照組

E1組5 d

E2組5 d

3討論

細(xì)菌性腦膜炎是兒童常見(jiàn)的疾病之一，部分可遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，肺炎鏈球菌性是嬰兒顱內(nèi)感染病原菌中最多見(jiàn)的細(xì)菌[6-8]。系統(tǒng)研究肺炎鏈球菌型腦膜炎，在該病的診斷治療、減少甚至避免并發(fā)癥的出現(xiàn)等領(lǐng)域起至關(guān)重要的作用。

目前，國(guó)內(nèi)外腦膜炎的動(dòng)物模型的建立可通過(guò)不同的方法，樊一斌等[9]通過(guò)尾靜脈接種隱球菌構(gòu)建小鼠中樞神經(jīng)系感染模型，與本研究造模方式不同；Huang等[10]通過(guò)幼鼠延髓小腦池注入B族溶血性鏈球菌構(gòu)建大鼠腦膜炎模型，與本研究腦膜炎類(lèi)型不同；Cao等[11]通過(guò)對(duì)3%氯化鈉溶液對(duì)脂多糖造成的腦水腫模型中作用的研究與腦水腫相關(guān)的AQP4的表達(dá)，與本研究造模方式及研究目的不同，且目前對(duì)不同程度腦膜炎大鼠臨床表現(xiàn)的研究甚少。本文旨在通過(guò)對(duì)大鼠小腦延髓池注射菌株造成腦膜炎模型，通過(guò)病死率、腦脊液培養(yǎng)、病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察等證實(shí)模型制造成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株濃度不同，大鼠臨床表現(xiàn)各異，Loeffler的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分107較106組低。各組時(shí)間點(diǎn)體溫、體質(zhì)量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為此，可通過(guò)控制菌株的濃度造成不同程度腦膜炎模型。

總之，通過(guò)對(duì)不同濃度菌株造成腦膜炎模型，通過(guò)大鼠臨床表現(xiàn)、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、體質(zhì)量改變、病死率、腦組織病理學(xué)改變，最終表明107cfu/mL為最佳造模濃度，造模后及時(shí)治療是控制病死率的關(guān)鍵。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可評(píng)估造模成功與否并了解造模輕重程度，利于探討腦水腫的發(fā)生機(jī)制，為細(xì)菌性腦膜炎的診治奠定基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

[1]Degli Atti MC，Esposito S，Parola L，et al.In-hospital management of children with bacterial meningitis in Italy[J].Ital J Pediatr，2014，40(1)：87.

[2]Mook-Kanamori BB，Geldhoff M，van der Poll T，et al.Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis[J].Clin Microbiol Rev，2011，24(3)：557-591.

[3]金勝利，李玉勤，凌亞平，等.地塞米松對(duì)感染性腦水腫水通道蛋白4表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(22)：2 897-2 899.

[4]劉心潔，孫若鵬，雷革非，等.大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎病理機(jī)制及干預(yù)措施的初步研究[J].中華兒科雜志，2005，43(4)：294-296.

[5]李玲，水泉祥，賴(lài)愛(ài)娣，等.幼齡大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型的研究[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2002，17(3)：237-238.

[6]Tunkel AR，Hartman BJ，Kaplan SL，et al.Practice guidelines for the management of bacterial meningitis[J].Clin Infect Dis，2004，39(9)：1 267-1 284.

[7]劉心潔，孫若鵬，雷革非，等.大鼠肺炎鏈球菌腦膜炎病理機(jī)制及干預(yù)措施的初步研究[J].中華兒科雜志，2005，43(4)：294-296.

[8]鄧江山，趙玉武.星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦水腫的形成[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(2)：185-187.

[9]樊一斌，溫海，朱紅梅，等.小鼠隱球菌性腦膜炎模型AQP4與腦水腫關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2012，7(6)：335-338.

[10]Huang J，Lu WT，Sun SQ，et al.Upregulation and lysosomal degradation of AQP4 in rat brains with bacterial meningitis[J].Neurosci Lett，2014，30(566)：156-161.

[11]Cao C，Yu X，Liao Z，et al.Hypertonic saline reduces lipopolysaccharide-induced mouse brain edema through inhibiting aquaporin 4 expression[J].Crit Care，2012，16(5)：R186.

(收稿 2015-06-21)

Study of bacterial meningitis models in rats induced by different concentration of bacteria

DongYan*，DuKaixian，JiaTianming，ZhangXiaoli，ZhangYan，SongLili

*DepartmentofPediatric，theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，ChinaCorrespondingauthor：DuKaixian

【Abstract】Objective To choose the most approprite bacterial concentration to induce bacterial meningitis model.Methods Sprague-Dawley rats on postnatal 3 weeks were divided into 4 groups randomly.The model groups were established by direct intracisternal injecting different concentration of streptococcus pneumoniae Ⅲ(SPⅢ)(106，107，108 cfu/mL)into cerebellomedullary cistern，the saline(NS)control group was injected by NS.The end was the death of the rats or days after model established.The rats were observed death rate，the physiological index，Loeffler’s neuroethology score，etc.Results The death rate of high concentration group was higher than that of the low concentration group，while the weight growth was slower，the body temperature increased faster，Loeffler neurobehavioral score was lower and brain tissue was more obviously edema(P<0.05).Conclusion Bacterial meningitis model could be induced by direct intracisternal injection of a suspension of SPⅢ on postnatal 3 weeks in SD rats.To control the concentration of the bacteria could control the degree of the bacterial meningitis model.107 cfu/mL was the most comfortable concertration to induce the model.

【Key words】SD rat；Streptococcus pneumoniaeⅢ；Bacterial meningitis；Model；Study

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)11-0023-02