張春玲　任幼紅(通訊作者)

1)山東平度市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科　平度　266700　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)科　鄭州　450052

彌可保對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)Nav1.7表達(dá)的影響

張春玲1)任幼紅2)(通訊作者)

1)山東平度市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科平度2667002)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)科鄭州450052

【摘要】目的探討彌可保對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型大鼠痛閾及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中電壓門控性鈉離子通道亞型1.7(Nav1.7)表達(dá)的影響。方法健康雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C組)、模型組(DNP組)和彌可保組(DNP+M組)，每組25只，其中模型組和彌可保組皮下注射STZ 75 mg/kg制作糖尿病大鼠模型，剔除血糖低于16.7 mmol/L的大鼠，14 d后給予安慰劑和彌可保(600 μg/kg)腹腔注射，1次/d，觀察STZ注射前1 d及注射后3、7、14、21、28 d機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrwal threshold，MWT)，行為學(xué)測(cè)試完成后，采集大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)標(biāo)本，用免疫組化和Western blot方法分別檢測(cè)其鈉離子通道Nav1.7蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠MWT降低，DRG中Nav1.7 的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，彌可保組大鼠MWT升高，DRG中Nav1.7 的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論彌可保通過抑制糖尿病大鼠DRG中 Nav1.7 表達(dá)，從而緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

【關(guān)鍵詞】彌可保；糖尿病神經(jīng)病理性疼痛；背根神經(jīng)節(jié)；Nav1.7

研究表明，糖尿病患者高血糖誘發(fā)微循環(huán)障礙，最終可導(dǎo)致痛性糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生，其中以糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)最為常見[1]?；颊呖沙霈F(xiàn)自發(fā)痛、痛覺過敏、觸誘發(fā)痛及感覺異常，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[2]，其中疼痛過敏由神經(jīng)元興奮性升高引起，而神經(jīng)元興奮性與電壓門控鈉離子通道息息相關(guān)。研究指出,背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)中高表達(dá)的Nav1.7與人類遺傳性疼痛疾病密切相關(guān)[3]，編碼Nav1.7的SCN9A基因錯(cuò)義突變導(dǎo)致原發(fā)性紅斑肢痛癥[4]和陣發(fā)性劇痛癥[5]，而SCN9A基因堿基缺失則引起先天性無(wú)痛癥[6]。彌可保(甲鈷胺)早期應(yīng)用能改善糖尿病患者的神經(jīng)癥狀和感覺傳導(dǎo)速度[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察彌可保對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾及DRG中Nav1.7蛋白表達(dá)的影響，為治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛提供理論基礎(chǔ)。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象健康雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量200～250 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組：對(duì)照組(C 組)、模型組(DNP組)和彌可保組(DNP+M組)，每組25只。

1.2試劑與設(shè)備彌可保注射液(衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司)，鏈脲佐菌素(streptozocin，美國(guó)Sigma公司)，Nav1.7 兔單克隆一抗(abcam公司，美國(guó))，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(南通碧云天公司)，血糖儀(中國(guó)歐姆龍公司)，von Frey Hairs(美國(guó)Stoelting公司)。

1.3DNP模型制備參照文獻(xiàn)[8]制備DNP模型，測(cè)大鼠基礎(chǔ)痛閾后皮下注射STZ 75 mg/kg，給藥后7 d測(cè)量尾靜脈血糖穩(wěn)定>16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功，給藥后14 d痛閾降低幅度>基礎(chǔ)痛閾的15%為DNP模型制備成功。14 d后分別給予安慰劑和彌可保600 μg/(kg·d)腹腔注射，1次/d，連續(xù)28 d，測(cè)量STZ注射前1 d、STZ注射后3、7、14、21、28 d時(shí)間點(diǎn)MWT。

1.4機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrwal threshold，MWT)的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]，采用“up and down”方法測(cè)定50%縮足閾值。將大鼠置于金屬篩網(wǎng)上的有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)30 min后，用特制的von Frey纖維絲(0.4、0.6、1、2、4、6、8、15 g)垂直刺激大鼠后肢足底掌部皮膚，持續(xù)時(shí)間≤4 s，若大鼠出現(xiàn)縮足或舔足，即記為陽(yáng)性反應(yīng)。測(cè)定首先從中等強(qiáng)度(2.0 g)開始，不能引起陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，則增大1級(jí)力度刺激；如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則減小1級(jí)力度刺激，檢測(cè)出現(xiàn)第1次陽(yáng)性或陰性反應(yīng)時(shí)記錄表上后移記錄，再測(cè)定4次。為避免前一刺激的影響，一般2次檢測(cè)之間相隔30 s。陽(yáng)性反應(yīng)用“×”表示，陰性反應(yīng)用“○”表示，計(jì)算出大鼠50%機(jī)械縮足閾值。

1.5組織學(xué)觀察大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，打開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注冰冷生理鹽水300 mL，接著使用4%多聚甲醛400 mL灌注。取L3-5DRG置于4%多聚甲醛(pH 7.2)固定2 h，后放入30%蔗糖溶液，待其在蔗糖溶液沉底后冰凍切片，晾片過夜，0.01 mol/L的PBS漂洗3次。5% 胎牛血清封閉 2 h 后，入一抗Anti-Nav1.7(1∶200) 孵育。一抗 4 ℃孵育 24 h。PBS漂洗3 次，入二抗Alexa Fluor 488(donkey anti-rabbit IgG，1∶200)，室溫孵育2 h。PBS漂洗3次后封片劑封片。德國(guó)Leica顯微鏡照相，圖像采用Biosens Digitl Imaging System v1.6軟件分析處理。

1.6Western blot冰上操作取L3-5DRG，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取蛋白，在SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)中上樣電泳，半干轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉/TBST 20 mL，水平搖床室溫封閉1 h，分別 Anti-Nav1.7 一抗(1∶200)，Anti-β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記兔二抗(1∶1 000)，室溫?fù)u床孵育2 h，發(fā)光曝光后所得條帶光密度分析，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，行為學(xué)分析結(jié)果采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，Western blot和免疫熒光結(jié)果使用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)結(jié)果為探討彌可保對(duì)DNP大鼠糖尿病神經(jīng)病理痛的影響，我們給模型組和彌可保組皮下注射STZ 75 mg/kg制作糖尿病大鼠模型，14 d后分別給予安慰劑和彌可保(600 μg/kg)腹腔注射，1次/d，連續(xù)28 d，測(cè)定STZ注射前1 d及注射后3、7、14、21、28 d MWT。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DNP組和M組隨著時(shí)程的延長(zhǎng)，MWT逐漸降低，至14、21、28 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DNP組比較，M組MWT 14、28 d升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1彌可保對(duì)DNP大鼠各時(shí)點(diǎn)MWT的影響與對(duì)照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與DNP組比較，#P<0.05

2.2形態(tài)學(xué)與Western blot結(jié)果為進(jìn)一步探討彌可保減輕DNP大鼠糖尿病神經(jīng)病理疼痛的機(jī)制，我們檢測(cè)了河豚毒素敏感性離子通道Nav1.7在大鼠DRG中的表達(dá)。我們選擇了大鼠STZ注射后28 d時(shí)間點(diǎn)，免疫熒光顯示，DNP模型大鼠的DRG神經(jīng)元中的Nav1.7蛋白明顯增加(P<0.05)，同樣Western blot結(jié)果顯示，與C組相比較，DNP大鼠DRG中，Nav 1.7表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與DNP組比較，形態(tài)學(xué)和Western blot結(jié)果均顯示，M組Nav 1.7表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見圖2、3。

圖23組大鼠DRG神經(jīng)元Nav1.7表達(dá)的形態(tài)學(xué)結(jié)果與DNP組相比，*P<0.05，**P<0.01；scale bar=50 μm(n=9)

圖33組大鼠DRG神經(jīng)元Nav1.7表達(dá)的Western blot結(jié)果與DNP組相比，*P<0.05，**P<0.01

3討論

彌可保主要成分為甲鈷胺，維生素Bl2的一種衍生物，即在中心的鈷分子上結(jié)合了1個(gè)甲基，其活性遠(yuǎn)勝于普通的維生素B12，能促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，修復(fù)損傷的神經(jīng)，可改善糖尿病周圍神經(jīng)病變的癥狀，增加神經(jīng)傳導(dǎo)速度[7]。本研究選擇彌可保進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，給予彌可保治療DNP大鼠痛閾明顯升高，表明彌可?？蓽p輕大鼠DNP。

Nav1.7是河豚毒素敏感性(TTX-S)鈉離子通道，在疼痛中起著至關(guān)重要的作用。在大鼠糖尿病病理性疼痛模型中，Nav1.7的表達(dá)和電流均呈上升趨勢(shì)[8-10]，且在坐骨神經(jīng)結(jié)扎的神經(jīng)病理性疼痛模型中，DRG中Nav1.7的表達(dá)也呈上升趨勢(shì)[11]。因此，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元中Nav 1.7表達(dá)增加，可能是DRG神經(jīng)元興奮性大幅度提高的原因。本研究結(jié)果表明，與DNP組比較，彌可保組痛閾升高Nav1.7表達(dá)增加下調(diào)，說(shuō)明腹腔注射彌可?？蓽p輕糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制可能與抑制DRG神經(jīng)元Nav1.7的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，彌可保腹腔注射可緩解大鼠糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，并顯著下調(diào)糖尿病周圍神經(jīng)病變模型大鼠DRG中NaV1.7蛋白。由此我們推測(cè)，彌可保對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變模型大鼠的治療機(jī)制可能與其能夠下調(diào)DRG中Nav1.7蛋白有關(guān)，彌可保有可能具有阻斷NaV1.7通道激活途徑中的某些環(huán)節(jié)或直接抑制Nav1.7通道活性的作用，但其明確的治療機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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(收稿 2015-06-07)

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)11-0036-03