王遠傳　張　濤　印曉鴻　趙　龍　段軍偉　李　舜　楊彬彬　曠仁釗

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科　南充　637000

顱腦損傷后大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)絲的改變 Calpain活性的變化及兩者之間的關(guān)系研究

王遠傳張濤印曉鴻趙龍段軍偉李舜楊彬彬曠仁釗

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科南充637000

【摘要】目的觀察顱腦損傷后大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)絲的改變，同時檢測Calpain活性的變化，探討兩者之間的關(guān)系及其對治療顱腦損傷的意義。方法25只雄性Wistar大鼠，隨機分為正常對照組、顱腦損傷組(顱腦損傷后6 h、12 h、24 h、72 h)共5 組，每組5只。采用Myneurolab腦立體定向儀和Benchmark顱腦損傷撞擊器制作創(chuàng)傷性顱腦損傷模型。應用免疫組化法檢測上述時間點損傷灶周圍皮層中神經(jīng)絲的形態(tài)改變，檢測Calpain活性的變化。結(jié)果顱腦損傷后，神經(jīng)絲的結(jié)構(gòu)紊亂，降解逐漸增多，傷后24 h時降解達到最高點，隨后降解的神經(jīng)絲逐漸減少。顱腦損傷后Calipain活性隨時間逐漸升高，傷后24 h時活性達到最高點，隨后逐漸降低。結(jié)論顱腦損傷后神經(jīng)絲降解的機制可能與Calipain活性的變化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】顱腦損傷；神經(jīng)絲；Calpain；活性改變

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)在全世界范圍內(nèi)都是一個嚴重的社會、醫(yī)學問題，具有發(fā)病率、致殘率、病死率高的特點，占全身創(chuàng)傷發(fā)生率第2位，病死率為第1位，是兒童及青壯年人主要的死亡和致殘原因。本實驗采用Myneurolab腦立體定向儀和Benchmark顱腦損傷撞擊器制作大鼠顱腦損傷模型，采用分子生物學、免疫組織化學等方法，在觀察顱腦損傷后神經(jīng)絲的改變并測定Calpain的活性，探討二者在顱腦損傷后隨時間變化的規(guī)律，以探討兩者之間的關(guān)聯(lián)，從而為顱腦損傷的治療開辟新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料實驗動物與分組：健康雄性Wistar大鼠25只，SPF級，體質(zhì)量(200±20)g，動物質(zhì)量合格證號為SCXK(鄂)2012-0014，由我院實驗動物中心提供。實驗期間飼養(yǎng)于我院實驗動物中心[環(huán)境許可證號SYXK(鄂)2004-0027，室溫(25±2)℃，濕度60%～80%]，常規(guī)飲食，大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后使用。實驗動物按隨機原則分為正常對照組、顱腦損傷組(6 h、12 h、24 h、72 h組)，每組5只。

主要試劑：NF-H/L鼠抗人多克隆抗體(Santa Cruz，sc-56575)，Santa Cruz公司；Calpain Activity Assay Kit(BioVision，K240-100)，Santa Cruz公司；GAPDH，Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)；標記羊抗兔二抗，Santa Cruz公司；重組人促紅細胞生成素，沈陽三生；水合氯醛，國藥集團(上海)；多聚甲醛，國藥集團(上海)；骨蠟，上海三友外科器械有限公司；吸收性明膠海綿，金陵藥業(yè)股份有限公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德；SP 試劑盒，武漢博士德；10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺，武漢博士德；PBS磷酸鹽緩沖溶液(0.01 M，pH 7.2～7.4)自配；多去污裂解緩沖液，上海碧云天；考馬斯亮藍，上海碧云天；中性樹膠，上海標本模型廠；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立：術(shù)前準備：將實驗大鼠適應性喂養(yǎng)3 d[室溫(25±2)℃，濕度60%～80%]；稱重：取小鼠放入稱重桶內(nèi)動態(tài)稱重，并記錄。麻醉：用新鮮配制10%水合氯醛(4 mL/kg體質(zhì)量)，腹腔注射麻醉，同時觀察小鼠狀態(tài)，起初小鼠自主活動，隨后異常興奮，不安且四處轉(zhuǎn)動，繼而又由興奮逐漸轉(zhuǎn)為抑制，活動遲緩，倒下不動，呼吸減慢，帶呼吸開始平穩(wěn)，即為麻醉最佳狀態(tài)；除毛備皮：剃毛器剃除小鼠頭頂部鼠毛，用濕紗布擦拭后，準備手術(shù)；顱腦損傷組使用BenchmarkTM電磁顱腦損傷撞擊器撞擊硬腦膜(撞擊速度4 m/s，撞擊后探針停留時間約1 s，撞擊面直徑2.0 mm，深度約2.0 mm)，致右頂葉的腦挫裂傷；硬膜外使用明膠海綿止血，并用骨蠟封閉骨窗，全層縫合頭皮；造模成功后分籠飼養(yǎng)小鼠，常規(guī)供給飼料和飲水。免疫組織化學檢測：免疫組織化學染色嚴格按照SP試劑盒說明書操作。Calpain 活性檢測：利用 BCA Protein Assay Kit 定量(操作步驟按說明書上進行)。分析并比較外傷組和對照組是否存在不同，以及各亞組隨時間的變化趨勢。

2結(jié)果

2.1NF-H/L的免疫組化結(jié)果光鏡下觀察示，神經(jīng)絲蛋白NF-H/L在各腦組織切片上表達呈棕黃色，在腦皮質(zhì)的大錐體細胞層、小錐體細胞層、海馬區(qū)、胼胝體中表達尤為明顯。神經(jīng)絲蛋白NF-H/L在神經(jīng)細胞的樹突和軸突內(nèi)均有表達，在大錐體細胞層中，大部分呈微細平行的絲狀排列(圖1、2)，少部分交織成網(wǎng)狀。

2.1.1正常對照組NF-H/L的免疫組化結(jié)果：神經(jīng)絲蛋白NF-H/L 在腦組織切片上含量豐富，呈棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)，在腦皮質(zhì)的大錐體細胞層、小錐體細胞層、海馬區(qū)、胼胝體中表達尤為明顯。神經(jīng)絲蛋白NF-H/L在神經(jīng)細胞的樹突和軸突內(nèi)均有表達，在大錐體細胞層中，大部分呈微細平行的絲狀排列(圖1)，少部分交織成網(wǎng)狀。

2.1.2外傷組NF-H/L的免疫組化結(jié)果：顱腦損傷組與正常組相比，顱腦損傷后6 h見神經(jīng)絲較正常組稀疏，部分結(jié)構(gòu)中斷，6～24 h內(nèi)可見神經(jīng)絲數(shù)目進一步減少，排列紊亂加重，至24 h破壞程度達到高峰，3 d時上述情況有所緩解(圖2)。

圖1　正常對照組NF-H/L的免疫組化結(jié)果(SP，×400)

6 h　　　　　　　　　　　　12 h

24 h　　　　　　　　　　　72 h

2.2Calpain活性測定結(jié)果Calpain活性在顱腦損傷后6 h較正常對照組組高(P<0.05)，并隨時間變化逐漸升高，顱腦損傷后24 h達到活性達最高值(P<0.01)，隨后逐漸降低，但仍然較對照組高。見表1。

表1　Calpain活性測定結(jié)果

3討論

近年來，Calpain在顱腦損傷、腦缺血等疾病中的作用受到普遍關(guān)注，其生物學特性、可能的生理功能和病理生理的作用機制的研究日益受到國際學術(shù)界的廣泛重視。無活性蛋白——Calpain被激活后，能使神經(jīng)絲、髓磷脂、微管以及其他結(jié)構(gòu)蛋白降解，導致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞[1]，在實驗性顱腦損傷、腦缺血、脊髓損傷等神經(jīng)元的退變過程中，細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞引起鈣超載。而細胞內(nèi)鈣超載是造成細胞不可逆性損傷的最終共同通路之一，是顱腦損傷、腦缺血等病變引發(fā)的繼發(fā)性損傷的主要原因之一[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，Calpain的激活在加重腦缺血的病理損傷過程中起重要作用[4-5]，但對于腦缺血預處理后Calpain活性的變化國內(nèi)外報道較少[6]。

本實驗中鈣蛋白酶活性檢測試劑盒(biovision k240-100)，是基于鈣蛋白酶底物Ac-LLY-AFC發(fā)出熒光，通過熒光的波長來預測鈣蛋白酶的活性。Ac-LLY-AFC激發(fā)藍光(波長400 nm)。鈣蛋白酶切割后，自由的AFC可發(fā)出黃綠光(波長505 nm)，用熒光定量或熒光酶標儀可以讀出熒光單位數(shù)值。通過比較處理組熒光與對照組樣品的強度變化可以預測鈣蛋白酶活性的變化。該試劑盒靈敏度高，特異性強，具有以下優(yōu)點：僅檢測活化的Calpain；試劑盒內(nèi)的緩沖液和試劑均經(jīng)優(yōu)化；Extraction Buffer(抽提液)特異性抽提胞質(zhì)溶膠(Cytosol)中的蛋白，而無細胞膜及溶酶體蛋白酶的干擾，且可防止抽提過程中Calpain的自發(fā)活化。

神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白NF-L、NF-M、NF-H，是神經(jīng)細胞的骨架蛋白，對于維持神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、信號轉(zhuǎn)導、軸漿運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?。細胞骨架在顱腦損傷后15 min即可在損傷灶同側(cè)及對側(cè)被檢測到有輕微的形態(tài)改變，并在24 h內(nèi)降解逐漸加重[8-9]。研究證實腦損傷后NF-H的表達量會有明顯的改變。由于早期即有明顯的改變，因此有學者探討其是否可作為顱腦損傷的早期損傷標志物[10]。顱腦損傷后，由于各種原因會導致Ca2+內(nèi)流，從而引起鈣蛋白Calpain酶的激活[11-12]。Calpain的持續(xù)激活將會導致一系列相關(guān)底物，如細胞骨架蛋白、受體和通道蛋白、信號酶、凋亡蛋白、轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白等的水解[13]。研究顱腦損傷后腦組織中Calpain的活性變化及其對病情變化的影響是顱腦損傷研究的熱門領(lǐng)域，探索Calpain的顱腦損傷機制甚至開發(fā)出Calpain特效抑制劑將有可能為外傷后護提供一條新的思路。神經(jīng)絲蛋白被公認為Calpain 的底物。Calpain的激活將會導致NF的水解，因此不同時段的NF-H的量及形態(tài)變化將會可以間接反映出鈣蛋白酶活性的變化。本實驗結(jié)果表明，顱腦損傷后神經(jīng)絲解聚增多，神經(jīng)絲結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，24 h降解達到高峰，與研究[8-9]結(jié)果一致。Calipain活性則隨時間變化不斷升高，24 h時達到最高點，隨后逐漸降低。

實驗研究表明，顱腦損傷后，神經(jīng)絲的解聚及神經(jīng)絲蛋白的降解增加，其機制可能與顱腦損傷后Calpain活性升高有關(guān)，至于通過何種途徑發(fā)揮這種作用則需要進一步討論，臨床上顱腦損傷早期可以采取各種措施降低Calpain活性，從而緩解神經(jīng)絲的解聚，從而起治療作用，因此抑制Calpain的活化成為尋找抗腦缺血藥物的一個新的靶點。

綜上所述，顱腦損傷后，神經(jīng)絲的解聚及神經(jīng)絲蛋白的降解逐漸增加，于傷后24 h時降解達到高峰，隨后逐漸恢復；顱腦損傷后，Calpain活性逐漸增強，于傷后24 h時活性達到最高點，隨后逐漸降低；顱腦損傷后24 h內(nèi)，通過各種有效的措施降低Calpain活性可能抑制神經(jīng)絲的解聚和神經(jīng)絲蛋白降解，這可能是治療顱腦損傷的新途徑，值得進一步研究。

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(收稿 2015-06-15)

Study of the changes of neurofilaments and the activity of Calpain after brain injury in adult rats and their relationship

WangYuanchuan，ZhangTao，YinXiaohong，ZhaoLong，DuanJunwei，LiShun，YangBinbin，KuangRenzhao

DepartmentofNeurosurgery，theAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China

【Abstract】Objective To investigate the changes of the cortical neurofilaments and the activity of Calpain after brain injury in adult rats，and discuss the relations and the significance between them.Methods Twenty-five male Wistar rats were random1y divided into the control group(n=5)and TBI group(n=20).The TBI group was further sub-divided into 4 groups according to the time elapsed post injury(6h，12h，24h，72h after TBI).The TBI models were produced by a Myneurolab Stereotaxic Apparatus and a Benchmark Stereotaxic Impactor.Subsequently，the changes of the cortical neurofilaments was detected by immunohistochemical staining，and the changes of the activity of the calpain were detected.Results Expression of NF-H/L decreased at 6h after the TBI，continued to reduced at 6h and 12h，and reached the lowest point at 24h，then rised，the activity of the calpain increased over time，reached the highest point at 24h，then decreased. Conclusion The mechanism of the degradaion of neurofilaments after brain injury maybe has a relationship with the activity of the calpain.

【Key words】Brain injury；Neurofilaments；Calpain；Change of the activity

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)11-0012-03