付寶軍，姜靜靜，李恒

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院·清遠市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 清遠 511518)

長春新堿是一種常用化療藥物，在治療惡性腫瘤的同時常?？烧T發(fā)化療所致神經病理性疼痛(chemotherapy-induced neuropathic pain，CINP)，CINP會影響患者的生活質量，不能耐受疼痛的患者會被迫降低化療藥物的劑量，甚至完全停止治療。目前，對于化療引起的神經性疼痛的治療策略僅限于使用三環(huán)抗抑郁藥、抗驚厥藥和阿片類藥物治療，但這些藥物往往因為各種不良反應而限制了臨床應用[1]。因此，發(fā)現(xiàn)新的CINP發(fā)生機制，對于開發(fā)新的治療策略至關重要。隨著對慢性痛機制研究的不斷深入，細胞因子尤其是集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1，CSF-1)在神經病理性疼痛中的作用越來越受到關注。近期研究證實[2-4]：在脊神經結扎、背部疼痛、關節(jié)炎疼痛模型中，CSF-1對慢性痛的疼痛信息調制過程發(fā)揮重要作用，但是其在CINP過程中的作用及機制尚未見報道。本研究采用長春新堿誘導神經病理性疼痛大鼠模型，探討CSF-1在長春新堿誘導神經病理性疼痛中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和藥品 注射用硫酸長春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，兔抗大鼠CSF-1單克隆抗體和兔抗大鼠離子鈣結合適配器分子1(ionized calcium binding adapter molecule1，Iba1)單克隆抗體(Abcam公司，美國)，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司，武漢)，von Frey細絲(Stoelting公司，美國)，Trizol RNA抽提試劑、BeyoR TTM cDNA逆轉錄試劑盒和焦碳酸二乙酯(diethyl dicarbonate，DEPC)(上海碧云天生物技術有限公司南通分公司，南通)，PCR引物(北京天根生化科技有限公司合成，北京)。熱痛刺激儀(Stoelting公司，美國)。

1.1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠(200～230 g)由清遠市人民醫(yī)院實驗動物中心提供[動物生產許可SYXK(粵)2019-0206]。所有實驗操作程序均經清遠市人民醫(yī)院實驗動物福利與應用委員會批準，遵守國際衛(wèi)生學會《實驗動物福利和應用指南》[5]。

1.2 方法

整個實驗過程中動物自由攝食和飲水，室溫(22±1)℃，光照周期12 h(7∶00～19∶00光照；19∶00～7∶00黑暗)。SD大鼠30只，按隨機數(shù)表法分為3組：正常對照組、CINP組和背根切斷(dorsal root rhizotomy，DRR)組，每組10只。CINP組：建立CINP模型，方法為隔日腹腔注射長春新堿，125 μg/kg，共計4次，第1次注射當天視為第1天。DRR組：切斷腰4～6背根后，建立CINP模型。

1.3 檢測指標

1.3.1 機械縮足反射閾值 用von Frey纖維絲以up-down法推算50%縮足閾值[6]：將一個有機玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠在其中適應15 min后，用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤3 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應，否則為陰性反應。測定首先從0.008 g開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應時，給予相鄰大1級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應則給予相鄰小1級力度的刺激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第1次陽性和陰性反應的騎跨，再連續(xù)測定4次。最大力度為15 g，大于此值時記為15 g，每次刺激間隔為30 s。在給藥前、給藥后第1、3、5、7天采用機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)評價大鼠機械痛敏。

1.3.2 熱縮足反射潛伏期 將有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，采用熱痛刺激儀照射大鼠足底[7]。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。自動切斷時間為20 s，以防止組織損傷。熱刺激強度在整個實驗過程中維持一致。每只動物測定5次，每次間隔3 min，取后3次平均值為大鼠TWL。在給藥前、給藥后第1、3、5、7天采用TWL評價大鼠熱痛敏。

1.3.3 脊髓和背根節(jié)CSF-1蛋白 給藥后第7天，各組取3只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，斷頭處死，冰上取出脊髓腰膨大及背根節(jié)部位，加入裂解液進行勻漿，4℃下12 000轉/min離心5 min，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法進行蛋白定量。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80 V恒壓，分離膠電泳條件為100 V恒壓，當溴酚藍染料前端至分離膠末端時即停止電泳，轉膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入β-actin(兔抗小鼠，1∶2 000)和CSF-1(兔抗小鼠，1∶1 000)，4℃孵育過夜后用含有吐溫20的Tris緩沖鹽水(tris buffered saline containing Tween 20，TBST)洗膜3次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶(horseradish pero-xidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育2 h后TBST洗膜4次，10 min/次。電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯色、曝光和顯影，采用Image J軟件檢測目的蛋白條帶及β-actin蛋白條帶的光密度值，目標蛋白表達量=目標蛋白條帶光密度/β-actin蛋白條帶光密度。

1.3.4 免疫熒光化學檢測Iba1蛋白 給藥后第7天，各組取3只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，用4%多聚甲醛灌注固定，取大鼠腰4～6背根節(jié)，4%多聚甲醛后固定2 h，再先后于20%、30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片機切片，厚度14 μm。免疫熒光染色：磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)(0.01 mol/L，pH值7.4)洗片3次，20 min/次；加5%羊血清室溫封閉2 h；加一抗(Iba1，1∶200)，4℃過夜孵育；次日復溫至室溫后PBS洗3次，15 min/次；分別加入Cy3標記的熒光二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，PSB洗3次，20 min/次，晾干，封片劑封片；置熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.3.5 脊髓和背根節(jié)CSF-1 mRNA 逆轉錄PCR測定給藥后第7天，每組各取3只大鼠安樂死后進行檢查。提取大鼠L4～6脊髓及背根節(jié)總RNA，反轉錄為cDNA。用ΔΔCT法測定CSF-1 mRNA含量。CSF-1上游引物：5′-TGCTAAGTGCTCTAGCCGAG-3′；下游引物：5′-CCCCCAACAGTCAGCAAGAC-3′。β-actin上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′；下游引物：5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個循環(huán)，72℃延伸10 min。計算CSF-1與β-actin的比值為目的基因的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠MWT和TWL變化情況

與對照組相比，腹腔注射長春新堿3、5、7 d后，CINP組大鼠的MWT[3 d：(11.6±0.5)g；5 d：(9.3±0.8)g；7 d：(7.9±0.5)g]和TWL[3 d：(17.3±0.7)s；5 d：(15.5±0.6)s；7 d：(13.3±1.2)s]均顯著降低(P<0.05)；與CINP組比較，DRR組大鼠在給藥3、5、7 d后的MWT[3 d：(13.2±0.9)g；5 d：(11.9±0.6)g；7 d：(12.7±1.2)g]和TWL[3 d：(18.3±0.8)s；5 d：(18.0±0.7)s；7 d：(17.8±1.0)s]均顯著升高(P<0.01；圖1)。

圖1 各組大鼠MWT和TWL比較Figure 1 Comparison of MWT(A) and TWL(B) in each group (n=10)CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain; DRR: dorsal root rhizotomy; MWT: mechanical withdrawal threshold; TWL: thermal withdrawal latency. Compared with control group, *P<0.05; compared with CINP group, ##P<0.01.

2.2 各組大鼠脊髓和背根節(jié)CSF-1蛋白表達情況比較

與對照組相比，CINP組大鼠背根節(jié)[(0.21±0.04)和(1.08±0.15)]和脊髓CSF-1蛋白[(0.22±0.05)和(1.17±0.14)]表達顯著升高(P<0.01)；與CINP組相比，DRR組大鼠背根節(jié)CSF-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，而脊髓CSF-1蛋白[(1.17±0.14)和(0.45±0.06)]表達顯著降低(P<0.01；圖2)。

圖2 各組大鼠背根節(jié)和脊髓CSF-1蛋白表達情況比較Figure 2 Comparison of CSF-1 proteins in dorsal root ganglia(A)and spinal cord(B) between each group (n=3)CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain; CSF-1:colony stimulating factor-1; DRR: dorsal root rhizotomy. Compared with control group,**P<0.01; compared with CINP group, ##P<0.01.

2.3 各組大鼠脊髓Iba1蛋白表達情況比較

與對照組相比，CINP組大鼠脊髓Iba1蛋白表達[(100±0)% 和(250±19)%]顯著升高(P<0.01)，與CINP組相比，DRR組大鼠脊髓Iba1蛋白表達[(250±19)% 和(130±16)%]顯著降低(P<0.05；圖3)。

圖3 各組大鼠脊髓Iba1表達情況比較Figure 3 Comparison of Iba1 in spinal cord in each group (n=3)A: immunofluorescence staining(×50); B: quantitative analysis. CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain;CSF-1: colony stimulating factor-1; Iba1: ionized calcium binding adapter molecule 1; DRR: dorsal root rhizotomy.Compared with control group, **P<0.01; compared with CINP group, #P<0.05.

2.4 各組大鼠背根節(jié)和脊髓CSF-1 mRNA表達情況比較

與對照組相比，CINP組背根節(jié)CSF-1 mRNA表達[(0.20±0.05)和(1.02±0.10)]顯著升高(P<0.01)；與CINP組相比，DRR組背根節(jié)CSF-1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組大鼠脊髓CSF-1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05；圖4)。

圖4 各組大鼠背根節(jié)和脊髓CSF-1 mRNA表達情況比較Figure 4 Comparison of CSF-1 mRNA in dorsal root ganglia)(A)and spinal cord(B) in each group (n=3)CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain; CSF-1: colony stimulating factor-1; DRR: dorsal root rhizotomy. Compared with control group,**P<0.01.

3 討 論

CINP大鼠模型的可操作性強、重復性好，且與臨床CINP特征有很多相似之處，已廣泛應用于CINP的研究[8]。本研究結果表明，隨著給藥時間延長，大鼠MWT和TWL開始逐漸降低，表明CINP模型制備成功。

CINP的機制至今尚不完全清楚，因而缺乏有效的治療方法。闡明CINP的發(fā)生機制，開發(fā)和尋找針對機制的新藥及治療手段具有重大意義。CSF-1是一種細胞因子，通過與Ⅲ型受體酪氨酸激酶偶聯(lián)CSF-1受體結合來發(fā)揮作用，在調節(jié)單核細胞、巨噬細胞和小膠質細胞的存活、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。研究表明[1]，背根節(jié)初級感覺神經元中CSF-1的上調對脊神經結扎動物脊髓小膠質細胞激活以及促傷害性基因誘導起著重要作用。目前尚不清楚CSF-1是否在長春新堿致神經病理性疼痛中發(fā)揮作用。

本研究結果表明，CINP大鼠產生痛覺過敏的同時伴有背根節(jié)CSF-1蛋白、Csf-1mRNA表達明顯上調，提示背根節(jié)CSF-1蛋白參與了CINP形成，這與Zhou等[9]報道結果一致。有趣的是，脊髓CSF-1蛋白上調，但是脊髓Csf-1 mRNA表達卻與對照組差異無統(tǒng)計學意義，提示脊髓CSF-1蛋白上調可能是由于其他部位CSF-1蛋白向脊髓轉運。為了驗證該假設，我們將大鼠背根切斷，結果發(fā)現(xiàn)，背根節(jié)CSF-1蛋白和mRNA表達明顯上調，但脊髓CSF-1蛋白表達明顯降低，因此提示在CINP發(fā)生的過程中，背根節(jié)原發(fā)產生的CSF-1蛋白經外周端向脊髓傳遞，增加CSF-1向脊髓傳遞痛覺信息。研究表明[2]，周圍神經損傷增加了初級感覺神經元產生和釋放CSF-1，CSF-1向脊髓運輸，從而調節(jié)背角小膠質細胞的增殖，促發(fā)外周神經損傷導致神經病理性疼痛。本研究結果表明，與CINP組比較，背根切斷后脊髓小膠質細胞活化標志物Iba1的表達明顯降低，進一步證實背根節(jié)原發(fā)產生的CSF-1蛋白經外周端向脊髓傳遞，引起脊髓背角小膠質細胞的活化增殖，從而誘發(fā)神經病理性疼痛，與上述研究結果一致。本研究結果顯示，CSF-1蛋白源發(fā)于背根節(jié)，但Tang等[10]研究表明，CSF-1蛋白源發(fā)于脊髓背角，這種結果差異可能與研究中使用的動物模型不同、觀測時間點不同、動物種屬不同等因素有關。

總之，長春新堿誘導的神經病理性疼痛可能與CSF-1自背根節(jié)向脊髓轉運活化小膠質細胞有關。