鄒琳琳　黎友倫

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016)

γ-干擾素釋放試驗(yàn)在免疫受損合并肺結(jié)核患者中的應(yīng)用

鄒琳琳黎友倫

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016)

[摘要]目的：探討γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)在免疫受損合并肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價(jià)值。方法：選取免疫受損患者、肺結(jié)核患者、免疫受損合并肺結(jié)核患者以及健康志愿者180例，均行IGRA檢測(cè)，測(cè)定其血漿中特異性γ-干擾素(IFN-γ)的含量并比較,同時(shí)對(duì)免疫受損合并肺結(jié)核者行結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：共檢測(cè)入選者180例，其中免疫受損患者組40例，肺結(jié)核組50例，免疫受損合并肺結(jié)核組40例，健康對(duì)照組50例。四組入選者血漿中IFN-γ含量的中位數(shù)分別為0.112、7.835、5.726、0.697 U/ml。四組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=74.046，P<0.001)。四組間兩兩比較，肺結(jié)核組與免疫受損合并肺結(jié)核組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但該兩組的IFN-γ含量明顯高于其他兩組，而健康對(duì)照組又高于免疫受損組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在免疫受損合并肺結(jié)核組中，IGRA的檢出率為65%，顯著高于TST檢出率的27.5%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.314,P=0.001)。結(jié)論：IGRA診斷方法在免疫受損合并肺結(jié)核患者的應(yīng)用中受免疫狀態(tài)的影響較小，且較TST有更高的檢測(cè)靈敏度，可用于輔助臨床診斷。

[關(guān)鍵詞]免疫受損；肺結(jié)核；γ-干擾素釋放試驗(yàn)

結(jié)核病是當(dāng)今危害人類健康的重大傳染性疾病，我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)≥15歲人口中活動(dòng)性肺結(jié)核患者高達(dá)499萬(wàn)[1]，而肺結(jié)核與癌癥、糖尿病、艾滋病等免疫受損的疾病并存的病例臨床上也并不少見(jiàn)[2-4]。所以，免疫受損的患者合并肺結(jié)核也逐漸受到人們的重視。

結(jié)核病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，而作為診斷結(jié)核病“金標(biāo)準(zhǔn)”的細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性率低、耗時(shí)長(zhǎng)，臨床上廣泛應(yīng)用的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(Tuberculin skin test，TST)又受接種卡介苗、非結(jié)核分枝桿菌感染、機(jī)體免疫力等因素的影響，易產(chǎn)生假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果[5]，所以TST準(zhǔn)確性備受質(zhì)疑。近年來(lái)，細(xì)胞免疫介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌特異性γ-干擾素釋放試驗(yàn)(Interferon gamma release assay，IGRA)以其較高的靈敏性及特異性備受關(guān)注，在結(jié)核病早期診斷中的作用也已得到國(guó)際上結(jié)核病防控領(lǐng)域的普遍認(rèn)可[6，7]。本文通過(guò)測(cè)定免疫受損患者、肺結(jié)核患者、免疫受損合并肺結(jié)核患者血漿中特異性γ-干擾素(IFN-γ)的含量，探討IGRA在免疫受損合并肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象2013年12月至2014年3月期間在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院招募研究對(duì)象，所有受試者均獲得知情同意。

1.1.1免疫受損患者組(A組)結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)卷調(diào)查提示為結(jié)核分枝桿菌低暴露風(fēng)險(xiǎn)，TST試驗(yàn)陰性的免疫受損患者40例，其中男性26例，女性14例，年齡43～76歲，平均58歲。入選的免疫受損患者包括，肺癌患者33例，糖尿病患者3例，肺癌合并糖尿病患者3例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者1例。

1.1.2肺結(jié)核組(B組)為初治肺結(jié)核患者，抗結(jié)核治療時(shí)間小于4周，共50例，其中男性23例，女性27例，年齡18～85歲，平均40歲。包括痰抗酸桿菌涂片或培養(yǎng)陽(yáng)性的菌陽(yáng)患者及痰抗酸桿菌涂片或培養(yǎng)陰性，但具有典型肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特點(diǎn)，抗結(jié)核治療有效，并除外其他非結(jié)核性肺部病變的菌陰性患者。入選者HIV檢測(cè)陰性，無(wú)急性病毒感染、妊娠等病史。

1.1.3免疫受損合并肺結(jié)核組(C組)為既往有明確肺癌、糖尿病病史的患者，痰抗酸桿菌涂片或培養(yǎng)陽(yáng)性，或經(jīng)纖維支氣管鏡、肺穿刺組織病理學(xué)證實(shí)為抗酸桿菌陽(yáng)性，或其他非結(jié)核性新增肺部病變的菌陰患者且抗結(jié)核治療有效者。共入選40例，其中男性31例，女性9例，年齡37～80歲，平均57歲。入選患者中包括肺癌患者3例，糖尿病患者37例。

1.1.4健康對(duì)照組(D組)選取50例既往無(wú)肺結(jié)核和肺結(jié)核接觸史，且TST試驗(yàn)、HIV檢測(cè)陰性，無(wú)急性病毒感染、妊娠等病史的健康志愿者作為正常對(duì)照組。

1.2方法

1.2.1IGRA檢測(cè)采用?？诰S瑅璦生物研究院研制生產(chǎn)的結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(簡(jiǎn)稱A.TB)進(jìn)行IGRA檢測(cè)。無(wú)菌采集每個(gè)入選者新鮮的肝素鈉抗凝全血3 ml，分別吸取1 ml全血加入至N(陰性刺激劑)、P(陽(yáng)性刺激劑)、T(ESAT-6和CFP-10)3個(gè)反應(yīng)管中，16 h內(nèi)完成。37℃水浴箱中孵育22～24 h，收集N、P、T管血漿，2～8℃保存，兩周內(nèi)完成檢測(cè)，或≤-20℃長(zhǎng)期保存。按照A.TB產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提供的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出N、P、T管血漿中IFN-γ的水平，其中N值表示待檢樣本在未經(jīng)任何抗原刺激時(shí)表現(xiàn)出的IFN-γ水平，T值表示樣本中的淋巴細(xì)胞針對(duì)結(jié)核桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后特異性釋放的IFN-γ水平，P值代表此淋巴細(xì)胞受到絲裂原(本產(chǎn)品中為伴刀豆球蛋白A，Con A)刺激后非特異性釋放的IFN-γ水平，反映受試者基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫狀態(tài)和樣本中淋巴細(xì)胞的活力。T-N即代表受試者血漿中的特異性IFN-γ含量。按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)規(guī)定，當(dāng)N<0.5 U/ml時(shí)，(T-N)/(P-N)≥0.60時(shí)結(jié)果判為陽(yáng)性，否則為陰性；當(dāng)N≥0.5 U/ml時(shí)，(T-N)/(P-N)≥0.85時(shí)結(jié)果判為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.2TST檢測(cè)在采集IGRA檢測(cè)用血的同時(shí)，對(duì)免疫受損合并肺結(jié)核組進(jìn)行TST試驗(yàn)，對(duì)受試者進(jìn)行皮內(nèi)注射PPD(5 U)，注射部位為前臂屈測(cè)上1/3處，72 h后觀察注射部位的反應(yīng)情況。按照《全國(guó)結(jié)核病防治工作手冊(cè)》規(guī)定對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，硬結(jié)直徑≥5 mm或有水泡、破潰者為T(mén)ST試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)A、B、C、D四組采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，四組中IFN-γ含量的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，而對(duì)于C組中IGRA與TST試驗(yàn)檢出率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1IFN-γ含量A組血漿中結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ含量分布范圍為-0.022～11.768 U/ml，B組血漿中結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ含量分布范圍為0.166～16.110 U/ml，C組血漿中結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ含量分布范圍為0.163～15.722 U/ml，D組血漿中結(jié)核分枝桿菌IFN-γ含量分布范圍為-0.009～16.854 U/ml。經(jīng)檢驗(yàn)C組滿足正態(tài)性分布(P=0.070)，而A、B、D三組不滿足正態(tài)性分布(P<0.05)，故采用中位數(shù)(P50)作為受試者血漿中IFN-γ的含量。A組P50為0.112 U/ml，分布范圍為0.008～1.084 U/ml(P25～P75)，B組P50為7.835 U/ml，分布范圍為2.248～12.305 U/ml(P25～P75)，C組P50為5.726 U/ml，分布范圍為2.095～9.345 U/ml(P25～P75)，D組P50為 0.697 U/ml，分布范圍為0.122～4.163 U/ml(P25～P75)。

表1A、B、C、D四組間兩兩比較

Tab.1A，B，C，D pairwise comparisons among four groups

Group(I)Group(J)Meandifference(I-J)SEPvalue95%CILowerlimitUpperlimitGroupAGroupB-81.8001)8.5360.000-98.645-64.955GroupA-74.2751)8.9970.000-92.032-56.518GroupD-25.8201)8.5360.003-42.665-8.975GroupBGroupA81.8001)8.5360.00064.95598.645GroupC7.5251)8.5360.379-9.32024.370GroupD55.9801)8.0470.00040.09871.862GroupCGroupA74.2751)8.9970.00056.51892.032GroupB-7.5251)8.5360.379-24.3709.320GroupD48.4551)8.5360.00031.61065.300GroupDGroupA25.8201)8.5360.0038.97542.665GroupB-55.9801)8.0470.000-71.862-40.098GroupC-48.4551)8.5360.000-65.300-31.610

Note：1)Significant level of mean difference was 0.05.

表2IGRA與TST試驗(yàn)在C組中的診斷性能比較

Tab.2Comparison of diagnostic performance of IGRA and TST in group C

MethodGroupC(n)PositiveNegativeOverallIGRA261440TST112940Overall374380

四組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=74.046，P<0.001)。四組間進(jìn)行兩兩比較，由表1可知，B組與C組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.379)，但該兩組分泌的IFN-γ明顯高于A、D兩組，而D組分泌的IFN-γ又高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2IGRA與TST在免疫受損合并肺結(jié)核組中的診斷性能比較C組患者中IGRA與TST的診斷性能，由表2可知， IGRA的檢出率為65%(26/40)，顯著高于TST檢出率的27.5%(11/40)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.314,P=0.001)。

3討論

IGRA是在體外檢測(cè)T細(xì)胞經(jīng)存在于結(jié)核分枝桿菌，但在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中普遍缺失的RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后產(chǎn)生和釋放的IFN-γ，藉此判斷機(jī)體是否存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)[8]。目前有兩種較為成熟的IFN-γ釋放分析技術(shù)，即英國(guó)生產(chǎn)的T-SPOT.TB試驗(yàn)和澳大利亞生產(chǎn)QFT-G試驗(yàn)，而本文所采用的A.TB試劑盒是以GFT-G試驗(yàn)為基礎(chǔ)的國(guó)內(nèi)首款結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，已有研究結(jié)果表明A.TB具有較高的敏感性和特異性，其診斷性能與T-SPOT.TB及QFT-G相當(dāng)[9,10]，已廣泛應(yīng)用于臨床。

近年來(lái)，癌癥、糖尿病、艾滋病等免疫功能受損的疾病發(fā)病率較高，結(jié)核發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)，免疫受損合并肺結(jié)核者也越發(fā)多見(jiàn)。患者機(jī)體免疫力下降，增加了結(jié)核感染的機(jī)率，或使得已靜止的結(jié)核病活動(dòng)或惡化。當(dāng)免疫受損患者并發(fā)肺結(jié)核時(shí)，由于藥物或其他因素的影響，其臨床癥狀可隱匿或輕微，缺乏呼吸道癥狀，也可由于免疫預(yù)防機(jī)制的受損，出現(xiàn)疾病暴發(fā)性進(jìn)展。在疾病診斷方面，因患者免疫預(yù)防機(jī)制受損，并發(fā)的肺部感染病因多樣且復(fù)雜，當(dāng)其合并結(jié)核感染時(shí)，其臨床表現(xiàn)與影像學(xué)特點(diǎn)可與一般肺結(jié)核顯著不同，加之基礎(chǔ)疾病的肺浸潤(rùn)，藥物的肺部反應(yīng)等干擾，使得診斷十分困難，容易誤診、漏診。因此，盡早甄選出免疫損害人群中的結(jié)核感染者，并對(duì)其進(jìn)行有效的治療或監(jiān)測(cè)，在提高患者存活率，改善其生活質(zhì)量以及結(jié)核病防控方面都有著重要的意義。本研究通過(guò)測(cè)定免疫受損患者、肺結(jié)核患者、免疫受損合并肺結(jié)核患者血漿中IFN-γ的含量，同時(shí)與健康對(duì)照組血漿中IFN-γ含量比較，結(jié)果表明，免疫受損患者血漿中特異性IFN-γ含量明顯低于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)樵诿庖呤軗p患者中，反應(yīng)機(jī)體免疫功能及應(yīng)激程度的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)會(huì)有所減少[11]，而IGRA結(jié)果又受外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響[12]，因此免疫受損患者IFN-γ含量低于健康者。但是與肺結(jié)核患者相比，免疫受損患者合并肺結(jié)核時(shí)所釋放的IFN-γ并無(wú)明顯差異，由此說(shuō)明，當(dāng)機(jī)體合并結(jié)核感染時(shí)，結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激機(jī)體產(chǎn)生和釋放的IFN-γ量可能主要是受結(jié)核特異性抗原這一“質(zhì)”，而非免疫反應(yīng)強(qiáng)度這一“量”決定。對(duì)免疫受損合并肺結(jié)核患者同時(shí)行TST檢測(cè)，與IGRA結(jié)果相比，TST的檢出率明顯低于IGRA，這也進(jìn)一步說(shuō)明TST受機(jī)體免疫功能影響較大。IGRA診斷方法在免疫受損合并肺結(jié)核患者的應(yīng)用中受免疫狀態(tài)的影響較小，且較TST有更高的檢測(cè)靈敏度，在一定程度上避免了TST因機(jī)體免疫功能受損而產(chǎn)生的假陰性結(jié)果，可用于合并免疫受損的肺結(jié)核患者的輔助診斷與鑒別診斷，這與文獻(xiàn)報(bào)道亦相符[13-15]。但本研究中試驗(yàn)樣本量較少，對(duì)比比較單一，還需要大量本、前瞻性隊(duì)列研究，以期獲得更加準(zhǔn)確、客觀的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(8):485-508.

[2]Tsunezuka Y,Ishikawa N,Hiranuma C,etal.Mycobacteria other than tuberculosis combined primary lung cancer[J].Kyobu Geka,2004,57(2):119-122.

[3]Banerjee S,Banerjee M.Diabetes and tuberculosis interface[J].J Indian Med Assoc,2005,103(6):318-322.

[4]Alamo ST,Kunutsor S,Walley J,etal.Performance of the new WHO diagnostic algorithm for smear-negative pulmonary tuberculosis in HIV prevalent settings:a multisite study in Uganda[J].Tropical Med Int Health,2012,17(7):884-895.

[5]Diel R,Goletti D,Ferrara G,etal.Interferon-γ release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection:a systematic review and meta-analysis[J].Eur Respir J,2011,37(1):88-99.

[6]Pai M,Kalantri S,Dheda K.New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis:Part Ⅰ.Latent tuberculosis[J].Expert Rev Mol Diagn,2006,6(3):413-422.

[7]Pai M,Kalantri S,Dheda K.New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis:Part Ⅱ.Active tuberculosis and drug resistance[J].Expert Rev Mol Diagn,2006,6(3):423-432.

[8]Andersen P,Munk ME,Pollock JM,etal.Specific immune-based diagnosis of tuberculosis[J].Lancet,2000,356(9235):1099-1104.

[9]高孟秋,劉菲,紀(jì)濱英,等.兩種γ干擾素釋放分析技術(shù)在結(jié)核病臨床診斷中的比較[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2012,35(10):762-765.

[10]Wei Z,Yang M,Quan B,etal.Prevalence tuberculosis infection among healthcare workers in China as detected by two interferon-gamma release assays[J].J Hosp Infect,2013,84(4):323-325.

[11]周文,張鵬,宋世輝,等.300例肺癌患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分析[J].中國(guó)肺癌雜志,2009,12(10):1127-1129.

[12]楊新婷,楊揚(yáng),杜鳳嬌,等.肺結(jié)核患者全血γ干擾素釋放試驗(yàn)影響因素的探討[J].中國(guó)防癆雜志,2013,35(12):1007-1012.

[13]Riceldi L,Losi M,D′Amico Retal.Performance of testes for latent tuberculosis in different group of immunocompromised patients[J].Chest,2009,136(1):198-204.

[14]Walsh MC,Camerlin AJ,Miles R,etal.The sensitivity of interferon-γ release assays is not compromised in tuberculosis patients with diabetes[J].Int J Tuberc Lung Dis,2011,15(2):179-184.

[15]Kim EY,Lim JE,Jung JY,etal.Performance of the tuberculin skin test and interferon-γ release assay for detection of tuberculosis infection in immunocompromised patients in a BCG-vaccinated population[J].BMC Infect Dis,2009,9:207.

[收稿2015-08-15修回2015-08-31]

(編輯許四平)

Application of interferon-γ release assay in immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis

ZOU Lin-Lin,LI You-Lun.

Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the application value of interferon-γ release assay(IGRA) in immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis.Methods: 180 cases were chose including immunocompromised patients,pulmonary tuberculosis patients,immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis and healthy volunteers to undergo IGRA in order to determine and compare the content of specific interferon-γ(IFN-γ)in plasma.At the same time,the result of immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis was compared with tuberculin skin test (TST).Results: 180 cases of the list were tested,included 40 immunocompromised patients(group A),50 pulmonary tuberculosis patients(group B),40 immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis patients(group C),and 50 cases in healthy control group(group D).The median of specific IFN-γ contents in the four groups were respectively 0.112，7.835，5.726，0.697 U/ml.The comparison of differences among the four groups was statistically significant (χ2=74.046,P<0.001).Pairwise comparisons among the four groups,and the differences between group B and group C were no significant,but specific IFN-γ content of the two groups was significantly higher than the other two groups,while the group D was higher than group A,the differences were statistically significant.The positive rate of IGRA was significantly higher than that of TST in group C(χ2=11.314,P=0.001).Conclusion: IGRA diagnosis in the application of immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis was less affected by immune status and was more sensitive than TST,which can be used as auxiliary diagnosis.

[Key words]Immunocompromised；Pulmonary tuberculosis；Interferon-γ release assay

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.024

作者簡(jiǎn)介：鄒琳琳(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事結(jié)核病的臨床研究。 通訊作者及指導(dǎo)教師：黎友倫(1965年-)，男，博士，教授，主要從事結(jié)核病發(fā)病機(jī)制和耐藥研究，E-mail:liyoulun83@163.com。

中圖分類號(hào)R44

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0878-04