樊建軍　武家燕　李　韻　曾　帆　宋方洲

(重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，生物化學與分子生物學教研室，重慶400016)

沉默GRP94基因?qū)θ橄侔㎝CF7細胞增殖和凋亡的影響

樊建軍武家燕李韻曾帆宋方洲

(重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，生物化學與分子生物學教研室，重慶400016)

[摘要]目的：研究沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94 (Glucose regulated protein，GRP94)對乳腺癌MCF7細胞增殖、凋亡的影響及潛在機制。方法：設(shè)計并化學合成靶向沉默GRP94基因的小干擾RNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入MCF7細胞中，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測GRP94、cyclinD1、Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平；通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡比例變化，Hoechst 33258染色檢測凋亡細胞核變化、CCK8實驗檢測細胞增殖能力的變化。結(jié)果：GRP94 siRNA組GRP94基因的表達水平被有效抑制；與對照組相比，GRP94-siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡比例明顯增加；凋亡細胞核形態(tài)發(fā)生變化；增殖能力明顯下降；mRNA及蛋白水平cyclinD1、Bcl-2表達明顯下調(diào)，Bax表達增加。結(jié)論：沉默GRP94基因可明顯抑制乳腺癌MCF7細胞增殖能力，促進細胞凋亡的發(fā)生，且其可能通過下調(diào)cyclinD1、Bcl-2和上調(diào)Bax表達參與其中。

[關(guān)鍵詞]GRP94基因；MCF7細胞；增殖；凋亡

乳腺癌是嚴重危害女性身心健康的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤第二位，近幾年在我國其發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢[1]。研究表明乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素作用的結(jié)果，其中許多重要基因參與其發(fā)生發(fā)展的過程，已報到cyclinD1、MMP9等基因的異常表達促進了乳腺癌的發(fā)生[2,3]，因此針對乳腺癌發(fā)生相關(guān)的基因靶向進行研究，有助于進一步揭示乳腺癌的發(fā)病機制及預后。

分子伴侶GRP94作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的豐度蛋白之一，參與了蛋白質(zhì)的組裝、折疊與降解，同時可與Ca2+離子結(jié)合參與細胞免疫應答反應[4]。研究表明，GRP94在食管癌、胰腺癌及子宮癌等多種腫瘤中呈高表達趨勢，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。有學者在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)GRP94呈高表達趨勢[6]，沉默GRP94可有效抑制腫瘤的侵襲遷移能力，提示腫瘤中高表達的GRP94對于腫瘤細胞遠處遷移能力的獲得具有重要作用[7]。為了進一步研究GRP94與乳腺癌生物學特性的關(guān)系，本研究采用小干擾RNA技術(shù)靶向沉默乳腺癌MCF7細胞中GRP94的表達，觀察其對MCF7細胞增殖及凋亡的影響并探討其可能機制，進而為研究GRP94在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑PRMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；Total RNA 提取試劑盒購自O(shè)mega公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineRNAIMAX購自美國Invitrogen公司；蛋白提取試劑盒、β-actin單克隆抗體和ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；各引物由上海生工生物公司合成；兔抗人GRP94、cyclinD1單克隆抗體購自英國Abcam；兔抗人Bax、Bcl-2單克隆抗體購自北京博奧森公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自CST公司。

1.2方法

1.2.1siRNA的合成根據(jù)GRP94基因在Genebank中的序列(Genebank Accession No:NM-003299.2設(shè)計靶向GRP94基因的siRNA序列：(UACUGUACCAUCCACAUCA)；siRNA-negative control序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，干粉siRNA用DEPC水稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細胞由重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心保存。由含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24 h，以2×105個/孔細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，當細胞達70%～80%匯合度時，參照LiopfectamineRNAIMAX產(chǎn)品說明書，分別將siRNA-NC和siRNA-GRP94轉(zhuǎn)染至六孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換完全培養(yǎng)基。

1.2.3qRT-PCR法收集轉(zhuǎn)染48 h兩組細胞，按照Total RNA 提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，再分別進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green法進行qRT-PCR，用于擴增各目的基因cDNA片段的引物見(表1)，反應條件為：95℃、3 min；95 ℃、5 s；60 ℃、15 s；72 ℃、15 s，共39個循環(huán)。同一實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法計算。

1.2.4Western blot法分別收集轉(zhuǎn)染72 h后各組細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液100℃，5 min，每孔40 μg，80 V恒壓SDS-PAGE電泳，250 mA恒流2 h冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(GRP94 1∶1 000、cyclinD1 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶500、β-actin 1∶3 000)4 ℃過夜，次日TBST漂洗5 min×5次，加入HRP標記的二抗(羊抗兔1∶4 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×4次，ECL化學發(fā)光顯影。

1.2.5CCK-8法將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細胞分別消化收集，細胞計數(shù)，以每孔3 000個/100 μl接種于96孔板中，以細胞貼壁后計為1 d，分別在1、2、3、4、5 d不同時間段加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育2 h后在波長450 nm處檢測其光密度值。

1.2.6流式細胞術(shù)消化收集轉(zhuǎn)染72 h后各組細胞，細胞凋亡比例變化的檢測按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，消化收集各組轉(zhuǎn)染72 h的各組細胞，1 000 r/min離心5min，棄去上清液，PBS洗滌并重懸，先后加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI各在4 ℃孵育15 min后，上機檢測。

1.2.7Hoechst 33258染色將對數(shù)增殖期MCF7細胞消化計數(shù)，以2×105個/孔提前24 h接種于放有玻片的12孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，去除培養(yǎng)基，加入1 ml 4%多聚甲醛，室溫固定30 min，后去除固定液，PBS漂洗3次，5 min/次，晾干后每孔加入100 μl Hoechst 33258液，室溫染色10 min，PBS漂洗3次，10 min/次，去除多余水分，使用抗熒光猝滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照。

2結(jié)果

2.1qRT-PCR、Western blot分別在mRNA和蛋白水平驗證GRP94siRNA沉默效果結(jié)果顯示：siRNA-NC組中GRP94基因的相對表達量明顯高于siRNA- GRP94，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1A、B)說明GRP94基因被有效沉默。

2.2沉默GRP94對乳腺癌MCF7細胞增殖能力的影響通過CCK-8法檢測細胞貼壁后1、2、3、4、5 d的光密度值，繪制生長曲線，結(jié)果顯示與siRNA-NC相比，siRNA-GRP94組中細胞生長速率明顯下降，說明沉默GRP94對MCF7細胞生長有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2)。

表1引物序列

Tab.1Sequences for primers

GenenamePrimersequenceGRP94Forward5'-GGGAGGTCACCTTCAAGTCG-3'Reverse5'-GGGTGTAGACGTGGAGCTC-3'CyclinD1Forward5'-AAGCTGTGCATCTACACCGA-3'Reverse5'-CTTGAGCTTGTTCACCAGGA-3'BaxForward5'-GGCGAATTGGAGATGAACTG-3'Reverse5'-TGCCATCAGCAAACATGTCA-3'Bcl-2Forward5'-ATCCAGGATAACGGAGGCTG-3'Reverse5'-CAGGTATGCACCCAGAGTGA-3'β-actinForward5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'Reverse5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'

2.3沉默GRP94對乳腺癌MCF7細胞細胞凋亡的影響結(jié)果顯示：沉默GRP94基因表達后，與siRNA-NC組相比siRNA-GRP94組中細胞凋亡比例明顯增加(圖3A)(P<0.05);Hoechst 33258 染色后siRNA-GRP94組中細胞熒光顯微鏡下，細胞核發(fā)生明顯變化，染色質(zhì)凝集，邊緣化的細胞量顯著增加(圖3B)。提示沉默GRP94促進MCF7細胞凋亡。

2.4沉默GRP94對乳腺癌MCF7細胞中cyclinD1、Bax和Bcl-2表達的影響qRT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-GRP94組中cyclinD1、Bax表達明顯減少，Bcl-2表達明顯增加差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示沉默GRP94表達可有效抑制cyclinD1、Bax表達，且上調(diào)Bcl-2表達(圖4、5)。

圖1　qRT-PCR、Western blot分別檢測GRP94 mRNA和蛋白表達水平Fig.1　Expression of GRP94 mRNA and protein level was detected by qRT-PCR and western blotNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05,compare with RNA-NC group.

圖2　CCK-8測定沉默GRP94基因表達對乳腺癌MCF7細胞增殖的影響Fig.2　Effect of silencing GRP94 expression was evaluated by CCK-8 on the cell proliferation of MCF7 cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01 compare with siRNA-NC group.

圖3　沉默GRP94基因表達對乳腺癌MCF7細胞凋亡的影響Fig.3　Effect of silencing GRP94 expression was detected by flow cytometry and hoechst 33258 staining on cell apoptosis of MCF7 cellsNote: A.Flow Cytometry assay；B.Hoechst 33258 Staining;*.P<0.05，compare with siRNA-NC group.

圖4　沉默MCF7細胞中GRP94基因?qū)yclinD1表達的影響Fig.4　Effects of silencing GRP94 on expression of cyclinD1 in MCF7 cellsNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05，compare with siRNA-NC group.

圖5　沉默GRP94基因表達對MCF7細胞中Bax和Bcl-2表達的影響Fig.5　Effects of silencing GRP94 on expression of Bax and Bcl-2 in MCF7 cellsNote: A.mRNA level;B.protein level;*.P<0.05，compare with siRNA-NC group.

3討論

腫瘤的發(fā)生是一個多層次、多階段演進的過程，其涉及到多種因子的表達調(diào)控，同時也與眾多信號通路的異?；罨芮邢嚓P(guān)[8]。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，由于腫瘤細胞處于缺氧、營養(yǎng)不良等微環(huán)境中，導致錯誤折疊或未折疊的蛋白增多，進而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR),GRP94表達被誘導,協(xié)助未折疊蛋白的折疊、裝配及轉(zhuǎn)運[9]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)GRP94可通過影響多條信號通路的活化參與腫瘤的生物學進程[10]，且與腫瘤細胞的耐藥性的獲得密切相關(guān)[11]。Hua等[12]在一項多發(fā)性骨髓瘤的研究中發(fā)現(xiàn),分子伴侶GRP94通過活化Wnt信號通路，促進腫瘤細胞的增殖，而通過選擇性抑制劑WS13處理后，腫瘤細胞的增殖能力受到抑制，促進細胞凋亡的發(fā)生。Chen等[12]通過對小鼠肝臟特異性敲除模型的研究發(fā)現(xiàn)，GRP94可選擇性激活ERK信號通路，參與腫瘤的發(fā)生。張黎川等[11]證實上調(diào)GRP94表達可提高肺癌SK-MES-1細胞對VP-16的耐藥性。提示GRP94與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而針對分子伴侶GRP94的研究對探討實體瘤的發(fā)病機制具有重要的實用價值。

本研究在乳腺癌MCF7細胞中采用RNAi技術(shù)外源性導入靶向GRP94的siRNA，結(jié)果顯示mRNA與蛋白水平GRP94表達均顯著降低，提示MCF7細胞中GRP94表達被顯著抑制。同時研究發(fā)現(xiàn)，沉默GRP94表達后細胞增殖能力受到明顯抑制，細胞凋亡比例明顯增加，提示GRP94參與了乳腺癌細胞的增殖與凋亡的發(fā)生。細胞周期蛋白D1(cyclinD1)主要定位于細胞核，其表達具有嚴格的周期順序性，研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1作為Wnt信號通路的下游靶基因，參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡等生理過程，且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。沉默GRP94表達后發(fā)現(xiàn)cyclinD1明顯降低，提示沉默GRP94可能通過影響cyclinD1表達調(diào)控乳腺癌MCF7細胞的增殖能力。而進一步我們推測沉默GRP94可能通過阻斷Wnt信號通路調(diào)節(jié)乳腺癌MCF7細胞的增殖能力。Bax與Bcl-2作為Bcl-2家族重要的抑制凋亡和促進凋亡蛋白，腫瘤中Bcl-2/Bax表達比例決定著細胞幸存還是凋亡[15]。沉默GRP94表達后，結(jié)果顯示Bax表達降低，Bcl-2表達明顯增加，細胞凋亡發(fā)生，提示沉默GRP94可通過影響B(tài)cl-2/Bax表達比例，促進腫瘤細胞凋亡。而GRP94如何介導這一過程的發(fā)生，有待于我們進一步的研究。

綜上所述，乳腺癌中高表達的GRP94參與了腫瘤細胞的增殖，抑制凋亡的發(fā)生，提示GRP94對乳腺癌的發(fā)生與惡化起著重要的作用，而其是否可作為乳腺癌的一個腫瘤標志物，及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機制研究是我們今后的研究重點，而本研究以GRP94基因?qū)θ橄侔㎝CF7細胞增殖與凋亡的影響作為切入點，為乳腺癌的基因治療靶點的探索提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Merabishvili VM.Breast cancer:morbidity,mortality,survival (population study)[J].Vopr Onkol，2011，57 (5):609-615.

[2]Umekita Y,Ohi Y,Sagara Y,etal.Overexpression of cyclinD1 predicts for poor prognosis in estrogen receptor-negative breast cancer patients.[J].Int J Cancer，2002，98 (3):415-418.

[3]Beeghly-Fadiel A,Lu W,Shu XO,etal.MMP9 polymorphisms and breast cancer risk:a report from the Shanghai Breast Cancer Genetics Study[J].Breast Cancer Res Treat，2011，126 (2):507-513.

[4]Dersh D,Jones SM,Eletto D,etal.OS-9 facilitates turnover of nonnative GRP94 marked by Hyperglycosylation[J].Mol Biol Cell，2014，25(15):2220-2234.

[5]Takahashi H,Wang JP,Zheng HC,etal.Overexpression of GRP78 and GRP94 is involved in colorectal carcinogenesis[J].Histol Histopathol，2011，26(6):663-671.

[6]Hodorova I,Rybarova S,Solar P,etal.Gp96 and its different expression in breast carcinomas[J].Neoplasma，2008，55 (1):31-35.

[7]樊建軍，武家艷，李海玉，等.RNAI沉默GRP94基因?qū)θ耸彻馨〦CA109細胞遷移及侵襲能力的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2015，12(37):1222-1225.

[8]Liu X,Lazenby AJ,Siegal GP.Signal transduction cross-talk during colorectal tumorigenesis[J].Adv Anat Pathol，2006，13 (5):270-274.

[9]甄春英,于海豐,葉磊光,等.GRP94 生物學特點與腫瘤的關(guān)系的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12(22):4380-4383.

[10]Li X,Liu Z,Yan X,etal.Induction of regulatory T cells by high-dose gp96 suppresses murine liver immune hyperactivation[J].PLoS One，2013，8 (7):e68997.

[11]張黎川，王佳瑞，孟強，等.GRP94表達在肺癌細胞對VP-16化療耐藥中的作用[J].大連醫(yī)科大學學報，2011，3(33):211-215.

[12]Hua Y,White-Gilbertson S,Kellner J,etal.Molecular chaperone gp96 is a novel therapeutic target of multiple myeloma[J].Clin Cancer Res，2013，19 (22):6242-6251.

[13]Chen WT,Ha D,Kanel G,etal.Targeted deletion of ER chaperone GRP94 in the liver results in injury,repopulation of GRP94-positive hepatocytes,and spontaneous hepatocellular carcinoma development in aged mice[J].Hepatology，2014，59 (3):947-957.

[14]Peng H,Zhong XY,Liu KP,etal.Expression and significance of adenomatous polyposis coli,beta-catenin,E-cadherin and cyclin D1 inesophageal squamous cell carcinoma assessed by tissue microarray[J].Ai Zheng，2009，28(1):38-41.

[15]陳惠瑜,施騰飛,成玲,等.SU11248對白血病細胞HL-60增殖及凋亡作用的實驗研究[J].中國免疫學雜志，2012，28(6):512-551.

[收稿2015-09-10修回2015-06-01]

(編輯許四平)

Effect of GRP94 silencing on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma MCF7 cells

FAN Jian-Jun,WU Jia-Yan,LI Yun,ZENG Fan,SONG Fang-Zhou.

Department of Biochemistry and Molecular Biology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

[Abstract]Objective:To determine the effects of silencing glucose regulated protein (GRP94) on the proliferation and apoptosis of breast carcinoma MCF7 cells.Methods: Chemically synthesized siRNA targeting GRP94 gene and transfected into MCF7 cells used by Liopfectamine RNAIMAX.The mRNA and protein expression levels of GRP94,cyclinD1,Bax and Bcl-2 were detected by Real-time PCR and Western blot.CCK8 assay was used to detect the effect of specific GRP94 siRNA on cell proliferation and the effect on cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry and Hoechst 33258 staining.Results: Compared with the siRNA-NC cells,the expression of GRP94 was significantly down-regulated in MCF7 cells.Knockdown of GRP94 in MCF7 cells decreased cell proliferation and promoted cell apoptosis.The expression of cyclinD1and Bcl-2levels were significantly reduced,and Bax level was increased in siRNA-GRP94 MCF7 cells.Conclusion: The siRNA-mediated GRP94 silence significantly inhibits MCF7 cell proliferation，promoted cell apoptosis by down-regulating cyclin D1,Bcl-2 expression and up-regulating the Bax expression in MCF7 cells.

[Key words]GRP94 gene;MCF7 cells;Proliferation;Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.013

作者簡介：樊建軍(1986年-)，男，碩士，主要從事腫瘤生物學、腫瘤標志物的相關(guān)研究,E-mail:steve4802@163.com。 通訊作者：宋方洲 (1956年-)，男，教授，博士生導師，華中科技大學兼職博導，主要從事細胞與分子生物學、功能基因組學與蛋白質(zhì)組學、基因工程藥物與基因治療方面的研究,E-mail:fzsongcq@163.com。

中圖分類號R392.12R737.9

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0828-04