劉 祥

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 漢中 723001)

福氏志賀菌2a型外膜蛋白A的生物信息學(xué)分析與重組表位疫苗分子的設(shè)計(jì)

劉 祥

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 漢中 723001)

摘要福氏志賀菌外膜蛋白OmpA(outer membrane protein A)具有較強(qiáng)的免疫原性，在疫苗上有應(yīng)用前景。采用MEGA(molecular evolutionary genetics analysis)軟件對(duì)OmpA的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，福氏志賀菌與腸道細(xì)菌間親緣關(guān)系較其它菌屬更近。利用在線軟件預(yù)測(cè)OmpA為親水的分泌型蛋白，存在多個(gè)酶切位點(diǎn)；采用TMHMM(transmembrane hidden markov models)Server v.2.0程序預(yù)測(cè)OmpA無跨膜結(jié)構(gòu)并定位于細(xì)胞膜外；SOPMA(self-optimized prediction method with alignment)服務(wù)器預(yù)測(cè)OmpA二級(jí)結(jié)構(gòu)中含無規(guī)則卷曲41.09 %，α-螺旋26.44 %，β-轉(zhuǎn)角10.06%，β-片層22.41 %。通過SignalP 4.1軟件分析顯示，OmpA的1～21位氨基酸為信號(hào)肽序列。采用Swiss-Model程序預(yù)測(cè)的三維模型顯示OmpA為桶裝結(jié)構(gòu)。利用ABCpred(artificial neural network based B-cell epitope prediction)和BepiPred(B-cell epitopes prediction)方案，預(yù)測(cè)OmpA存在3個(gè)B細(xì)胞表位。運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法預(yù)測(cè)OmpA具有1個(gè)CTL表位。使用MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽在線程序預(yù)測(cè)顯示OmpA具有1個(gè)Th表位。設(shè)計(jì)獲得抗原性較好的OmpA蛋白重組表位多肽。為OmpA多表位串聯(lián)疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞福氏志賀菌；OmpA蛋白；細(xì)胞表位；蛋白結(jié)構(gòu)

福氏志賀菌(Shigellaflexneri)為革蘭陰性菌，可引起人類的細(xì)菌性痢疾，是一種高危傳染性腸道致病菌，給人類健康帶來影響[1，2]。該菌導(dǎo)致的疾病在發(fā)展中國家流行，并以兒童為主要患病群體[3]。然而隨著抗生素的廣泛使用，福氏志賀菌耐藥性菌株不斷產(chǎn)生[4]，給該菌的治療感染帶來一定的難度。需要研發(fā)一種安全、無耐藥性的新型疫苗。外膜蛋白A(Outer membrane protein A, OmpA)為革蘭陰性菌主要外膜蛋白[5]，是福氏志賀菌主要毒力蛋白之一，可增強(qiáng)福氏志賀菌對(duì)宿主的粘附與感染作用[6]。小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OmpA蛋白可激活小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫，實(shí)現(xiàn)對(duì)福氏志賀菌感染的有效抵抗[7，8]。因而，OmpA是一種很好的蛋白亞單位候選疫苗[9]。

我們前期已經(jīng)對(duì)OmpA蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)與發(fā)酵條件研究[6, 10]。而對(duì)OmpA蛋白性質(zhì)缺乏了解，給疫苗的研制帶來一些困難。本研究借助于生物信息學(xué)方法，采用多參數(shù)預(yù)測(cè)的方式，對(duì)OmpA蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)，以及優(yōu)勢(shì)的B/T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并設(shè)計(jì)OmpA蛋白的重組表位疫苗分子。為OmpA蛋白疫苗的研制，尤其是多表位串聯(lián)疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

依據(jù)GenBank公布的福氏志賀菌2a型外膜蛋白OmpA序列，登錄號(hào)為NP_706879.2，全長共348個(gè)氨基酸。序列如下：

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFIPNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGDNINGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKANVPGGASFKDHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDANTIGTRPDNGLLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA。

1.2方法

1.2.1OmpA生物信息學(xué)分析

利用MEGA軟件對(duì)NCBI已公布的OmpA蛋白序列氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。通過生物信息學(xué)相關(guān)預(yù)測(cè)網(wǎng)站和軟件，分析OmpA蛋白的主要理化性質(zhì)。OmpA蛋白生化指標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam，酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http://web.expasy.org/peptide_cutter/, 親水性預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http://web.expasy.org/protscale/，軟件Signal P4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽，軟件TMHMM Serverv.2.0預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，SOPMA服務(wù)器在線預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)采用Swiss-Model預(yù)測(cè)方法，B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)采用在線服務(wù)ABCpred與BepiPred方法，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)抗原表位預(yù)測(cè)通過CTLpred在線服務(wù)，輔助T細(xì)胞(Th)抗原表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/。

1.2.2OmpA重組表位疫苗的設(shè)計(jì)

將獲得的B/T細(xì)胞表位，通過拼接，每個(gè)表位之間以甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGGG)短肽連接。采用DNAStar Protean軟件，分析多表位的各種排列方式，以各表位相對(duì)獨(dú)立且具有較好抗原性參數(shù)的連接方式，作為多表位疫苗的氨基酸設(shè)計(jì)序列，再翻譯為核酸序列，最終獲得重組表位疫苗基因序列。

2結(jié)果與分析

2.1OmpA蛋白序列系統(tǒng)發(fā)生分析

通過MEGA軟件對(duì)NCBI已公布的OmpA蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果(圖1)顯示：同一菌屬的親緣關(guān)系更近；衣原體與其它細(xì)菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；福氏志賀菌與腸道細(xì)菌間親緣關(guān)系較其它菌屬更近，表明OmpA蛋白對(duì)不同種的腸道致病菌可能存在交叉免疫保護(hù)作用。

圖1 MEGA軟件構(gòu)建的OmpA氨基酸序列進(jìn)化樹

2.2OmpA蛋白生化指標(biāo)預(yù)測(cè)

將OmpA蛋白序列提交至網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/，結(jié)果顯示，總平均疏水性指數(shù) (Grand average of hydropathicity, GRAVY) 為-0.318，表明OmpA蛋白為親水性蛋白。OmpA分子量為37.283 ku，等電點(diǎn)為5.65，脂溶性指數(shù)(Aliphatic index)為78.53。利用在線網(wǎng)站: http://www.expasy.org/protscale/預(yù)測(cè)OmpA的氨基酸中疏水性最強(qiáng)的分值為2.8，最弱為-2.56(圖2)。將OmpA氨基酸序列提交至網(wǎng)站：http://web.expasy.org/peptide_cutter/分析其酶切位點(diǎn)，結(jié)果顯示OmpA蛋白存在多個(gè)酶切位點(diǎn)，其中蛋白酶 K(Proteinase K)有171個(gè)，嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)97個(gè)，胃蛋白酶(Pepsin)(pH值>2)92個(gè)，低特異性糜蛋白酶(Chymotrypsin-low specificity)60個(gè)。

圖2 福氏志賀菌OmpA蛋白疏水性分析

2.3OmpA蛋白信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將OmpA氨基酸序列利用軟件Signalp 4.1分析，結(jié)果顯示OmpA蛋白在1～21位氨基酸可能為信號(hào)肽序列(圖3)。根據(jù)在線服務(wù)軟件 TMHMM Serverv.2.0程序預(yù)測(cè)顯示，OmpA蛋白在1～22位氨基酸可能為跨膜結(jié)構(gòu)，但可信度僅有0.45(圖4)；而且1～21位氨基酸預(yù)測(cè)為信號(hào)肽，蛋白成熟時(shí)該多肽被切除。可見，OmpA蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，位于細(xì)菌的膜外。

圖3 福氏志賀菌OmpA蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.4OmpA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA方法預(yù)測(cè)OmpA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示無規(guī)則卷曲氨基酸數(shù)占總氨基酸數(shù)的41.09 %，α-螺旋為26.44 %，β-轉(zhuǎn)角為10.06 %，β-片層為22.41 %(圖5)。采用SWISS-MODEL程序，預(yù)測(cè)OmpA蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，模版蛋白選用2k0l.1.A，序列相似度為82.86 %，結(jié)果顯示OmpA為桶狀結(jié)構(gòu)，如圖6所示。

圖4 福氏志賀菌OmpA蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

圖5 福氏志賀菌OmpA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

h：α-螺旋；t：β-轉(zhuǎn)角；c：無規(guī)則卷曲；e：β-片層

圖6 福氏志賀菌OmpA蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5OmpA蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

采用ABCpred軟件，通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法，預(yù)測(cè)線性表位，獲得OmpA可能的B細(xì)胞表位區(qū)段，見表1所示。通過BepiPred 1.0 Server軟件預(yù)測(cè)OmpA優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，該方法依據(jù)氨基酸的性質(zhì)(可及性、親水性、柔韌性、極性、轉(zhuǎn)角) 和隱形馬爾可夫模型，結(jié)果如表2所示。綜合BepiPred和ABCpred兩種方案的共同多肽序列，獲得OmpA可能的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位區(qū)段為：37～50，83～92，292～300。

2.6OmpA蛋白的T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.6.1OmpA蛋白的CTL表位預(yù)測(cè) CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)表位預(yù)測(cè)采用nHLAPred軟件，該方法運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法(ANN+QM)，分別預(yù)測(cè)HLA-A2、HLA-A＊0201、HLA-A＊0202、HLA-A＊0203、HLA-A＊0205的分子結(jié)合肽，閾值設(shè)為0.5，結(jié)果如表3所示。綜合分析獲得OmpA的CTL抗原表位為：239～247位的ALDQLYSQL。

表1 ABCpred方案預(yù)測(cè)福氏志賀菌OmpA蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

表3 福氏志賀菌OmpA蛋白CTL抗原表位預(yù)測(cè)

2.6.2OmpA蛋白的Th表位預(yù)測(cè)Th(T輔助細(xì)胞)使用ProPred在線程序，對(duì)表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)類型選擇DRB1-0101、DRB1-0102和DRB1-0301結(jié)合肽，結(jié)果見表4所示。綜合分析獲得OmpA的優(yōu)勢(shì)Th抗原表位為：286～294位的YLISKGIPA。

2.7OmpA蛋白重組抗原表位的設(shè)計(jì)

依據(jù)OmpA蛋白的B、T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)獲得的5個(gè)表位結(jié)果，將這5個(gè)表位以GGGG氨基酸接頭連接。采用DNAStar Protean軟件，分析線性表位的各種排列方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：epitope3- epitope5- epitope1- epitope4- epitope2排列的重組多表位間相對(duì)獨(dú)立，抗原性參數(shù)較好(圖7)。設(shè)計(jì)的表位疫苗多肽序列為：IPADKISARGGGGYLISKGIPAGGGGSQYHDTGFIPNNGP

GGGGALDQLYSQLGGGGPYKGDNINGA(下劃線為柔性肽序列)。翻譯為核酸序列，即獲得的OmpA蛋白重組表位為：ATCCCGGCAGACAAGATCTCCGCACGTGGTGG

CGGTGGCTACCTGATCTCCAAAGGTATCCCGGCAGGTG

GCGGTGGCTCCCAGTACCATGACACTGGTTTTATTCCT

AACAATGGTCCGGGTGGCGGTGGCGCTCTGGATCAGC

TGTACAGCCAGCTGGGTGGCGGTGGCCCGTACAAAGG

CGACAACATCAACGGCGCA(下劃線為柔性肽的核酸序列)。

表4 福氏志賀菌OmpA蛋白Th抗原表位預(yù)測(cè)

圖7 重組多表位分子的抗原性分析

Fig 7 Antigenic analysis of recombinant multi-epitopes molecule

3討論

通過生物信息學(xué)分析，可很好地預(yù)測(cè)物種間的親緣關(guān)系、蛋白的理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)；尤其是蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)，可減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，實(shí)現(xiàn)人工針對(duì)性地合成多肽表位疫苗，在疫苗研制和免疫診斷上應(yīng)用廣泛[11，12]。

本研究通過計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)，對(duì)OmpA氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果顯示福氏志賀菌與腸道細(xì)菌親緣關(guān)系更近，表明OmpA蛋白對(duì)不同種的腸道致病菌可能存在交叉免疫保護(hù)作用，這為研制廣譜抑菌的OmpA免疫制劑提供依據(jù)。此外，對(duì)福氏志賀菌OmpA蛋白進(jìn)行理化指標(biāo)與高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpA為親水性蛋白，具有信號(hào)肽序列。因而，OmpA可能是通過信號(hào)肽指導(dǎo)作用分泌到細(xì)胞外，OmpA是一種分泌性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示OmpA主要形成無規(guī)則卷曲。無規(guī)則卷曲易于產(chǎn)生盤旋、扭曲，暴露于蛋白外層，常含有優(yōu)勢(shì)的抗原表位[13]，使得OmpA具有較強(qiáng)的免疫激活作用。OmpA三級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)桶裝，這與大腸桿菌OmpA結(jié)構(gòu)相似[5]，可能與物質(zhì)的選擇性通過有關(guān)。

B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)常用的代表方案為BepiPred和ABCpred。BepiPred是利用氨基酸的性質(zhì)，如親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角等，以及隱形馬爾可夫模型預(yù)測(cè)線性表位[14]；ABCpred基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，準(zhǔn)確率可高達(dá)65.9%[15]。本研究結(jié)合BepiPred和ABCpred兩種軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)OmpA的B細(xì)胞抗原表位區(qū)段為：37～50，83～92，292～300。

CTL抗原表位是與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，經(jīng)抗原呈遞作用，最終誘發(fā)CTL免疫應(yīng)答的短肽，對(duì)CTL特異性細(xì)胞毒作用具有決定性[16-18]。CTL表位預(yù)測(cè)的方法較多，有人利用軟件BIMAS、SYFPEITHI和RANKPEP對(duì)CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)[12, 19]。王光祥等利用在線軟件，采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法成功預(yù)測(cè)羊口瘡病毒F1L蛋白CTL表位[16]。然而，關(guān)于福氏志賀菌OmpA的CTL表位預(yù)測(cè)尚未開展。本研究利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法與量化矩陣法，進(jìn)行OmpA蛋白的CTL表位預(yù)測(cè)。獲得OmpA的CTL表位為：239～247位的ALDQLYSQL。

Th表位是與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的抗原表位，經(jīng)過抗原呈遞作用，最終可被相應(yīng)的CD4+T細(xì)胞識(shí)別結(jié)合，激活Th細(xì)胞活性，以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[20]。Th表位預(yù)測(cè)方法較為成熟，病毒蛋白[16]、細(xì)菌蛋白[18]均實(shí)現(xiàn)很好的Th表位預(yù)測(cè)。本研究預(yù)測(cè)獲得了OmpA蛋白的Th表位為286～294位的YLISKGIPA。

多肽疫苗接頭的選擇上，要求構(gòu)建的蛋白多肽具有一定的分子剛性，各表位間相對(duì)獨(dú)立，并且抗原參數(shù)要趨于完美[21]。常用的接頭氨基酸序列有GGGG[22]、GGGGS[23]、KK[24]、AAY[21]等。本研究采用GGGG氨基酸接頭對(duì)OmpA預(yù)測(cè)獲得的B細(xì)胞、CTL細(xì)胞，以及Th細(xì)胞表位進(jìn)行不同組合的串聯(lián)，最終獲得抗原性較好的重組多肽。然而，新合成的重組多肽需要進(jìn)一步的試驗(yàn)，驗(yàn)證其免疫學(xué)功能。

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Bioinformatics analysis of Shigella flexneri 2a outer membrane protein A and molecular designing of recombinant epitope vaccine

LIU Xiang

(College of Biological Sciences and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China)

AbstractShigella flexneri outer membrane protein A (OmpA) has good immunogenicity for application prospect in vaccine development. In this paper, phylogenetic analysis found that Shigella flexneri and enteric bacterium relationship was higher than others by MEGA. By online software, the prediction results showed that OmpA protein is a hydrophilic and secreted protein, exists multiple restriction enzyme sites. Using TMHMM Server v.2.0 software predicted that OmpA has not transmembrane structure and locats outside cell membrane. OmpA secondary structure contains random coil helix 41.09 %, alpha helix 26.44 %, beta turn 10.06 %, extended strand 22.41 % by SOPMA method, respectively. Using the SignalP 4.1 software analysis showed that the 1-21 amino acids of OmpA are signal peptide sequence. The 3D structure prediction found that OmpA protein is barrel structure by Swiss-Model program. Using ABCpred and BepiPred prediction program, OmpA has 3 B cell epitopes. By the prediction method of quantitative matrix and artificinal neural network, OmpA protein has 1 CTL epitopes. OmpA protein has 1 Th epitopes using an online server prediction for MHC class Ⅱ peptide binding affinity. OmpA recombinant epitope peptide is designed with better immunogenicity. This paper would lay a foundation for the study of OmpA multiepitope tandem vaccine.

Key wordsShigella flexneri; OmpA protein; cell epitopes; protein structure

收稿日期：2015-07-29；修回日期：2015-08-10

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)(2016NY-088)

作者簡介：劉 祥，博士，講師，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：liuxiang888525@163.com。

中圖分類號(hào)Q816

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0099-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.099