施榮　王倩　韓丹　熊旭東（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上?！?01203）

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炎調(diào)方抑制LPS誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子釋放機(jī)制研究*

施榮王倩△韓丹熊旭東
（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201203）

【摘要】目的體外觀察炎調(diào)方通過NF-κB信號通路調(diào)控內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的人肺泡上皮（A549）細(xì)胞中炎癥因子的釋放。方法采用炎調(diào)方藥物血清方法，觀察其對A549細(xì)胞的作用效果及其機(jī)制。MTT法觀察細(xì)胞存活率；雙抗體夾心酶聯(lián)合免疫吸附法（ELISA法）檢測細(xì)胞中白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的表達(dá)；Western blot法檢測環(huán)加氧酶2（COX2）和NF-κB的表達(dá)；運(yùn)用NF-κB特異性抑制劑與炎調(diào)方聯(lián)合運(yùn)用，觀察NF-κB信號通路對COX2的調(diào)控作用。結(jié)果LPS明顯抑制了A549細(xì)胞增殖，炎調(diào)方藥物血清（炎調(diào)方藥物血清）能緩解LPS的細(xì)胞毒性；炎調(diào)方藥物血清明顯降低了LPS誘導(dǎo)的IL-8、PGE2和COX2釋放和表達(dá)。炎調(diào)方藥物血清通過NF-κB信號通路調(diào)控COX2表達(dá)。結(jié)論炎調(diào)方通過NF-κB信號通路調(diào)控LPS的細(xì)胞毒性和炎癥因子釋放。

【關(guān)鍵詞】炎調(diào)方人肺泡上皮炎癥因子NF-κB信號通路

膿毒癥（Sepsis）是具有感染依據(jù)的全身炎癥反應(yīng)綜合征。嚴(yán)重膿毒癥導(dǎo)致的多器官功能障礙是重癥醫(yī)學(xué)面臨的重要臨床難題，病死率可高達(dá)80%［1］。膿毒癥早期便可導(dǎo)致急性肺損傷（ALI），肺泡上皮細(xì)胞在多種炎癥因子的作用下，可發(fā)生彌漫性損害，影響氣體交換，最終進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。我們早期動物實驗結(jié)果顯示，炎調(diào)方能調(diào)控膿毒癥大鼠血清中炎癥因子釋放，保護(hù)肺組織［2-3］。本實驗采用內(nèi)毒素（LPS）干預(yù)人肺泡上皮細(xì)胞A549，造成急性肺損傷細(xì)胞模型，觀察炎調(diào)方藥物血清對A549的保護(hù)作用，并從NF-κB信號通路探討其機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1試藥與儀器1）炎調(diào)方由桃仁、生大黃、芒硝、玄參、赤芍、當(dāng)歸等組成，均符合2005版《中國藥典》規(guī)定并加工炮制合格的飲片，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供。煎煮方法：加10倍體積蒸餾水將飲片浸泡30 min，先煮桃仁、玄參、赤芍、當(dāng)歸，沸騰后繼續(xù)煎煮20 min，起鍋前10 min加入大黃，第2煎加6倍體積的蒸餾水煎煮，沸騰后繼續(xù)煎煮20 min。2次煎液混合，用4層無菌紗布過濾，芒硝最后納入藥液中充分溶解，藥液最后濃縮成含生藥1.0 g/mL。2）DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司）；噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；LPS和PDTC（美國Sigma公司）；抗體COX2（sc-23984，goat polyclonal，1∶800）和NF-κB p65（sc-372，rabbit polyclonal，1∶200）（美國Santa Cruz公司）；抗體GAPDH（kc-5G4，mouse polyclonal，1∶10000）（中國康成公司）；抗體human toll-like receptor 4（TLR4）antibodies（14-9917-80，mouse monoclonal，25 μg）（美國eBioscience公司）；白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的ELISA試劑盒（美國R&D公司）。3）CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；Healforce生物安全柜（香港力康發(fā)展有限公司）；OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；臺式離心機(jī)（日本KUBOTA公司）；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國Li-cor公司）；Syergy2酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Biotek公司）。1.2實驗動物SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量200 g，購自中國科學(xué)院，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。

1.3藥物血清的制備將SD大鼠隨機(jī)分為炎調(diào)方組和陰性對照組，每組8只。實驗前禁食12 h，炎調(diào)方組以9.9 g/kg水煎液劑量灌胃，陰性對照組灌等體積的0.9%氯化鈉注射液。連續(xù)給藥3 d，每日分早、晚兩次給藥，于第4日第1次灌胃1 h后（灌藥前禁食不禁水12 h）采血。無菌條件下腹總動脈采血，靜置2 h，4000 r/min，離心10 min，分離血清（藥物血清）。同種條件血清混勻，于56℃水浴30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前，將各組藥物血清分別加入DMEM培養(yǎng)液，配制成濃度為5%、10%、20%含藥物血清培養(yǎng)液。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)人肺泡上皮細(xì)胞A549和人巨噬細(xì)胞THP-1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。A549和THP-1細(xì)胞種植在DMEM完全培養(yǎng)基（含10%FBS、0.01 mg/mL Insulin，100 U/mL、青鏈霉素混合液，20 mmol/L HEPES）中，細(xì)胞在37℃、5%CO2環(huán)境中單層生長，實驗時取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.5細(xì)胞增殖檢測取1×105個/mL A549細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)至第2日細(xì)胞貼壁后，LPS 1、10、100 μg/mL分別干預(yù)A549細(xì)胞6、12、24 h；血清用10%、20%、30%炎調(diào)方藥物血清作為處理組劑量，相應(yīng)濃度的無藥物血清作為陰性對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，孵育細(xì)胞12 h。將MTT用無血清DMEM培養(yǎng)液配成0.5 mg/mL溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），每孔加20 μL，37℃溫育4 h，小心吸出孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO，用全自動酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔OD值。用下列公式計算藥物血清對細(xì)胞生長的抑制率，并繪制效應(yīng)曲線，同樣的實驗重復(fù)3次。細(xì)胞生存率（%）=（OD藥物-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%

1.6Western blot實驗裂解組織提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測COX2、NF-κB及GAPDH蛋白的表達(dá)。常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別將膜稀釋好的一抗（1∶1000，5%脫脂奶粉稀釋）封入雜交袋內(nèi)，4℃搖蕩過夜。然后，分別將膜稀釋好的熒光二抗（1∶10000稀釋）封入雜交袋內(nèi)，避光室溫?fù)u蕩1 h。Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)讀膜。

1.7ELISA實驗嚴(yán)格按試劑盒要求操作，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細(xì)胞中白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的釋放量，ELISA試劑盒為R&D公司原裝產(chǎn)品，由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供。

2　結(jié)果

2.1LPS對肺泡上皮細(xì)胞A549存活率的影響見表1。為了觀察LPS對A549細(xì)胞的毒性，分別應(yīng)用LPS1、10和100 μg/mL處理細(xì)胞6、12和24 h。MTT法觀察細(xì)胞存活率，實驗結(jié)果顯示LPS質(zhì)量為10 μg/mL 和100 μg/mL呈時間-劑量依賴性抑制了A549細(xì)胞增殖，與未處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中10 μg/mL LPS干預(yù)A549細(xì)胞6、12和24 h，其細(xì)胞存活率分別為80%、61%與22%。LPS 10 μg/mL干預(yù)A549細(xì)胞12 h用于進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1　不同濃度LPS在不同時間點對A549細(xì)胞存活率的影響（±s）

表1　不同濃度LPS在不同時間點對A549細(xì)胞存活率的影響（±s）

與對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　24 h LPS 100 μg/mL組　9.88±2.67△未處理細(xì)胞對照組LPS 1 μg/mL組　92.74±4.69△LPS 10μg/mL組　22.29±3.99△6 h　12 h 67.23±4.26 30.18±1.57△100±3.18 99.97±2.75 96.12±4.01△80.13±7.01 60.85±2.61△

2.2炎調(diào)方藥物血清對肺泡上皮細(xì)胞A549存活率的影響見表2。MTT法檢測不同濃度炎調(diào)方藥物血清干預(yù)A549細(xì)胞12 h的存活率，同時以正常大鼠血清作對照。實驗結(jié)果顯示，炎調(diào)方藥物血清10%、20%與30%均未表現(xiàn)任何細(xì)胞毒性。因此炎調(diào)方藥物血清10%、20%與30%用于改善LPS 10 μg/mL致細(xì)胞增殖抑制實驗。與單獨運(yùn)用LPS 10 μg/mL相比，炎調(diào)方藥物血清10%、20%與30%分別將細(xì)胞存活率提高了20.6%、25.9%與28.9%（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明，炎調(diào)方能改善LPS導(dǎo)致的A549細(xì)胞損傷。

2.3炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞釋放IL-8和PGE2的影響見表3。為了觀察炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)的IL-8和PGE2釋放量的影響，將LPS分別與炎調(diào)方藥物血清10%、20%及30%聯(lián)合運(yùn)用。采用ELISA方法檢測IL-8和PGE2的表達(dá)水平。單獨運(yùn)用LPS 10 μg/mL明顯增加了A549細(xì)胞中IL-8和PGE2的含量。而炎調(diào)方藥物血清20%和30%分別致LPS誘導(dǎo)的IL-8含量降低了約31%和50%；PGE2的含量分別降低了34%和48%（P＜0.05）。其中細(xì)胞表面的LPS受體TLR4作為陽性對照。LPS誘導(dǎo)的IL-8和PGE2均被TLR4抑制。

表2　炎調(diào)方藥物血清對LPS致A549細(xì)胞損傷的改善作用（%，±s）

表2　炎調(diào)方藥物血清對LPS致A549細(xì)胞損傷的改善作用（%，±s）

與LPS比較，*P＜0.05。下同。

組別　n正常對照組LPS 10 μg/mL組10%炎調(diào)方藥物血清組存活率100.00±4.83 59.30±3.67 95.24±1.39 20%炎調(diào)方藥物血清組　94.21±3.88 30%炎調(diào)方藥物血清組　97.40±1.28 LPS+10%炎調(diào)方藥物血清組　79.93±4.24*LPS+20%炎調(diào)方藥物血清組　85.22±2.23*LPS+30%炎調(diào)方藥物血清組　88.25±3.41*

表3　炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)IL-8和PGE2釋放的緩解作用（pg/mL，±s）

表3　炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)IL-8和PGE2釋放的緩解作用（pg/mL，±s）

組別　n正常對照組LPS 10 μg/mL組10%炎調(diào)方藥物血清組20%炎調(diào)方藥物血清組30%炎調(diào)方藥物血清組LPS+Anti-TLR4組IL-8　PGE226.67±5.01　23.50±3.39 712.50±56.90　60.83±5.34 650.17±53.86　54.83±4.26 494.67±31.15*　40.17±3.31*355.33±49.96*　31.50±4.51*301±35.97*　28.17±4.62*

2.4炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞中COX2表達(dá)量的影響為了觀察炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)COX2表達(dá)量的影響，將LPS分別與炎調(diào)方藥物血清10%、20%及30%聯(lián)合運(yùn)用。采用Western blot方法檢測COX2的表達(dá)水平。實驗結(jié)果如圖1所示，與未處理的細(xì)胞對照組比較，LPS顯著誘導(dǎo)了COX2高表達(dá)。而當(dāng)LPS分別與炎調(diào)方藥物血清10%、20%及30%聯(lián)合運(yùn)用時，COX2的高表達(dá)量呈劑量依賴性被抑制。為了觀察炎調(diào)方藥物血清對COX2的作用是否特異性地針對A549細(xì)胞，筆者運(yùn)用LPS干預(yù)人巨噬細(xì)胞THP-1，發(fā)現(xiàn)炎調(diào)方藥物血清同樣降低了LPS誘導(dǎo)的COX2高表達(dá)，但其作用不及A549細(xì)胞中明顯。

圖1　炎調(diào)方藥物血清對LPS誘導(dǎo)COX2高表達(dá)的抑制作用

2.5炎調(diào)方藥物血清通過NF-κB信號通路抑制COX2表達(dá)實驗結(jié)果如圖2A所示，LPS誘導(dǎo)了A549細(xì)胞中NF-κB（p65）的表達(dá)，炎調(diào)方藥物血清20%和30%明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB（p65）的高表達(dá)。而在THP-1細(xì)胞中炎調(diào)方藥物血清調(diào)控NF-κB（p65）的作用不明顯。為了進(jìn)一步證實炎調(diào)方藥物血清對COX2的抑制作用主要通過NF-κB信號通路，筆者運(yùn)用了NF-κB特異性抑制劑PDTC。結(jié)果顯示，PDTC逆轉(zhuǎn)了炎調(diào)方藥物血清對高表達(dá)量COX2的抑制作用（圖2B）。因此筆者推斷，炎調(diào)方藥物血清通過NF-κB信號通路抑制COX2表達(dá)。

圖2　炎調(diào)方藥物血清通過NF-κB信號通路調(diào)控COX2表達(dá)

3　討論

嚴(yán)重膿毒癥可誘發(fā)多臟器功能障礙綜合征（MODS）。肺是最易受損的器官，其發(fā)生率約為40%［4］，病死率約為30%～50%［5］。失控的炎癥反應(yīng)或毒素可激活多種炎性細(xì)胞在肺組織聚集、活化，造成肺泡上皮細(xì)胞彌漫性損傷，肺泡表面活性物質(zhì)減少，以肺容積減少、順應(yīng)性降低、嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)為病理特征，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥。

肺泡上皮細(xì)胞可分為Ⅰ型和Ⅱ型，是覆蓋于肺泡表面的一層上皮細(xì)胞。肺泡上皮細(xì)胞通過合成和分泌表面活性物質(zhì)，維持肺泡的穩(wěn)定性、保持肺泡表面水電解質(zhì)平衡等，起到維持肺組織正常的氣體交換功能。感染導(dǎo)致LPS的大量和持續(xù)釋放是導(dǎo)致ALI發(fā)生、發(fā)展的主要因素之一。LPS可直接刺激肺泡上皮，產(chǎn)生多種氣道趨化性細(xì)胞因子。IL-8是多形核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞激活趨化因子。IL-8的釋放可趨化中性粒細(xì)胞（PMN）在肺聚集，促進(jìn)PMN的趨化、變形、脫顆粒、釋放溶酶體酶等參與炎癥反應(yīng)；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2 （MIP-2）在PMN向肺泡內(nèi)募集機(jī)制中起重要作用，其

最主要的趨化性細(xì)胞因子也是IL-8［6］。LPS導(dǎo)致的ALI過程中，IL-8濃度呈持續(xù)升高，肺泡灌洗液中IL-8含量在PMN聚集之前即增高。COX2是花生四烯酸合成前列腺素的重要限速酶，花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物在急性肺損傷中作用復(fù)雜［8］。COX-2主要分布在肺巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞，生理狀態(tài)下，肺組織內(nèi)COX-2僅有少量表達(dá)，ALI肺組織COX-2表達(dá)明顯增高，COX-2濃度與肺損傷程度呈明顯正相關(guān)。PGE2是一種常見的前列腺素，具有廣泛的生理和病理功能，是炎癥、疼痛、發(fā)熱反應(yīng)中的重要介質(zhì)［7］。多種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)COX-2表達(dá)及PGE2合成，參與肺損傷。NF-κB通過參與多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，而對這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生復(fù)雜的影響。激活的NF-κB可增強(qiáng)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，使炎癥細(xì)胞合成炎癥因子的時間和數(shù)量得以增高［9］。因此，NF-κB是核內(nèi)炎性遞質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)。本研究結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549中IL-8、PGE2和COX2的釋放，炎調(diào)方藥物血清可降低LPS誘導(dǎo)的IL-8 和PGE2釋放量以及COX2的表達(dá)，緩解炎癥趨化因子和炎癥介質(zhì)的釋放可能是炎調(diào)方藥物血清抗炎的作用機(jī)制之一。炎調(diào)方藥物血清可抑制LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞的NF-κB活性，炎調(diào)方藥物血清可能通過此途徑減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎癥介質(zhì)對肺的損傷。

膿毒癥在中醫(yī)學(xué)理論體系中并無相應(yīng)的病名，屬于中醫(yī)學(xué)“溫?zé)岵　狈懂牐?0］。膿毒癥早期主要以身灼熱、煩渴、腹脹便秘為主癥，甚或出現(xiàn)斑疹隱隱、神昏譫語，舌絳少津，苔黃，脈數(shù)等癥。自擬炎調(diào)方由桃仁、生大黃、芒硝、玄參、赤芍、當(dāng)歸等組成，具有通腑活血、涼營解毒之功。全方切中膿毒癥腑實、營熱、血瘀之根本病機(jī)。前期臨床研究證實，炎調(diào)方通腑活血、涼營解毒，對膿毒癥有良好療效［11］。動物實驗中，炎調(diào)方能通過NF-κB通路，調(diào)控膿毒癥大鼠血清中炎癥因子IL-6和IL-10的釋放［2-3］，保護(hù)肺組織。本研究采用體外藥物血清方法，進(jìn)一步研究炎調(diào)方的作用機(jī)制，為其藥理研究提供一定的實驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］Galley HF.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis［J］.Br J Anaesth，2011，107（1）：57-64.

［2］施榮，熊旭東.NF-κB在膿毒癥大鼠肺組織中的活性變化及炎調(diào)方對其活性的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25（4）：1016-1018.

［3］施榮，熊旭東，李淑芳，等.炎調(diào)方對膿毒癥大鼠血清炎癥因子的調(diào)控作用［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21（3）：397-398.

［4］Rubenfeld GD，Caldwell E，Peabody E，et al.Incidence and outcomes of acute lung injury［J］.N Engl J Med，2005，353 （16）：1685-1693.

［5］Beasley MB.The pathologist's approach to acute lung injury［J］.Arch Pathol Lab Med，2010，134（5）：719-727.

［6］林棟棟，孫家邦，李非，等.IL-8、IL-10在大鼠急性胰腺炎并發(fā)肺損傷中的作用［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，26 （2）：193-196.

［7］顧言，陳建榮，邵峰，等.清肺湯對急性呼吸窘迫綜合征患者呼出氣冷凝液和血清中內(nèi)皮素-1、前列腺素E2的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，43（23）：3853-3855.

［8］Malek HA，Saleh DM.Cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib in a rat model of hindlimb ischemia reperfusion［J］.Can J Physiol Pharmacol，2009，87（5）：353-359.

［9］Schmidt C，Kurt B，Hocherl K，et al.Inhibition of NF-kappaB activity prevents downregulation of alpha1-adrenergic receptors and circulatory failure during CLP-induced sepsis［J］.Shock，2009，32（3）：239-246.

［10］張云松，朱曉林.膿毒癥中醫(yī)病機(jī)及治法探討［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2012，46（10）：8-9.

［11］施榮，熊旭東.通腑清營法治療膿毒癥熱毒內(nèi)盛證臨床觀察［J］.中國中醫(yī)急癥，2011，20（4）：521-522.

·研究報告·

·研究報告·

Mechanism of Yantiaofang inhibiting LPS induced inflammatory cytokines release in human alveolar epithelial cells

SHI Rong，WANG Qian，HAN Dan，et al.Shuguang Hospital Affiliated with University of T.C.M，Shanghai 201203，China

【Abstract】Objective：To observe the release of inflammatory cytokines in the LPS induced human alveolar epithelial（A549）cells through NF-κB signaling pathway in vitro.Methods：The effect and mechanism of A549 cells were observed by the method of drug serum with Yantiaofang.Cell survivals were observed by MTT assay.The levels of IL-8 and PGE2 were detected by ELISA assay.The expressions of COX2 and NF-κB were detected by Western blot analysis.The regulatory effect of NF-κB signaling pathway on COX2 was observed by using the combination of the specific inhibitor of NF-κB and Yantiaofang.Results：LPS significantly inhibited the proliferation of A549 cells.Moreover，the cytotoxicity of LPS can alleviate by the drug serum with Yantiaofang（YTF）.YTF significantly reduced the release of IL-8，PGE2and COX2 release induced by LPS.The expression of COX2 was regulated by YTF through NF-κB signaling pathway.Conclusion：Yantiaofang regulates LPS induced cytotoxicity and inflammatory cytokine release by NF-κB signaling pathway.

【Key words】Yangtiaofang；Alveolar epithelial cell；Inflammatory factors

中圖分類號：R631

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0572-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.003

*基金項目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目（15ZR1442000）

通信作者△（電子郵箱：doctorshi@126.com）

收稿日期（2015-11-20）