韓　旭，高久春，張　歡，萬　鑫，李兆東，高元奇，費　瑞

(吉林大學基礎醫(yī)學院，吉林 長春 130021)

大腹園蛛的細胞及遺傳生殖毒性研究

韓旭，高久春，張歡，萬鑫，李兆東，高元奇，費瑞

(吉林大學基礎醫(yī)學院，吉林 長春 130021)

[摘要]利用小鼠成纖維細胞(L929)研究了大腹園蛛(Araneus ventricosus)的體外細胞毒性；選用健康昆明小鼠，采用灌胃染毒方式進行了精子畸形和骨髓嗜多染紅細胞微核實驗，研究了大腹園蛛的遺傳及生殖毒性.結(jié)果表明：大腹園蛛對L929細胞的增殖無影響(P>0.05)；小鼠嗜多染紅細胞微核數(shù)量和精子畸變數(shù)量與空白對照組相比無明顯差異(P>0.05)；大腹園蛛焙干粉無細胞毒性，不能影響小鼠的生殖和遺傳.

[關鍵詞]大腹園蛛；L929細胞；精子畸形；骨髓嗜多染微核

蜘蛛屬于節(jié)肢動物門蛛形綱蜘蛛目，除南極洲外全球都有分布.目前，全世界的蜘蛛共有4萬多種，而我國有3 000多種，其中一些種類帶有劇毒.我國人民對蜘蛛的認識始于《詩經(jīng)》，而以蜘蛛作為藥物早在公元741年的《本草拾遺》中就有記載[1].蜘蛛全身都是寶，且藥用價值極高.

大腹園蛛(Araneus ventricosus)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、蛛形綱(Arachnida)、蜘蛛目(Araneae)、園蛛科(Araneidae)、園蛛屬(Araneus)，是最常見的蜘蛛之一.目前，大腹園蛛在醫(yī)療、保健、食品上都有廣泛應用.在飲食保健方面，國外有園蛛醬、園蛛口服液，而中國有園蛛羮[1].在醫(yī)學方面，大腹園蛛同樣具有很高的藥用價值.據(jù)相關資料記載，園蛛成體焙干后可用于治療背瘡、痔瘡、陽痿、中風偏癱、小兒驚風、腎陽虧虛、口噤、疔腫、毒蟲咬傷等[2-5].近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，有關蜘蛛毒素的研究也逐漸深入，但有關蜘蛛成體的研究在國內(nèi)外并不常見，其中有關園蛛成體毒性的研究更未見報道.因此，本文利用小鼠成纖維細胞(L929)研究了大腹園蛛(Araneus ventricosus)的體外細胞毒性，通過嗜多染微核實驗和精子畸形實驗研究了大腹園蛛體內(nèi)的細胞毒性.研究結(jié)果可為大腹園蛛的進一步開發(fā)利用奠定理論和實驗基礎.

1材料與方法

1.1實驗動物

大腹園蛛采自吉林省吉林市馮家屯，使用時用烘箱焙干并制成干粉，濾去殘渣.昆明種純系小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：吉實動質(zhì)(2000)042號.實驗前在室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)2 d.

1.2藥品與試劑

環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，DMSO)購于吉林大藥房；標準胎牛血清購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；胰酶購自Hyclone公司.其他所用試劑均為分析純.

2實驗方法

2.1細胞毒性實驗

取對數(shù)生長期的L929細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶(25 cm2)，待細胞生長至培養(yǎng)瓶底面的70%～80%后，消化、離心，并接種于 96 孔板，置37℃，含5% CO2的恒溫孵箱培養(yǎng).實驗分5組，即：空白對照組、陽性對照組和3種不同質(zhì)量濃度的大腹園蛛處理組.24 h后取出培養(yǎng)板，分別加入10 μL藥物，其中空白對照組加入PBS，陽性對照組加入5%的DMSO，3種不同質(zhì)量濃度的大腹園蛛處理組分別加入10，20和40 mg/mL的大腹園蛛焙干粉末(AP).將對照組和處理組于37℃，含5% CO2的恒溫孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后取出，每孔加入10 μL CCK8，在37℃，含5% CO2的恒溫孵育箱孵育2 h.最后，用酶標儀在450 nm 波長處測各孔D(450)值[6].

2.2小鼠嗜多染紅細胞的微核實驗

選取小鼠50只，隨機分5組，即空白對照組(蒸餾水)；陽性對照組(60 mg/kg環(huán)磷酰胺)；2.5，5，10 g/kg的大腹園蛛焙干粉末處理組，每組10只.小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃劑量為0.02 mL/g，連續(xù)4 d.第5天處死小鼠，取出胸骨，剃凈肌肉，除盡血污，橫向剪斷胸骨，暴露骨髓腔并擠出骨髓.加一滴小牛血清并均勻涂在載玻片上，于室溫晾干后放入甲醇固定15 min，取出自然晾干，用Geimsa染色15 min后鏡檢.每張片計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞，計算出含有微核的嗜多染紅細胞微核率[7].

嗜多染紅細胞微核率=含微核的嗜多染紅細胞數(shù)/嗜多染紅細胞總數(shù)×100%.

2.3小鼠精子畸形實驗

選用健康雄性小鼠50只，體重18～22 g，6～8周齡.隨機分5組，即：空白對照組(蒸餾水)，陽性對照組(40 mg/kg環(huán)磷酰胺)，2.5，5.0，10 g/kg的大腹園蛛焙干粉末處理組，每組10只.小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃劑量為0.02 mL/g，連續(xù)5 d.第35天脫頸處死小鼠，取兩側(cè)副睪剪碎、涂片、染色.在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)完整的1 000個精子，并根據(jù)精子質(zhì)量標準，記錄畸形的精子數(shù)目，計算精子畸形率[9，11].

精子畸形率=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%.

3實驗結(jié)果

3.1大腹園蛛對細胞毒性的影響

大腹園蛛對細胞毒性影響的實驗結(jié)果如表1所示.陽性對照組(DMSO)細胞的相對增殖率為22%，而10，20和40 mg/mL的大腹園蛛焙干粉處理組的相對增殖率分別為99%，94%和135%，根據(jù)細胞毒性反應分級評價標準，陽性對照組為四級毒性，而3個大腹園蛛焙干粉處理組都屬于一級毒.

表1　大腹園蛛對L929細胞毒性的影響

3.2大腹園蛛對小鼠嗜多染紅細胞微核的影響

各實驗組小鼠在給藥期間，生長狀態(tài)均無異常.以2.5，5.0和10 g/kg的大腹園蛛焙干粉分別給小鼠灌胃后，小鼠嗜多染紅細胞(PEC)的微核率分別為0.25%，0.26%和0.23%.與空白對照(蒸餾水)組比較，差異不顯著(P>0.05)，而與陽性對照(環(huán)磷酰胺)組比較，差異極顯著(P<0.01)，表明大腹園蛛不能誘發(fā)小鼠PEC微核率的增加.具體實驗結(jié)果如表2所示.

表2　大腹園蛛對小鼠骨髓PEC微核的影響

注：與陽性對照組比較，*表示P<0.01.

3.3對小鼠精子畸形的影響

實驗結(jié)果如表3所顯示.以2.5，5.0和10 g/kg的大腹園蛛焙干粉(AP)分別給小鼠灌胃染毒后，小鼠的精子畸形率分別為2.4%，2.4%，2.7%，與空白對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而與陽性對照(環(huán)磷酰胺)組相比，具有極顯著差異(P<0.01).陽性對照(環(huán)磷酰胺)組與空白對照(蒸餾水)組比較，具有極顯著差異(P<0.01).表明大腹園蛛焙干粉對小鼠的生殖無致突變作用.

表3　大腹園蛛對小鼠精子畸形影響

注：與陽性對照組比較，*表示P<0.01；與空白對照組比較，#表示P<0.01.

4討論

近年來，不少國家開始注意昆蟲類藥物開發(fā).美國鹽湖城自然產(chǎn)品公司以蜘蛛為原料已經(jīng)開發(fā)出了很多種新藥，而以蜘蛛干品為原料的蜘蛛粉、蜘蛛羹目前也風靡全球，廣受人們喜愛.雖然大腹園蛛在中藥及飲食保健方面均有應用，但由于其本身是有毒類動物，其毒性大小及對人的毒性反應尚未有報道，這嚴重阻礙了對其的進一步開發(fā)利用.本文從細胞毒性、遺傳毒、生殖毒三個角度探究了大腹園蛛的毒性，為大腹園蛛的藥物開發(fā)應用提供了實驗證據(jù).

細胞毒性實驗是一類在離體狀態(tài)下，模擬體內(nèi)生存環(huán)境，檢測外來物質(zhì)接觸機體組織后的生物學反應實驗.通過體外細胞毒性實驗，可以檢測供試品接觸細胞后，細胞的形態(tài)和功能變化，細胞溶解、細胞生長及死亡等毒性反應[6].為評價大腹園蛛對細胞產(chǎn)生的毒性作用，本文選取了對數(shù)生長期的L929細胞作為靶細胞，采用國家GB/T14233.2—2005規(guī)定的方法進行了檢測，結(jié)果顯示，大腹園蛛毒性反應為一級，不具有細胞毒性成分.

小鼠骨髓嗜多染微核實驗是急性毒性常用的一種檢測方式，是檢測體外物質(zhì)對染色質(zhì)損傷的重要方法[7]，能快速、簡便地檢測染色體損傷.微核實驗因其靈敏、穩(wěn)定，且能檢測染色體完整性改變和分離改變，因而在毒理學研究上得到了廣泛應用[8].微核實驗的目的主要是通過檢測哺乳動物骨髓細胞中嗜多染紅細胞的微核出現(xiàn)率，間接反映骨髓細胞染色體畸變發(fā)生率的高低，從而判斷受試物是否具有致突變作用[8-10].本實驗結(jié)果證實，大腹園蛛的3個劑量組與空白對照組相比均無顯著差異(P >0.05)，表明大腹園蛛對小鼠骨髓細胞微核沒有影響，無致突變作用.

小鼠精子畸形實驗是檢測物質(zhì)是否具有遺傳毒性的重要方法.在正常情況下哺乳動物的精液中也可能含有畸形的精子，但在精原細胞后期和精母細胞早期，會對化學誘變劑較為敏感，在此期間給予有毒物可提高精子畸形的突變率，因此可以用檢查雄性動物接觸化學毒物后精子畸形率的高低變化，判斷該化學毒物的生殖毒性和對生殖細胞潛在的致突變性[11-12].本實驗的結(jié)果證實，大腹園蛛的3個劑量組與空白對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)，表明大腹園蛛對小鼠的精子無致畸作用.

本文的研究結(jié)果證明，大腹園蛛焙干粉末屬無毒物，不能影響小鼠的生殖和遺傳特征.本研究結(jié)果不僅為大腹園蛛今后的藥物開發(fā)研究提供了理論和實驗依據(jù)，而且也為其食品開發(fā)奠定了實驗基礎.

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(責任編輯：方林)

The studies of cell and genetic reproductive toxicity of Araneus ventricosus spider

HAN Xu，GAO Jiu-chun，ZHANG Huan，WAN Xin，LI Zhao-dong，GAO Yuan-qi，F(xiàn)EI Rui

(School of Basic Medical Science，Jilin University，Changchun 130021，China)

Abstract:L929 cell was used to study the cytotoxicity in vitro of the Araneus ventricosu spider.Healthy kunming mice were used to study genetic and reproductive toxicity of the spider by micronucleus of bone marrow and sperm abnormality in the way of intragastric gavage..Experimental results showed that Araneus ventricosus spiders had no effect on the proliferation of L929 cell(P>0.05).The micronucleus and the sperm abnormality rate of mice were not significantly different from blank control group(P>0.05).These results showed that the Araneus ventricosus spider is no cytotoxicity and no effect on the reproductive and genetic in mice.These results laid a foundation for the activity study of Araneus ventricosus spider.

Keywords:Araneus ventricosus；L929 cell；sperm abnormality；micronucleus of bone marrow

[文章編號]1000-1832(2016)02-0118-04

[收稿日期]2015-05-27

[基金項目]吉林省自然科學基金資助項目(201215058).

[作者簡介]韓旭(1988—)，男，碩士研究生；通訊作者：費瑞(1964—)，男，博士，教授，主要從事多糖及生物活性物質(zhì)功能研究.

[中圖分類號]R 996.3[學科代碼]350·20

[文獻標志碼]A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.02.025