馮海潮， 孫朝琴， 何　蕓， 吳　瓊， 張　然， 莫　非， 羅昭遜*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550004； 2.山東聊城人民醫(yī)院， 山東 聊城　252000)

頭花蓼對淋巴細(xì)胞分泌干擾素γ和白介素4的影響*

馮海潮1**， 孫朝琴1， 何蕓1， 吳瓊1， 張然2， 莫非1， 羅昭遜1***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004； 2.山東聊城人民醫(yī)院， 山東 聊城252000)

[摘要]目的： 研究苗藥頭花蓼對淋巴細(xì)胞分泌干擾素γ(IFN-γ)及白介素4(IL-4)的影響。方法： 制備C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，同刀豆蛋白A(ConA)及不同濃度的頭花蓼(終濃度分別為：1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 mg/L)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)72 h，細(xì)胞活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測頭花蓼對體外T淋巴細(xì)胞增殖的影響，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定細(xì)胞上清中的IFN-γ和IL-4含量，分析不同濃度的頭花蓼對ConA活化的脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ、IL-4的影響。結(jié)果： 頭花蓼濃度>128 mg/L時，明顯抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，抑制其分泌IFN-γ的水平，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；頭花蓼濃度為8～128 mg/L 時，ConA活化的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4的水平明顯高于空白對照，而T淋巴細(xì)胞的增殖無明顯變化；頭花蓼的濃度低于32 mg/L時，ConA活化的淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌水平隨頭花蓼濃度升高而增加。結(jié)論： 一定濃度的頭花蓼刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、IFN-γ和IL-4分泌，參與機(jī)體細(xì)胞免疫過程。

[關(guān)鍵詞]植物藥； 淋巴細(xì)胞； 頭花蓼； 干擾素γ； 白介素4

頭花蓼(polygonumcapitatum)為蓼科蓼屬植物頭花蓼的全草，為貴州精選苗藥。有“清熱利濕，活血解毒之功效”[1]，全草入藥，民間常用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[2]。目前關(guān)于頭花蓼的研究多局限于種植技術(shù)及成分分析，其藥理活性研究報(bào)道少見。已有研究報(bào)道，頭花蓼對淋病奈瑟菌、幽門螺桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有抗菌活性[3-4]，其有效成分黃酮和沒食子酸具有確切的免疫調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper cell，Th)占T細(xì)胞總數(shù)的65%，具有識別抗原，分泌多種細(xì)胞因子的效應(yīng)，從多方面引起和增強(qiáng)免疫能力。Th細(xì)胞分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞兩個細(xì)胞亞群，Th1細(xì)胞主要分泌干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素(interleukin-4，IL-4)、IL-10等細(xì)胞因子，介導(dǎo)宿主體液免疫應(yīng)答。正常狀態(tài)下，Th1和Th2細(xì)胞因子相互制約、相互調(diào)節(jié)，處于動態(tài)平衡，維持機(jī)體正常的細(xì)胞和體液免疫功能[5]。本研究應(yīng)用頭花蓼與脾淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察不同濃度的頭花蓼作用于脾淋巴細(xì)胞后，Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，評價頭花蓼的免疫調(diào)節(jié)功能。

1材料和方法

1.1材料

頭花蓼浸膏由浙江眾益公司提供，清潔級C57BL/6雄性小鼠體質(zhì)量(20±5)g[批號SYXK(渝)2007-0001]，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，改良RPMI-1640 培養(yǎng)基(hclone及批號NAF1417)，IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒購自Ausrtian Bender MedsystemsMT公司，刀豆蛋白A(ConA)購自 Sigma公司及批號NO.C8110， CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒購自日本同仁，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)及酶標(biāo)儀(BIO-xMAark)。

1.2方法

1.2.1頭花蓼工作液用無菌雙蒸水配制頭花蓼母液，濃度為25.6 g/L，進(jìn)行一系列倍比稀釋，得到頭花蓼工作液濃度分別為12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 g/L，4 ℃放置備用。

1.2.2脾淋巴細(xì)胞懸液頸椎脫臼處死小鼠，無菌取小鼠脾臟。剪碎，置于2張無菌載玻片毛玻璃面之間，研磨，200目無菌篩網(wǎng)過濾，4 ℃離心(1 000 r/min，10 min)。棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液作用3 min，4 ℃離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，Hank’s液洗滌2次。Hank’s液重懸細(xì)胞，小心重疊于等體積的淋巴細(xì)胞分離液上，4 ℃離心(2 000 r/min，20 min)，吸出淋巴細(xì)胞層，加入預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液，4 ℃離心(1 000 r/min，10 min)。棄上清，10%的小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞存活率大于95%，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)2 h時，去除貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約2×109/L。

1.2.3頭花蓼對脾淋巴細(xì)胞的毒性試驗(yàn)將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，86 μL/孔，然后添加10 μL ConA(終濃度為5 mg/L)。頭花蓼干擾組再加入上述梯度濃度的頭花蓼工作液4 μL(使頭花蓼的終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L)，空白對照組加入4 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入CCK-8液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm波長下吸光度值(OD)。每孔100 μL，設(shè)3個復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4IL-4和IFN-γ的水平將脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，加入ConA，每孔終濃度為5 mg/L，再加入不同濃度的頭花蓼工作液，終濃度分別為(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L)，空白組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個藥物濃度及對照平行做3孔，每孔100 μL。培養(yǎng)板置37 ℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)72 h。收集上清液，4℃離心(2 000 r/min，10 min)，上清液于-20 ℃保存，待測。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno rbent assay，ELISA)試劑盒操作說明，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出IL-4和IFN-γ的濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1頭花蓼對T淋巴增殖水平的影響

培養(yǎng)72 h時，頭花蓼<128 mg/L時，對小鼠脾臟體外淋巴細(xì)胞增殖沒有明顯的影響；≥128 mg/L濃度時，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示頭花蓼濃度低于128 mg/L時，對淋巴細(xì)胞沒有毒性，不影響其增殖，見表1。

表1　不同濃度頭花蓼對小鼠脾淋巴細(xì)胞增值的影響±s)

(1)與空白對照組比較，P<0.05

2.2頭花蓼對IFN-γ和IL-4的影響

頭花蓼濃度4～128 mg/L時，IFN-γ的分泌水平明顯增高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在32 mg/L時，IFN-γ的分泌量達(dá)到頂峰。頭花蓼濃度≥256 mg/L時，淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的水平明顯降低，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)；頭花蓼的濃度在4～128 mg/L時，IL-4分泌量明顯增高，與空白對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；濃度大于512 mg/L時，淋巴細(xì)胞分泌IL-4的水平低于空白對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。提示適宜濃度的頭花蓼對體外培養(yǎng)的小鼠分泌Th1、Th2細(xì)胞因子具有一定的刺激作用，對Th1細(xì)胞因子的分泌水平呈現(xiàn)出一定的濃度相關(guān)性。

表2　頭花蓼對體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ及IL-4的影響(ng/L)

(1)與空白對照組比較，P<0.05

3討論

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的具有高活性、多功能的小分子物質(zhì)，它們涉及免疫和炎癥的每個環(huán)節(jié)，可以調(diào)節(jié)和決定免疫應(yīng)答的性質(zhì)[5-8]。依據(jù)Th分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子及功能特征的不同，把Th淋巴細(xì)胞分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞兩個細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞主要分泌產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，IFN-γ作為Th1型代表細(xì)胞因子，它在初級免疫應(yīng)答中可提高M(jìn)HCⅡ類分子的表達(dá)和細(xì)胞抗原遞呈能力，導(dǎo)致記憶型T細(xì)胞水平增高[10]，主要促進(jìn)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌產(chǎn)生IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，對B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞等非特異細(xì)胞具有多種調(diào)節(jié)功能，是體液免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子[11]。在正常狀態(tài)下，體內(nèi)Th1和Th2細(xì)胞因子相互制約、相互調(diào)節(jié)，處于動態(tài)平衡，維持機(jī)體正常的細(xì)胞和體液免疫功能[12-13]，而IFN-γ、IL-4作為Th1/Th2型免疫相關(guān)因子，在一定程度上可反映出機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的基本狀況[14]。

有研究報(bào)道幽門螺桿菌感染后可介導(dǎo)異常的細(xì)胞免疫導(dǎo)致胃黏膜屏障受損，進(jìn)一步促進(jìn)潰瘍形成[15]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度的頭花蓼對體外脾淋巴分泌Th1/Th2型典型細(xì)胞因子的誘生效果，初步了解頭花蓼免疫調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)關(guān)于頭花蓼治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、消化性潰瘍的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示4～128 mg/L的頭花蓼對ConA活化的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4均具有明顯的促進(jìn)作用，這可能與其中的多糖、黃酮、槲皮素等有效成分有關(guān)。已有報(bào)道多種中藥的多糖成分通過誘生IFN-γ和IL-4增強(qiáng)機(jī)體的抗病力[16]，維持機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫；Farhadi L[17]報(bào)道類黃酮可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，刺激IFN-γ分泌，降低IL-4含量，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。但高劑量的頭花蓼對ConA活化淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4有不同程度的抑制分泌作用，可能通過抑制淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子。此外中藥的成分比較復(fù)雜，高劑量時，其中的某些活性成分與中藥的蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)等成分結(jié)合，致使藥液中的一些有效成分凝固變性，一定程度上影響了藥效。所以，采用中藥進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)時，需選擇合適的劑量。

本研究結(jié)果顯示頭花蓼可刺激IFN-γ和IL-4的分泌作用，但兩者濃度需在一定的范圍內(nèi)，才能使Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)處于平衡狀態(tài)，以維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。觀察系列濃度的頭花蓼刺激脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4效果，不僅顯示了該藥對兩者的分泌的促進(jìn)作用，還顯示了兩者不同分泌水平下頭花蓼的濃度趨勢，為頭花蓼關(guān)于免疫調(diào)節(jié)方面的深入研究提供相關(guān)濃度依據(jù)。而關(guān)于頭花蓼在機(jī)體內(nèi)是否能夠刺激IFN-γ和IL-4的分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡及其有效的調(diào)節(jié)途徑還需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察驗(yàn)證，進(jìn)一步探索其調(diào)節(jié)途徑及作用機(jī)理。

4參考文獻(xiàn)

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué)．中藥大辭典(上冊)[M]．2板．上海：上?？萍汲霭嫔?， 2006：850．

[2] 賈敏如，李星煒．中國民族藥志要[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2005：479．

[3] 劉瑜新，宋曉勇，康文藝，等．頭花蓼對多重耐藥金黃色葡萄球菌抗菌作用研究[J]．中成藥， 2014(9)：1817-1821．

[4] 張姝，羅昭遜，莫非，等．頭花蓼對幽門螺桿菌抗菌作用分析[J]．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2015(2)：113-118．

[5] Haghshenas MR, Khademi B, Ashraf A, et al. Helper and cytotoxic T cell subsets (Th1, Th2, Tc1 and Tc2) in benigh and malignant salivary gland tumors [J]. Oral Dis,2016：12496.

[6] 羅娜，郭晟，楊承英，等.人BClGL基因siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備及其對T淋巴細(xì)胞增殖的影響[J]．貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009(3)：250-254．

[7] Jiong R, Zhi Q, Yang TJ. Immunomodulatory activity in vitro and in vivo of polysaccharide from Potentilla anserina[J]. Fitoterapia, 2010(81):1117-1124.

[8] 朱偉，付本懂，王魯，等．硫酸化20(S)-人參皂苷Rh2對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ的影響[J]．實(shí)驗(yàn)研究， 2011(17)：17-19．

[9] Li LL, Zhang B, Zhu NH, et al. Effects of polysaccharides on immunologie function in early-weaned piglets[J]. Research of Agriculture Modernization, 2009(4):495-497.

[10]Zhou H, Buitenhuis AJ, Weigen S, et al. Candiate gene promoter polymorphisms and antibody respense kinetics in chickens: interferon-γ, interleukin-2, and immunoglobulin light chain[J]. Poultry Science, 2001(80):1679-1689.

[11]Wang N, Shen GS, Bai HG. Research progress of interleukin-4 gene[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2005(1):23-25.

[12]陳全英，陳萬般．活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者Th1/Th2平衡的特點(diǎn)與藥物調(diào)節(jié)[J]．海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010(4)：429-434．

[13]Mat sumura K, Nakase H, Yamamoto S, et al. Modulation of the Th1/Th2 balance by infliximab improve hyperthyroidism associated with a flare up of ulcerative colitis [J]. Inflamm Bowel Dis, 2009(7):967-968.

[14]Mosmann TR, Subash S. The expanding universe of T-cell subsets:Th1, Th2 and more[J]. Immunol Today, 1996(1):136-139.

[15]吳德明，吳治德，劉怡菲．幽門螺桿菌相關(guān)的消化性潰瘍患者Th17/Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)水平及意義[J]．臨床薈萃， 2014(7):536．

[16]商云霞，朱曉慶，谷新利，等．中藥復(fù)方多糖對雞IFN-γ、IL-4和IL-12質(zhì)量濃度的影響[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2015(5)：24-28．

[17]Farhadi L, Mohammadi-Motlagh HR,Seyfi P, et al. Low concentration of flavonoid-rich fraction of shallot extract induce delayed-type hypersensitivity and Th1 cytokine IFN-γ expression in BALB/c Mice [J]. Int J Mol Cell Med, 2014(1):16-25.

(2016-03-03收稿，2016-05-24修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Influence ofPolygonumcapitatumon IFN-γand IL-4 Secretion in Spleen Lymphocytes

FENG Haichao1, SUN Chaoqin1, HE Yun1, WU Qiong2, ZHANG Ran2, MO Fei1, LUO Zhaoxun1

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China； 2.LiaochengPeople'sHospital,Liaocheng252000,Shangdong,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Polygonum capitatum on the secretion of IFN-γ and IL-4 in mice spleen lymphocytes. Methods: A series of concentrations of Polygonum capitatum (final concentrations were 1，2，4，8，16，32，64，128，256，512 mg/L) in splenic lymphocytes of C57BL/6 mice that were activated by ConA for 72 h at the condition of 37 ℃ and 5%CO2。Following Counting Kit-8 was used to detected lymphocytes proliferation and double antibody sandiwich ELISA was used to detect changes，the effect of Polygonum capitatum with different concentration on proliferation and secretion of IFN-γ and IL-4 was analyzed. Results: The T-cell proliferation and IFN-γ secretion was restrained when the concentration of Polygonum capitatum was higher than 128 mg/L. The level of IFN-γ and IL-4 secreted by mice spleen lymphocytes after ConA activation was higher obviously with Polygonum capitatum at the concentration between 8 to128 mg/L，compared with the blank control group (P<0.05). T-cell proliferation had no obvious change.When the concentration of Polygonum capitatum was lower than 32 mg/L,secretion amount of IFN-γ increased as the concentration of Polygonum capitatum become higher. Conclusion: Polygonum capitatum at a certain concentration could participate in cellular immunity that stimulate the mice spleen lymphocytes proliferation, and secretion IFN-γ and IL-4 in vitro .

[Key words]Polygonum capitatum; spleen lymphocytes; interferon-γ; interleukin-4

*[基金項(xiàng)目]貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合(2014)2027號]； 貴州省科技合作計(jì)劃基金[黔科合LH(2015)7417號]； 貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金(gzwikj2015-1-003)； 貴陽市科技局計(jì)劃項(xiàng)目[筑科合同(2014001)]

[中圖分類號]R931

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0645-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.006

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級研究生 E-mail:461698511@qq.com

***通信作者 E-mail:418611578@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-06-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160617.1035.002.html