李利波， 陳騰祥*, 潘　婭*

(貴州醫(yī)科大學 生理學教研室， 貴州 貴陽　550004)

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶在肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激前后的表達*

李利波**， 陳騰祥***, 潘婭***

(貴州醫(yī)科大學 生理學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討正常肝細胞和肝癌細胞在誘導發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)前后細胞裂解液中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、蛋白質(zhì)二硫鍵(PDI)、的表達水平。方法： 取培養(yǎng)獲得的第3代正常肝細胞LO-2和肝癌HepG2與SMMC-7721細胞，采用150 mmol/L無水乙醇處理48 h誘導發(fā)生ERS；分別提取3種細胞裂解液中蛋白質(zhì)，采用Western blot方法檢測GRP78和PDI表達水平。結果： 在ERS前,GRP78在HepG2細胞中表達最高，其次為SMMC-7721細胞，在LO2細胞中表達最低，3種細胞GRP78表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；誘導細胞發(fā)生ERS后，HepG2細胞及LO2細胞GRP78表達均上調(diào)，而SMMC-7721細胞GRP78表達下調(diào)，分別與相應細胞發(fā)生ERS前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在ERS前,PDI的表達在SMMC-7721細胞中最高，其次LO2細胞，在HepG2細胞中表達最低,3種細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；誘導發(fā)生ERS后，與ERS前相對應細胞比較，3種細胞的PDI表達水平均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論： ERS后，肝癌SMMC-7721和HepG2細胞裂解液中的GRP78表達水平發(fā)生變化，PDI表達降低。

[關鍵詞]癌，肝細胞； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激； 蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中適應性最強的細胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)是指在多種病理或生理因素的干擾下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破，發(fā)生錯誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，并引起Ca2+平衡紊亂[1]。ERS主要包括未折疊蛋白反應(UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應(EOR)和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(SREBP)，研究認為癌癥相關的病理與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失衡與誘導ERS和UPR途徑有關[2-5]。蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶(PDI)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種重要的蛋白質(zhì)折疊催化劑，可幫助新合成的蛋白質(zhì)重新形成二硫鍵并產(chǎn)生正確折疊的構象。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種結合蛋白，可增強腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，被視為腫瘤治療反應的一種生物標志物[6]。原發(fā)性肝癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率和死亡率占全球的50%[7]。本研究通過觀察PDI、GRP78在正常肝細胞LO2、肝癌細胞HepG2及SMMC-7721中的表達水平，了解ERS在原發(fā)性肝癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1細胞及試劑

正常肝細胞LO2、肝癌HepG2細胞株和肝癌SMMC-7721細胞株購買于上海生命科學研究所，BCA Protein Assay KitP0010S、RIPA裂解液(強)P0013B購買于上海碧云天公司,RIPA裂解液 WB-0071、NP-40裂解液購買于上海鼎國生物生物技術有限公司，Prestained protein marker 00161543、ECL-PLUS/KitM3121/1859022購買于thermo公司。醫(yī)用X光片038401501購買于carestream公司，X線膠片顯影粉及定影粉購買于上海冠龍照像材料廠；穩(wěn)壓電源(電泳用)EPS-300，SDS-PAGE蛋白電泳儀 VE-180，蛋白轉(zhuǎn)膜儀VE-186為上海天能公司產(chǎn)品。冷凍高速離心機fresco 21購買于thermo公司,PVDF膜 IPVH00010購買于millipore公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人正常肝細胞LO2及肝癌細胞系HepG2用DMEM+10%胎牛血清，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為貼壁生長，培養(yǎng)1周后傳代至第3代。人肝癌細胞系SMMC-7721細胞用RMPI1640+10%胎牛血清、37 ℃、含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為貼壁生長，首次傳代23 d，2周后傳代至第3代。

1.2.2誘導ERS用150 mmol/L無水乙醇分別處理培養(yǎng)獲得的第3代HepG2、SMMC-7721及L-02細胞48 h，棄去無水乙醇，PBS洗滌2次，獲得發(fā)生ERS后的3種細胞標本。

1.2.3檢測GRP78蛋白及PDI蛋白表達用Western Blot方法，分別提取培養(yǎng)獲得的3種細胞樣品，PBS洗滌兩次后刮下細胞轉(zhuǎn)移入EP管中，用預冷的2×Lysis Buffer裂解，冰上裂解10～15 min后超聲破碎細胞，離心15 min，取上清液提取蛋白樣品。根據(jù)GRP78或PDI的蛋白分子量制膠，樣品上樣，恒壓80 V、電泳2 h、在4 ℃及300 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1 h 、4 ℃過夜；TBST洗膜3次、每次10 min，然后顯色。將膠片進行掃描、拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶的分子量和凈光密度值。

1.3統(tǒng)計學處理

分別檢測用無水乙醇處理前后3種細胞裂解液中的GRP78及PDI表達，用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA法、重復測量方差分析法分析3種細胞中這兩種蛋白質(zhì)在無水乙醇處理前后表達水平的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2結果

2.1GRP78表達

在給予無水乙醇應激處理前，GRP78在HepG2細胞中表達最高，其次為SMMC-7721細胞，在LO2細胞中表達最低，3種細胞之間GRP78的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。經(jīng)無水乙醇處理48 h后，HepG2細胞及LO2細胞GRP78表達均上調(diào)，而SMMC-7721 ERS后GRP78表達下調(diào),分別與相應細胞無水乙醇處理前比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示經(jīng)無水乙醇處理48 h后3種細胞均發(fā)生了ERS。見圖1、表1。

(1)與無水乙醇處理前比較，P<0.05圖1　無水乙醇處理前后3種細胞中GRP78表達Fig.1　The expression of GRP78 in three kinds of cells before and after ethanol treatment

細胞光密度值處理前處理48hPLO20.73±0.381.05±0.54<0.05HepG20.90±0.141.17±0.17<0.05SMMC-77210.74±0.370.08±0.04<0.05

2.2PDI表達

在給予無水乙醇應激處理前PDI的表達在SMMC-7721細胞中最高，其次LO2細胞，在HepG2細胞中表達最低，3種細胞之間PDI的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。在無水乙醇處理48 h后3種細胞的PDI的表達水平均下調(diào)，與ERS前相對應細胞的PDI表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2及表2。

(1)與無水乙醇處理前比較,P<0.05圖2　無水乙醇處理前后3種細胞中PDI表達Fig.2　The expression of PDI in three kinds of cells before and after ethanol treatment

細胞光密度值處理前處理48hPLO20.93±0.100.57±0.640.049HepG20.80±0.280.47±0.240.003SMMC-77211.20±0.281.00±0.290.032

3討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝、運輸和參與脂質(zhì)代謝的重要場所，也是細胞內(nèi)儲存Ca2+的主要場所,細胞有一套完整的機制來監(jiān)督和幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與修飾。當某些細胞內(nèi)外因素導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，出現(xiàn)ERS的一系列反應，包括某些蛋白質(zhì)質(zhì)折疊能力增強、某些蛋白質(zhì)翻譯停滯、某些蛋白質(zhì)的降解加速、或細胞內(nèi)Ca2+紊亂等。

GRP78是熱休克蛋白70家族成員之一。GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有兩個作用：(1)促進進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白質(zhì)的疏水氨基酸結合，防止多肽鏈不正確的折疊和聚合，還可識別錯誤折疊的蛋白質(zhì)或未裝配好的蛋白質(zhì)亞單位、并促進他們重新折疊和裝配；(2)防止新合成的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)運過程中變性或斷裂。研究認為，GRP78可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲能力，其水平變化被視為腫瘤治療反應的一種生物標志[8],也有報道證實GRP78在腫瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中扮演主要角色[9]。本研究顯示在誘導ERS前，GRP78在HepG2細胞裂解液中表達最高，其次為SMMC-7721細胞，在LO2細胞中表達最低，表明GRP78在正常肝細胞中具有一定水平，但肝細胞發(fā)生惡性改變時GRP78表達升高，且在低轉(zhuǎn)移能力的HepG2細胞中表達較高，而高轉(zhuǎn)移、高侵襲性的SMMC-7721中表達較低。這提示ERS時GRP78表達水平可能與肝癌細胞的惡性生物學特性有關，但ERS與肝癌細胞的惡性生物學特性的因果關系值得進一步研究。本實驗表明，在誘導ERS后，與誘導前比較，GRP78在HepG2細胞中上調(diào)最多，LO2細胞次之，SMMC-7721則是下調(diào)，分別與發(fā)生ERS前3種細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這表明誘導ERS后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)GRP78的表達發(fā)生了改變，提示細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成過程受到了影響。而3種細胞誘導ERS后，GRP78在LO2細胞中改變最小，在兩種肝癌細胞中改變較大，提示正常肝細胞與肝癌細胞在發(fā)生ERS時的反應是不一樣的，肝癌細胞反應程度高于正常肝細胞，且在低轉(zhuǎn)移能力的HepG2細胞中改變較在高轉(zhuǎn)移、高侵襲性的SMMC-7721細胞改變小，這也提示ERS可能與肝癌的惡性生物學特性相關。這種相關性值得擴大標本量進一步探討。

PDI是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的多功能分子伴侶，它同時具有氧化還原酶活性。PDI能識別未折疊或部分折疊的新生肽折疊中間物，通過與其多肽結合部位結合，防止靶蛋白和底物蛋白之間錯誤的結合或聚合；PDI還能催化蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的形成，ERS可以誘導PDI進入細胞質(zhì)[10]。在本研究中，ERS前PDI的表達在SMMC-7721細胞中最高，其次LO2細胞，在HepG2細胞中表達最低，3種細胞之間PDI的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，表明PDI在正常肝細胞中具有一定水平，肝細胞發(fā)生惡性改變時PDI表達異常，高轉(zhuǎn)移、高侵襲能力的SMMC-7721肝癌細胞裂解液中的PDI表達高于低轉(zhuǎn)移能力的HepG2細胞，P<0.001，似乎提示PDI表達水平可能與肝癌細胞的惡性生物學特性有關，但PDI與肝癌細胞的惡性生物學特性的因果關系值得進一步研究。在誘導ERS后，與誘導前比較，PDI在3種細胞裂解液中的表達均下調(diào)，與應激前PDI 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這表明誘導ERS后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)PDI的表達發(fā)生了改變。這些改變將影響細胞內(nèi)二硫鍵的形成過程。但3種細胞之間PDI表達水平下調(diào)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，似乎提示ERS后PDI表達水平與肝癌細胞的惡性生物學特性無關，本研究樣本量較小，可進一步擴大標本量探討。

本研究顯示，在ERS前，PDI在高轉(zhuǎn)移、高侵襲能力的SMMC-7721肝癌細胞及低轉(zhuǎn)移能力的HepG2細胞裂解液中的表達與GRP78在兩種細胞中的表達正好相反。在ERS后，PDI在兩種肝癌細胞中的表達均下調(diào)，而GRP78在HepG2細胞中上調(diào)，SMMC-7721則是下調(diào)，提示不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細胞在發(fā)生ERS后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)相關蛋白質(zhì)表達水平的變化方向既可以相同、也可以相反，這些變化與肝癌細胞的惡性生物學特性的關系，還有待研究。

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(2016-03-15收稿，2016-05-26修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Expression of PDI and GRP78 before and after ERS in Liver Cancer Cells

LI Libo, CHEN Tenxiang, PAN Ya

(DepartmentofPhysiologyGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the expression level of PDI and GRP78 before and after ERS in the cell lysates of normal liver cells and liver cancer cells. Methods: The third-generation cultivated LO-2, HepG2 and SMMC-7721 cells were processed by 150 mmol/ L anhydrous ethanol for 48 h to induce ERS. Then respectively extracted the proteins in three kinds of cell lysis liquid, then adopting Western blot method to detect the expression level of GRP78 and PDI. Results: Before the ERS, the expressing of GRP78 in HepG2 cells was the highest, secondly was SMMC-7721 cells, the expressing of GRP78 in LO2 cells was the lowest. To compare the expression of GRP78 in three kinds of cells, differences were statistically significant (P<0.001). Before ERS, the expression of PDI in SMMC-7721 cells was highest, followed by LO2 cells, the expression in HepG2 cells was the lowest. To compare the expression of three kinds of cells, differences were statistically significant(P<0.01). After induced ERS, all of the expression of PDI in three cells were downregulating, differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: After ERS, the expression levels of GRP78 changed in SMMC-7721 and HepG2 cells lysis liquid, expression level of PDI decreased.

[Key words]carcinoma hepatocellular; endoplasmic reticulum stress; protein disulfide isomerase; glucose regulated protein 78

*[基金項目]貴州省科技廳科研基金黔科合[LG(2011)208號; 貴州省教育廳自然科學研究基金黔教科[(2008)022號]

[中圖分類號]R735.7； R341

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0667-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.011

**貴州醫(yī)科大學2016屆碩士研究生，工作單位貴州省人民醫(yī)院腫瘤科

***通信作者 E-mail:gzctxin@qq.com; gypanya@126.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1703.032.html