高憲儒 ， 張建軍

(1.慶陽市畜牧技術(shù)推廣中心，甘肅，慶陽，745000；2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所)

隴東絨山羊重要功能基因SNPS研究報(bào)告

高憲儒1， 張建軍2,*

(1.慶陽市畜牧技術(shù)推廣中心，甘肅，慶陽，745000；2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所)

摘要：以隴東絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR-SSCP，DNA測(cè)序技術(shù)，序列分析，最小二乘方差分析，研究了隴東絨山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因的SNPS與經(jīng)濟(jì)性能的關(guān)系，尋找可用于輔助選擇的分子標(biāo)記。篩選確定了影響隴東絨山羊生長發(fā)育、產(chǎn)絨量、絨細(xì)度和產(chǎn)羔率的優(yōu)勢(shì)基因型；制定了隴東絨山羊分子育種技術(shù)流程；項(xiàng)目的實(shí)施，產(chǎn)生了顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)鍵詞：隴東絨山羊；功能基因；遺傳變異；經(jīng)濟(jì)性狀

隴東絨山羊是根據(jù)市場(chǎng)需要和隴東地區(qū)自然經(jīng)濟(jì)條件，于20世紀(jì)70年代引入遼寧絨山羊種公羊?yàn)楦副?，以隴東黃土高原的華池、環(huán)縣、合水、慶陽等當(dāng)?shù)睾谏窖驗(yàn)槟副?，以提高產(chǎn)絨性能為目的，采取簡單育成雜交，歷經(jīng)雜交改良，橫交固定和選育提高三個(gè)發(fā)展階段經(jīng)過30年培育而成的具有典型地域適應(yīng)性的絨山羊品種。因其遺傳性能穩(wěn)定、繁殖性能強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩、產(chǎn)絨性狀優(yōu)良等特質(zhì)，深受當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖農(nóng)戶的青睞，是隴東及周邊地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的主導(dǎo)品種。但目前，隴東絨山羊的選育及其產(chǎn)品的開發(fā)，仍停留在傳統(tǒng)育種階段，而經(jīng)濟(jì)性狀屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳力較低，利用常規(guī)的表型選擇，會(huì)遇到選擇效率低、準(zhǔn)確性差、世代間隔長、遺傳進(jìn)展緩慢等問題，這對(duì)優(yōu)質(zhì)高效絨山羊品種的培育將產(chǎn)生不利影響。

因此，本研究利用現(xiàn)代生物技術(shù)和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法，對(duì)與隴東絨山羊生長發(fā)育、產(chǎn)羔、產(chǎn)絨等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，篩選確定其SNP位點(diǎn)，探討群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多態(tài)性及其與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性，旨在揭示影響隴東絨山羊經(jīng)濟(jì)性狀的重要功能基因的分子遺傳特征，為經(jīng)濟(jì)性狀的高效QTL選育、分子標(biāo)記輔助選擇及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫的建立、種質(zhì)資源的保存及利用提供分子遺傳學(xué)依據(jù)，現(xiàn)就研究情況報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

靜脈采集華池縣悅樂絨山羊繁育基地和環(huán)縣惠農(nóng)絨山羊繁育中心隴東絨山羊血樣6 mL/只，ACD抗凝，置于采樣箱帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存，以備基因組DNA的提取。測(cè)定隴東絨山羊群體不同月齡的體重、體高、體長、胸圍等生長發(fā)育指標(biāo)及產(chǎn)絨量，采集絨毛樣品，進(jìn)行絨長度、絨細(xì)度等指標(biāo)檢測(cè)，建立隴東絨山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫。

1.2方法

1.2.1技術(shù)路線針對(duì)隴東絨山羊育種中迫切需要解決的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等問題，以絨山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀為研究對(duì)象，綜合應(yīng)用分子遺傳學(xué)，生物化學(xué)、基因組學(xué)等多學(xué)科交叉的手段，研究與絨山羊經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因的遺傳學(xué)信息基礎(chǔ)，為解決隴東絨山羊優(yōu)良品種培育中的重大理論和技術(shù)問題提供創(chuàng)新性研究成果，下圖為技術(shù)路線圖。

圖1　功能基因研究路線圖

1.2.2DNA分子標(biāo)記方法利用PCR-SSCP技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)等進(jìn)行隴東絨山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因SNP的檢測(cè)。

1.2.3統(tǒng)計(jì)分析

(1)基因頻率和基因型頻率

式中i表示純合等位基因型個(gè)體，j1…n表示與i共顯性的第n個(gè)基因型個(gè)體，N為樣本總數(shù)

(2)相關(guān)性分析，根據(jù)最小二乘線性模型，考慮到試驗(yàn)動(dòng)物生長環(huán)境相同，測(cè)定月齡一致，性別和基因型可能是影響生長發(fā)育性狀的主要因素，故建立如下模型：

Yijk =μ+Sexi+Genotypej+ Sexi×Genotypej+eijk其中：yijkm 為個(gè)體表型記錄；μ為群體平均值；Sexi為性別齡效應(yīng)；Genotypej為基因型效應(yīng)；Sexi×Genotypej性別與基因型的互作效應(yīng)，eijk為隨機(jī)誤差。

根據(jù)上述模型，運(yùn)用SPSS 11.5 軟件包中的GLM(General Linear Model)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2主要研究成果

2.1影響隴東絨山羊生長發(fā)育性狀的功能基因

據(jù)報(bào)道，生長激素基因(GH)、雙肌臀基因(CLPG)瘦素基因(Leptin)、肌肉抑制素基因(MSTN)等與動(dòng)物機(jī)體生長、生殖系統(tǒng)發(fā)育、產(chǎn)肉性能等密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，隴東絨山羊GH基因SNP與其產(chǎn)絨性狀及繁殖性狀無顯著相關(guān)(P>0.05)，但與生長發(fā)育性狀呈顯著相關(guān)(P<0.05)。在外顯子4區(qū)域1450 bp處發(fā)生C→T 的單堿基突變(見圖2)。從6月齡重、周歲重、體長和胸圍等早期生長發(fā)育指標(biāo)來看(見表1)，HH、GG、GH三種基因型間存在顯著差異(P<0.05)，且以HH型最高。因此，HH型可以作為影響隴東絨山羊早期生長發(fā)育性狀的有利基因型進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。

圖2　GH基因擴(kuò)增位點(diǎn)不同基因型測(cè)序圖

注：同一列具有不同字母肩注者差異顯著(P<0.05)。

2.2影響隴東絨山羊產(chǎn)絨性狀的功能基因

根據(jù)目前的研究成果，影響山羊產(chǎn)絨性狀的重要功能基因有褪黑激素(MEL)、褪黑激素受體( MTNR)、催乳素(PRL)、胰島素生長因子(IGF-I)、乳表皮生長因子(EGF)、角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF)等，它們主要通過旁分泌和自分泌方式協(xié)同參與毛發(fā)周期調(diào)控，從而影響產(chǎn)絨性狀的表達(dá)。本研究對(duì)隴東絨山羊MTNR1b基因部分編碼區(qū)序列進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)了兩處突變，分別為D00476:g. 663 bp G >A和584 C>T，產(chǎn)生了CC、DD、CD 3種基因型，且CC型基因型頻率最高。最小二乘法分析表明(見表2)，MTNR1b基因多態(tài)性對(duì)產(chǎn)絨量和絨細(xì)度有顯著影響(P<0.05)，對(duì)絨長度無顯著影響(P>0.05)。產(chǎn)絨量，3種基因型間存在顯著性差異(P<0.05)，從大到小依次為CC型、CD型、DD型；絨細(xì)度，CC型與CD型間無顯著差異(P<0.05)，但都顯著高于DD型(P<0.05)。根據(jù)上述結(jié)果，推測(cè)MTNR1b基因可能影響隴東絨山羊產(chǎn)絨性狀的重要功能基因之一，CC型可以作為標(biāo)記基因型。

表2　不同基因型與隴東絨山羊產(chǎn)絨性狀的相關(guān)性分析　 (g，cm，μm)

注：同一列具有不同字母肩注者差異顯著(P< 0.05)。

2.3影響隴東絨山羊繁殖性狀的功能基因

GnRHR通過與定位于垂體促性腺細(xì)胞膜上的GnRHR結(jié)合，可以促進(jìn)垂體前葉合成和分泌促卵泡素和促黃體素，進(jìn)而調(diào)控性腺的功能，包括激素合成與配子生成。本研究結(jié)果表明，GnRHR基因SNP與隴東絨山羊產(chǎn)羔數(shù)和羔羊初生重具有相關(guān)性。GnRHR基因外顯子1存在多態(tài)性，在696 bp處發(fā)生了G→C的突變和735 bp處堿基 A的缺失，產(chǎn)生了E、F 2個(gè)等位基因和EE、EF 2種基因型。根據(jù)繁殖記錄，對(duì)隴東絨山羊產(chǎn)羔數(shù)和羔羊初生重進(jìn)行跟蹤記錄。相關(guān)性分析表明，不同基因型對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P<0.05)，但對(duì)羔羊初生重?zé)o顯著影響(P>0.05)。EE型個(gè)體平均產(chǎn)羔數(shù)為1.28，比EF型個(gè)體平均產(chǎn)羔數(shù)提高了24.3%(見表3)。

表3　不同基因型與隴東絨山羊產(chǎn)絨性狀的相關(guān)性分析 　 g，個(gè)

注：同一列具有不同字母肩注者差異顯著(P < 0.05)。

2.4建立了QTL基因型多點(diǎn)聯(lián)合推斷方法

山羊的生長發(fā)育、繁殖、產(chǎn)絨等許多經(jīng)濟(jì)性狀都是由多基因控制的數(shù)量性狀，現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)為實(shí)現(xiàn)控制數(shù)量性狀基因的準(zhǔn)確選擇提供了有效的技術(shù)手段，但大多數(shù)分子標(biāo)記輔助選擇實(shí)踐僅是對(duì)標(biāo)記基因型的選擇，而非直接對(duì)QTL基因型進(jìn)行選擇。利用QTL 定位獲得與上述經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記以及相關(guān)基因，提高QTL定位的準(zhǔn)確性和精確性，是開展遺傳育種工作的重要手段和有效途徑。

因此，本研究在四向雜交設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，結(jié)合貝葉斯理論和隱馬爾可夫鏈原理，根據(jù)數(shù)量遺傳學(xué)原理和遺傳多態(tài)性研究成果，提出了一種用于標(biāo)記輔助選擇育種中QTL基因型的多點(diǎn)聯(lián)合推斷方法，旨在應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)研究影響隴東絨山羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子遺傳原理。

2.5制定了隴東絨山羊分子育種技術(shù)流程

隴東絨山羊主要從表現(xiàn)型和基因型兩方面去考慮，選擇確定親本。

圖3育種技術(shù)流程

3經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益

通過項(xiàng)目的實(shí)施，利用分子標(biāo)記技術(shù)優(yōu)化了群體結(jié)構(gòu)，選育出了體大型、絨多型、絨細(xì)型、羔多型群體，累計(jì)選育5萬多只，整體上提高了隴東絨山羊的個(gè)體品質(zhì)，同時(shí)降低了飼養(yǎng)成本。項(xiàng)目總經(jīng)濟(jì)效益623.7萬元 ，年經(jīng)濟(jì)效益207萬元，單位規(guī)模新增純收益 198元/只，推廣投資年均收益率4.16元/元。隴東絨山羊個(gè)體經(jīng)濟(jì)性能提高后，即可減少絨山羊存欄量，減少飼草料壓力，保護(hù)了環(huán)境，從而產(chǎn)生具大的生態(tài)效益和社會(huì)效益，同時(shí)，項(xiàng)目技術(shù)得到當(dāng)?shù)卣目隙ê惋曫B(yǎng)戶的大力支持，具有良好的推廣和應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn):

[1]Malveiro E , Pereira M ,Marques P X ,et al . Polymorphisms at the five exons of the growt h hormone gene in t he algarviagoat: possible association wit h milk t rait s[J] . Small Ruminant Research,2001,41:1632-170.

[2]胡沈榮,藍(lán)賢勇,陳 宏,等. 5 個(gè)山羊品種GH 基因第Ⅱ、Ⅴ外顯子的多態(tài)性及其應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，35(12)：11-16.

[3]閔令江,李美玉,孫國強(qiáng),等.生長激素基因多態(tài)性與山羊體重性狀的關(guān)系[J].遺傳學(xué)報(bào)，2005, 32 (6): 650-654.

[4]李美玉,閔令江,孫國強(qiáng),等.山羊生長激素基因5′調(diào)控區(qū)的多態(tài)性分析[J].遺傳，2004,26 (6):831-835.

[5]李中原,王 鋒,武 杰,等.山羊生長激素基因第二外顯子SSCP分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(6):191-193.

[6]Hecht C,Gelderm ann H,et al.Variants within the 5’-flanking region and intron Iof the Bovine growth hormone gene.Anim Genet,1996,27(5):329-332.

[7]劉 玲,陳 喻,張國俊,等.南江黃羊GH基因外顯子4單核苷酸多態(tài)與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析[J].激光生物學(xué)報(bào),2011,20(5):650-656.

[8]王利心,孫瑞萍,朱廣琴,等.羊級(jí)進(jìn)雜交后代GH基因第4和第5外顯子的多態(tài)性與體重性狀的相關(guān)分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,(8):1-6.

Study on Key Function Genes SNPS of Longdong Cashmere Goat

GAO Xian-Ru1， ZHANG Jjian-Jun2*

(1.QingyangCityAnimalHusbandryTechnologyPromotionCenter,QingyangGansu745000；2.GansuInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine)

Abstract:The association between SNPs of key economic traits candidate gene and the economic traits of Longdong cashmere goats were analyzed by PCR-SSCP, DNA sequencing, Least square analysis of variance and general linear model and the aims were to look for the molecular marker assisted selection. The dominant genotypes that affected Longdong cashmere goat growth, cashmere yield, cashmere fineness and lambing rate were determined, and the procedures of Longdong cashmere goat molecule breeding were made. There had been significantly social benefits and economic benefits after implementing the project.

Key words:Longdong cashmere goat; function genes; genetic variation; economic traits

[收稿日期]2015-10-18

[基金項(xiàng)目]甘肅省科技廳資助項(xiàng)目技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)計(jì)劃(1004TCYL033)

[作者簡介]高憲儒(1964-)，男，本科，高級(jí)畜牧師。主要從事動(dòng)物生產(chǎn)及技術(shù)推廣工作。E-mail: 2649076045@qq.com *[通信作者]張建軍，副研究員，主要從事動(dòng)物系統(tǒng)生產(chǎn)研究與示范。E-mail:jjzh1978@163.com

[中圖分類號(hào)]S 852.651

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1004-6704(2016)02-0016-04