陳　蕓，王繼蓮，丁曉麗，馬劉峰*

(1 喀什大學 生命與地理科學學院，新疆喀什844006；2 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究自治區(qū)重點實驗室，新疆喀什844006)

新疆石榴種質資源遺傳多樣性的SRAP分析

陳蕓1,2，王繼蓮1,2，丁曉麗1，馬劉峰1,2*

(1 喀什大學 生命與地理科學學院，新疆喀什844006；2 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究自治區(qū)重點實驗室，新疆喀什844006)

摘要:采用SRAP分子標記技術，對21份新疆石榴品種的遺傳多樣性與親緣關系進行分析。從36對引物組合中篩選出16對擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合分析供試材料，共檢測出271個位點，其中194個為多態(tài)性位點，多態(tài)性比率達71.59% ，平均每對引物組合產生16.94個位點和12.13個多態(tài)性位點。21份石榴樣品間的相似性系數為0.63～0.89，平均為0.77。UPGMA聚類結果顯示，在相似性系數為0.776時，21份材料可被分為5個類群。新疆石榴品種間平均觀察等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)及Shannon’s 信息指數(I)分別為1.712 2、1.352 8、0.199 9及0.310 5。研究表明，新疆喀什地區(qū)石榴品種的遺傳多樣性最為豐富；SRAP聚類結果與石榴的表型特征存在一致性，且SRAP分子標記技術是研究石榴遺傳多樣性簡單而有效的手段。

關鍵詞:石榴；SRAP；遺傳多樣性

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科(安石榴科Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)落葉灌木或小喬木，原產伊朗、阿富汗及印度西北部地區(qū)[1]。石榴是一種藥、食兩用的珍貴水果，營養(yǎng)價值極高。近年來，隨著人們對石榴活性成分及藥理作用研究的不斷深入，石榴抗氧化、降血脂、降血糖、預防心腦血管疾病的功效廣泛報道。石榴受到廣大消費者的喜愛，市場需求日益增加。

新疆的南疆地區(qū)是石榴適生栽培區(qū)，這里很可能是中國石榴的原生或次生起源中心[2]。然而目前新疆石榴分類仍比較混亂，往往僅依據果實風味進行分類，存在同種異名、同名異種現象。國內應用分子標記技術分析石榴遺傳多樣性已有一些報道，而用分子標記技術研究新疆石榴遺傳多樣性的相關報道極少，僅涉及RAPD[3]和AFLP[4]2種標記技術，且只涉及新疆少數石榴品種。闡明新疆石榴基因型之間的親緣關系和遺傳多樣性，是新疆石榴遺傳育種及標準化栽培的基礎，是十分重要和必要的。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)即相關序列擴增多態(tài)性是一種基于PCR的分子標記技術[5]，該標記具有多態(tài)性高、簡便、快速、穩(wěn)定、成本低等特點[6]，已被廣泛應用于紅花[7]、柿子[8]、丹參[9]、花椒[10]等植物的遺傳多樣性分析。因此，采用分子標記技術SRAP分析新疆石榴地方品種的親緣關系和遺傳多樣性，將為新疆石榴的分類、起源演化、種質資源引進和利用，分子標記輔助選擇育種等提供科學依據。

1材料和方法

1.1材料

實驗材料均為新疆石榴，包括了新疆石榴主栽品種和收集到的一些地方品種。具體采樣地點、材料名稱及編號見表1。從各石榴品種單株上采集健康的葉片數枚。近的采集地點，將新鮮葉片迅速放入自封袋中，置于車載冰箱內，帶回實驗室，儲存于- 70℃冰箱備用。遠的采集地點，將葉片放入提前裝有2/3左右變色硅膠的自封袋中，并保存少量空氣，密封。每天注意觀察變色硅膠的顏色，及時更換變色硅膠，帶回實驗室，常溫保存，備用。

1.2方法

1.2.1樣品基因組DNA提取與SRAP-PCR擴增基因組DNA提取參考改良CTAB法[11]，因石榴成熟葉片雜質多，略加改進。改進處如下：液氮磨樣前加入4%的PVP和0.02 g抗壞血酸；以硅膠干燥葉片為材料時，提取緩沖液體積與材料質量之比增至原來的2倍；異丙醇沉淀后，增加1次酚：氯仿：異戊醇抽提。提取后的基因組DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將各樣本基因組DNA用雙蒸水稀釋至約50 ng/μL，-20 ℃保存。SRAP擴增引物參照Li等[5]、Mohammad等[12]發(fā)表的引物序列(表2)，由上海生工合成。Taq酶和dNTP購自北京天根生物技術公司。擴增體系優(yōu)化后確定為：反應體系總體積25 μL，含DNA 75～100 ng， Mg2+2 mmol/L，dNTPs 0.5 mmol/L，上、下游引物各0.4 μmol/L，Tap DNA聚合酶2U，10×PCR Buffer 2.5 μL，補足超純水至25 μL。參照Li等[5]的擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.2.2SRAP擴增產物檢測取8 μL擴增產物與2 μL載樣緩沖液混勻，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TBE，220 V恒壓電泳2～3 h。電泳結束后，銀染法染色，數碼相機拍照保存。

1.2.3數據分析電泳圖譜上同一位置有清晰條帶的記為“1”，無條帶記為“0”，個別擴增效果不理想導致條帶不夠清晰或缺失記為“2”，形成數據矩陣。采用NTSYS-pc2.10e軟件進行聚類分析。對數據矩陣用SimQual程序求得Jaccard相似系數，獲得相似系數矩陣。繼而采用SHAN程序中的UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)方法聚類分析，通過Treeplot模塊生成聚類圖。用PopGen Version 1.3l軟件計算Nei’s genetic identity、genetic distance(GD)、觀察等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)及Shannon’s 信息指數(I)。

表1　21個石榴品種的名稱和來源

表2　采用的SRAP標記的引物序列

2結果與分析

2.1SRAP擴增結果

以甜石榴(Ks1)、賽檸檬(Cl2)和小葉觀賞石榴(Hm3)3個地理位置相差較遠、表型特征差異較大品種的基因組DNA為模板，采用36對引物組合進行PCR擴增。篩選出16對擴增條帶豐富、多態(tài)性高的引物組合，對所有石榴樣本進行遺傳多樣性分析。擴增結果(表3)顯示，16對引物組合在21個樣本中共擴增得到271個位點，其中194個位點為多態(tài)性位點，多態(tài)比率為71.59%。平均每對引物可擴增得到16.94個位點, 其中12.13個位點有多態(tài)性。SRAP引物在石榴樣本中擴增得到的DNA 片段多數集中于100～2 000 bp之間。代表性圖譜如圖1。擴增結果表明SRAP標記能檢測出較多的遺傳位點，能獲得多態(tài)性較好的PCR結果。

2.2遺傳相似性分析

根據擴增所得電泳條帶，用NTSYS-pc2.10e軟件對21份石榴品種進行遺傳相似性分析，通過SimQual程序求得Jaccard相似系數，得到各樣品間遺傳相似系數(GS)矩陣。結果表明，21份石榴樣品間的相似系數為0.63～0.89，平均為0.77，變化幅度不大。其中，來自和田皮山縣皮亞勒瑪鄉(xiāng)的皮亞曼二號與來自喀什市阿瓦提鄉(xiāng)的甜石榴間的相似系數最小為0.6347，說明二者的親緣關系最遠；來自喀什市阿瓦提鄉(xiāng)的甜石榴與來自喀什市佰什克然木鄉(xiāng)的酸甜石榴之間的相似系數最大達到0.8856，說明二者的親緣關系最近。

表3　SRAP引物組合擴增石榴基因組DNA的多態(tài)位點數

M.DL2000；1～21依次為21份石榴樣品，順序同表1圖1　引物組合me6me6的擴增效果M.DL2000; 1-21. Pomegranate samples, the order is same as Table 1Fig. 1　PCR amplified patterns by primer me6em6

2.3新疆石榴種質資源的聚類分析

根據SRAP標記電泳圖譜，用NTSYS-pc2.10e軟件對21份石榴材料進行聚類分析，結果如圖2。21個石榴品種首先分成了兩大類，Ps2和Ps3單獨聚在了一起，其他品種聚在了一起，說明Ps2和Ps3與其它品種間親緣關系較遠。此2種石榴均為廣受消費者青睞的鮮食品種，表型也很相似，都具有莖刺多、花色紅、單瓣花、果皮紅、籽粒大而深紅色等特點，果實的萼片形態(tài)也相似。只是在同樣的栽培條件下，相同樹齡的石榴樹上Ps2的果實更大，平均單果重也更高。Ps2和Ps3聚在一起證實了二者在分子水平上具有相似的遺傳基礎。在遺傳相似系數為0.776時，21個石榴品種可分為Ⅴ個類群。第Ⅰ類群為來自和田皮山縣皮亞勒瑪鄉(xiāng)的Ps2；第Ⅱ類群為Ps3；第Ⅲ類群共12種，包括了喀什地區(qū)的大部分品種：來自喀什市的Ks2、Ks3、Ks4、Ks5，來自喀什地區(qū)葉城縣的Yc1、Yc2、Yc3、Yc4、Yc5。另外，來自和田地區(qū)的Ps4、Cl2和來自哈密的Hm1也聚在了此類群中。這一類群的石榴均為紅花、單瓣、紅皮、硬籽兒的鮮食石榴。第Ⅳ類群共2種，來自和田地區(qū)的Ps1、Cl1聚在了一起。這2個品種也是紅花單瓣的鮮食品種，但具有區(qū)別于其他品種的共同特點：果皮色澤暗紅并且無莖刺。第Ⅴ類群共5種，樣品中所有的觀賞石榴(Ats1、Ks6、Hm2、Hm3)均聚在了此類群，來自喀什的甜石榴品種Ks1與這幾種觀賞石榴聚在了一起。從聚類圖看， Ats1、Ks6與Ks1的親緣關系較近。Ats1和Ks6是紅花、單瓣的賞食兼用石榴，Ks1是紅花、單瓣、紅皮鮮食石榴。Hm2和Hm3為重瓣觀賞石榴，親緣關系較近，聚在一起。

樣品編號同表1圖2　基于SRAP標記產生的石榴聚類圖Number of samples are the same as Table 1Fig. 2　Dendrogram of 21 pomegranate accessions based on SRAP

2.4新疆不同地區(qū)石榴SRAP遺傳多樣性

依據各石榴樣品所分布的地理位置，將21份材料分為3組。其中來自喀什地區(qū)的11個品種和阿圖什市的1個品種合并為第一組；來自和田地區(qū)的6個品種編為第二組；來自哈密三道嶺的3個品種編為第三組；用PopGen Version 1.3l軟件計算各生態(tài)區(qū)域石榴的遺傳多樣性指數，結果如表4。由表4數據可知，3個地區(qū)石榴的觀察等位基因數(Na)、Nei’s基因多樣性指數(h)、Shannon's 信息指數(I)都以喀什地區(qū)為最高；和田地區(qū)其次；哈密三道嶺地區(qū)最低。說明參試品種中新疆喀什石榴遺傳多樣性最為豐富。這可能也與新疆石榴主要分布于南疆，北疆地區(qū)很少，故而哈密地區(qū)采集到的樣本數有限有關。

表4　不同地區(qū)石榴SRAP標記的遺傳多樣性指數

3討論

3.1SRAP標記遺傳多樣性適用性分析

許多學者研究表明，SRAP標記是植物遺傳多樣性研究的理想工具。該標記能將遺傳關系很近的品種區(qū)分開來[13]，與AFLP標記相比，它所提供的信息更接近于農藝性狀的差異和歷史演變結果[14]。本試驗結果表明，SRAP標記穩(wěn)定性和重復性好，擴增條帶清晰、豐富，可以在石榴中產生多態(tài)性。實驗中采用的16對引物共擴增得到271個位點，其中194個位點為多態(tài)性位點，多態(tài)比率為71.59%。平均每對引物可擴增得到16.94個位點, 其中12.13個位點有多態(tài)性。單對引物擴增位點數高于前人用SRAP標記對柿屬[15]、蔥[16]、青稞[17]的研究，但低于該標記對國蘭[18]和玫瑰[19]的研究。其原因可能與參試的石榴品種數量有限有關。本研究中，新疆的21個品種多態(tài)性位點百分率以及平均每對引物擴增位點數均高于熱娜·卡司木等[3]用RAPD標記對新疆石榴親緣關系的研究所得的結果。多態(tài)性位點百分率也高于趙麗華等[20]用AFLP對42份川滇石榴品種遺傳多樣性的研究結果(65.66%)。這一結果充分表明了SRAP標記擴增效果理想、多態(tài)性高，是遺傳多樣性分析的理想工具。同時，本研究多態(tài)性位點百分率低于馬麗等[21]采用ISSR標記對82個石榴品種遺傳多樣性的分析結果以及苑兆和等[4]利用熒光標記AFLP對中國石榴群體遺傳多樣分析的結果。表明石榴在新疆雖然經過了多年的人工選育及基因突變的積累，產生了較豐富的變異，形成了穩(wěn)定而豐富的資源庫。然而，新疆石榴畢竟品種有限，且多為紅皮石榴，表型比較相似，與中國其他區(qū)域及國外豐富的石榴遺傳資源相比，遺傳多樣性偏低。近年來，新疆石榴產業(yè)化發(fā)展，一些具有市場競爭力的石榴品種(籽粒大的、甜的、皮色鮮艷)規(guī)?；N植，而許多流傳下來零星分布的地方品種消失了，丟失了許多珍貴的石榴資源。為了進一步豐富新疆石榴資源基因庫，建議一方面建立新疆種植資源圃，保護現有的石榴資源；另一方面可以從中國其他地區(qū)和國外引進一些品質好的石榴品種。

3.2新疆石榴聚類分析

本研究中，SRAP標記對21份石榴樣品的聚類結果表現出如下幾個特點：第一，聚類結果與石榴的部分表型特征具有一致性。果皮色澤暗紅并且無莖刺的Ps1、Cl1聚在一起。供試樣品中4個觀賞石榴品種(Ats1、Ks6、Hm2、Hm3)聚在一組，單瓣的Ats1、Ks6與Ks1聚在一起，重瓣的Hm2和Hm3聚在一起。證實果皮顏色、花瓣輪數、莖刺有無等特征可作為石榴的分類依據。第二，聚類結果與樣品的地理位置分布有相關性。地理位置近的品種往往聚在一起。如喀什地區(qū)的樣品，除了觀賞石榴(Ks6)和甜石榴(Ks1)外，其余9種均聚在第Ⅲ類群，來自和田地區(qū)的Ps1、Cl1聚在了一起構成了第Ⅳ類群。第三，聚類結果與樣品果實風味分類結果不一致。酸石榴和甜石榴聚在一起。這與趙麗華等[20]的研究結果一致。證明石榴果實風味不是石榴分類的主要依據。由于石榴屬于小雜果，長期以來并未得到足夠重視，分類較混亂，還沒有建立統一的石榴品種分類方法和分類體系。新疆石榴往往僅依據果實風味結合地名進行命名，如葉城酸石榴、喀什甜石榴。汪小飛等[22]對石榴分類的研究表明，在石榴形態(tài)特征中，花瓣、花色、結實性、果色、果實大小及果重是品種分類的主要依據，而籽粒軟硬、萼筒形狀、新葉顏色、莖刺有無等特征可作為次級分類依據。上述分類特征中，并未提及果實風味。

根據本研究結果，在石榴育種實踐中可選用地理位置較遠、親緣關系也較遠的品種雜交，以實現新疆石榴品質的遺傳改良。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Diversity of Germplasm Collection of Pomegranate in Xinjiang Using SRAP Markers

CHEN Yun1,2, WANG Jilian1,2, DING Xiaoli1, MA Liufeng1,2*

(1 College of Biology and Geography Science, Kashgar University, Kashgar, Xinjiang, 844006,China ;2 The Key Laboratory of Ecology and Biological Resource in Yarkant Oasis at Colleges & Universities under the Department of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Kashgar, Xinjiang, 844006, China)

Abstract:Sequence-related amplified polymorphism technique was adopted to analyze 21 pomegranate accessions. Sixteen primer combinations with clear band patterns and polymorphism were selected from thirty-six primer combinations. 271 loci were detected by sixteen pairs of SRAP primers. Among them 194 were polymorphic, the polymorphic rate was 71.59%, an average of 16.94 loci and 12.13 polymorphic loci were amplified by each primer pair. The genetic similarity coefficient of 21 pomegranate accessions ranged from 0.63 to 0.89, with an average of 0.77. An unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) tree established from Jaccard similarity coefficients suggested that 21 pomegranate accessions were clustered into five subgroups. The average value of observed number of alleles, effective number of alleles, Nei’s gene diversity index, Shannon’s information index are 1.712 2, 1.352 8, 0.199 9 and 0.310 5, respectively. There was rich genetic diversity among the pomegranate accessions in Kashi Prefecture. The clustering results using SRAP markers were consistent with the phenotypic characteristics of pomegranate. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) is a simple and effective method to research on genetic diversity of pomegranate.

Key words:Punica granatum L.; SRAP; genetic diversity

文章編號:1000-4025(2016)05-0916-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0916

收稿日期:2016-02-12;修改稿收到日期:2016-04-21

基金項目:新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱?XJEDU2013S35)

作者簡介:陳蕓(1980-)，碩士，講師，主要從事植物分子遺傳研究。E-mail：chenyun8111@126.com。 *通信作者:馬劉峰，博士，副教授，主要從事植物基因工程研究。E-mail：maliufeng@126.com。

中圖分類號:Q346+.5;Q789

文獻標志碼:A