秦玉潔，張廷虹，葉昕

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

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抗A型流感病毒聚合酶堿性蛋白1多克隆抗體的制備和鑒定

秦玉潔，張廷虹，葉昕

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

秦玉潔, 張廷虹, 葉昕. 抗A型流感病毒聚合酶堿性蛋白1多克隆抗體的制備和鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 105–113.

Qin YJ, Zhang TH, Ye X. Preparation and detection of anti-influenza A virus polymerase basic protein 1 polyclonal antibody. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 105–113.

摘 要:流感病毒屬于正黏病毒科，為有包膜包裹的單股負(fù)鏈RNA病毒。它的8個(gè)基因片段編碼至少16種病毒蛋白，其中3個(gè)蛋白組成流感病毒的聚合酶復(fù)合體。流感病毒聚合酶堿性蛋白1 (PB1) 是該復(fù)合體的組分之一，在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及重配中發(fā)揮重要的作用。為研究其功能，構(gòu)建His-PB1 (aa 550–755) 融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，通過(guò)鎳柱親和將其純化，然后作為抗原免疫家兔。對(duì)抗血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，表明抗體效價(jià)可達(dá)1∶100 000。兔源PB1蛋白抗血清經(jīng)親和純化后，用于免疫印跡檢測(cè)流感病毒W(wǎng)SN毒株P(guān)B1蛋白以及外源轉(zhuǎn)染的FLAG-PB1蛋白，結(jié)果表明該P(yáng)B1抗體具有良好的特異性，同時(shí)也能特異性識(shí)別其他亞型的A型流感病毒的PB1蛋白，為進(jìn)一步研究流感病毒PB1蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:流感病毒，PB1，多克隆抗體，親和純化

Received: March 7, 2015; Accepted: May 4, 2015

Supported by: National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2011CB504705), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program (No. 2013ZX10004611).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB504705)，國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng) (No. 2013ZX10004611) 資助。

流感病毒屬于正黏病毒科，為有包膜包裹的單股負(fù)鏈RNA病毒[1]。流感病毒8個(gè)基因片段編碼16種蛋白[2-3]。每個(gè)基因片段都被核蛋白(NP) 以及RNA依賴(lài)的RNA聚合酶包裹，形成病毒核糖核蛋白復(fù)合體[4]。其中，RNA依賴(lài)的RNA聚合酶復(fù)合體由聚合酶堿性蛋白1 (PB1)、聚合酶堿性蛋白2 (PB2)、聚合酶酸性蛋白 (PA) 3種組分構(gòu)成。病毒感染宿主細(xì)胞之后，聚合酶復(fù)合體入核，完成病毒的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制。PB1在流感病毒聚合酶復(fù)合體中作為骨架起支撐作用且具有聚合酶活性，在RNA鏈延伸過(guò)程中起催化作用[4-7]。此外PB1還含有病毒RNA (vRNA) 及cRNA的結(jié)合域[8-9]，與病毒的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制密切相關(guān)。在流感病毒的重配中，PB1蛋白及病毒表面糖蛋白經(jīng)常發(fā)生重排，研究人員認(rèn)為這些重排能通過(guò)提高流感病毒的適應(yīng)性使其在自然選擇中占據(jù)優(yōu)勢(shì)[10]，而且已經(jīng)證明PB1蛋白與流感病毒的種間傳遞及適應(yīng)有關(guān)[10]。PB1還與多種宿主因子如CES1、CHAF1A、DDX54、EEF1A1等存在相互作用[4]。通過(guò)序列重排及突變分析表明PB1的活性位點(diǎn)位于其中部區(qū)域S-D-D基序[11]。由此可見(jiàn)，流感病毒的PB1蛋白在病毒的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，目前雖然有一些商品化的PB1的抗體，但是其特異性、靈敏度并不十分好。這為PB1蛋白的研究工作造成了不便。為了進(jìn)一步研究流感病毒PB1蛋白與病毒組分及宿主細(xì)胞因子的相互作用，通過(guò)對(duì)PB1蛋白進(jìn)行抗原表位分析以及同源比對(duì)，首次選取了流感病毒PB1蛋白550–755位氨基酸作為免疫原免疫家兔。同源比對(duì)結(jié)果表明，該段區(qū)域在不同亞型的A型流感病毒PB1蛋白高度保守，例如：與A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 亞型有98%的同源性，與A/Philippines/2/ 1982 (H3N2)、A/chicken/Vietnam/949B/2004 (H5N1)、A/Anhui/1-DEWH 730/2013 (H7N9) 的同源性分別為84%、84%和83%。并得到了兔源的PB1蛋白多克隆抗體。利用抗原抗體的親和純化得到了效價(jià)及特異性都較好的抗PB1蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能特性奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料

引物由博尚公司、華大基因合成；pET-30a原核表達(dá)載體及pHH21-PB1重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌Escherichia coli Top 10、BL21感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備。WSN病毒由本實(shí)驗(yàn)室制備，H3N2以及H9N2亞型流感病毒由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所嚴(yán)景華研究員惠贈(zèng)。

1.1.2試劑

rTaq DNA聚合酶，10×PCR緩沖液，EcoRⅠ/ Hind Ⅲ，1 mol/L 緩沖液，T4 DNA 連接酶，T4 DNA 連接酶緩沖液均購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；膠回收試劑盒和鎳柱購(gòu)自Qiagen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、BCA protein Aassy kit、顯色用A/B液購(gòu)自Vigorous公司；IPTG購(gòu)自Merck公司。

1.1.3儀器

PCR儀為Bio-Rad產(chǎn)品；搖床購(gòu)自上海博彩生物科技有限公司；37 ℃溫箱購(gòu)自上海一恒科技有限公司；離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；超聲破碎儀JY92-2D購(gòu)自寧波新芝公司；核酸電泳儀購(gòu)自北京君益東方電泳設(shè)備有限公司；蛋白電泳儀及凝膠成像儀購(gòu)自上海天能公司；攝影暗匣購(gòu)自廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司。

1.2方法

1.2.1pET-30a-PB1 (aa 550-755) 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

通過(guò)Lasergene軟件預(yù)測(cè)PB1較為高效的抗原表位：分別采用protean中的Chou-Fasman方案和Garnier法對(duì)PB1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)Hopp-woods分析PB1蛋白的親疏水性；通過(guò)Emini分析PB1蛋白的溶劑可及性；通過(guò)Karplus-Schulz方法分析PB1蛋白的可塑性；通過(guò)Jameson-Wolf預(yù)測(cè)PB1蛋白潛在的抗原表位，最終選取PB1蛋白的550–755aa段作為抗原區(qū)段[12]。根據(jù)PB1蛋白的堿基序列及pET-30a載體多克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物：5′-CGGAATTCATGCTGTTCATCAAAGATTA C-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTCTACCGT CTGAGCTCTTCAAT-3′。引物兩端分別引入了EcoRⅠ、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段為618 bp。PCR體系：rTaq DNA 聚合酶0.25 μL；10×PCR 緩沖液5 μL；dNTPs 4 μL；pHH21-PB1質(zhì)粒 0.25 μL；上游引物 1 μL；下游引物 1 μL； H2O 38.5 μL。PCR的條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s；72 ℃ 10 min ，共設(shè)30個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物全部進(jìn)行TAE電泳后用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。PCR 產(chǎn)物純化按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將其經(jīng) EcoRⅠ和 Hind Ⅲ雙酶切后，克隆于 pET-30a 中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Top 10 感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切及PCR驗(yàn)證。

1.2.2His-PB1 (aa 550–755) 融合蛋白的原核表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，待菌液OD600值至0.4?0.6時(shí)，經(jīng)終濃度0.8 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 誘導(dǎo)表達(dá)，采用SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。重組蛋白在8 mol/L尿素存在的變性條件下鎳柱親和純化蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3His-PB1 (aa 550–755) 融合蛋白多克隆抗體的制備及純化

將純化后的His-PB1 (aa 550?755) 融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化并對(duì)成年雄性家兔頸背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，每次注射蛋白用量為0.5 mg；每隔兩周免疫1次，免疫3次后從家兔耳源靜脈采血，間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)；最終收集免疫后的家兔血清加入0.01%的疊氮化鈉于–20 ℃保存。將得到的抗血清進(jìn)行親和純化。

將PB1融合蛋白抗原蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜 (150 mA，40 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，麗春紅染液染色，TBST脫色后將膜上顯示目的蛋白的條帶剪碎加至15 mL離心管中，加入9 mL PBS、900 μL抗血清及100 μL 1 mol/L Tris (pH 9.0)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗脫 (10 min×3 次)。向離心管中加入200 μL10 mmol/L的甘氨酸 (pH 2.7)，室溫孵育1 h，將溶液吸出轉(zhuǎn)到另一個(gè)柱子中，加入8 μL1.5 mol/L Tris (pH 8.8)調(diào)節(jié)pH，穩(wěn)定抗體。

1.2.4ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

96孔板每孔加入100 μL蛋白稀釋液。免疫家兔后的抗血清梯度稀釋后按每孔100 μL的量加至蛋白稀釋液。封板，4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，PBST (含有0.5% Tween的PBS) 洗3遍，每孔加入100 μL 2.5%脫脂奶粉靜置封閉1 h，PBST 洗3遍，每孔加入100 μL抗兔二抗，室溫靜置1 h，PBST洗3遍，每孔加入100 μL顯色液，37 ℃靜置30 min，每孔加入50 μL H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處OD值。

1.2.5Western blotting檢測(cè)PB1抗體靈敏度及特異性

293T細(xì)胞感染MOI=0.5的流感病毒或者轉(zhuǎn)染FLAG-PB1真核表達(dá)質(zhì)粒，細(xì)胞裂解液處理之后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜 (濕法轉(zhuǎn)膜) 200 mA恒流轉(zhuǎn)50 min，5%的脫脂奶粉封閉1 h，將抗體稀釋后與膜室溫共孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，抗兔的二抗室溫孵育膜1 h，棄二抗，TBST洗膜10 min×3次，顯色。

2　結(jié)果

2.1PB1蛋白抗原表位的生物信息學(xué)分析

通過(guò)Protean軟件預(yù)測(cè)尋找PB1蛋白潛在的抗原表位，最終選擇了550–755這段氨基酸序列，PB1的基因序列來(lái)源于NCBI (GI：194352384)。如圖1所示，該序列表達(dá)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)多是β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，且氨基酸多為親水性氨基酸，可及性與可塑性都較高，這類(lèi)結(jié)構(gòu)多處于蛋白表面，利于與抗體的嵌合[12-13]，同源比對(duì)結(jié)果也表明該段序列高度保守。

2.2pET-30a-PB1 (aa 550–755) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以pHH21-PB1質(zhì)粒為模板對(duì)PB1基因1 648?2 265段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為 618 bp，將其克隆于pET-30a表達(dá)載體中，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與目的基因序列完全一致。

圖1　PB1蛋白抗原表位的選取Fig. 1 Selection of the antigenic epitopes of PB1. Chou-Fasman and Garnier were adopted to predict the second structure of PB1 protein. Hopp-woods were adopted to analyse the hydrophilicity of PB1 protein. Emini was adopted to analyse the solvent accessibility of PB1 protein. Karplus-Schulz was adopted to analyse the flexible region of PB1 protein. Jameson-Wolf was adopted to predict the potential antigenic epitopes of PB1 protein.

2.3重組蛋白的表達(dá)及純化

重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，分子量大小預(yù)測(cè)為24 kDa。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，顯示在24 kDa處出現(xiàn)特異性的目的條帶，與預(yù)期相符。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IPTG誘導(dǎo)后5?8 h均可見(jiàn)明顯大量的表達(dá)產(chǎn)物。同時(shí)超聲結(jié)果顯示，重組蛋白主要存在于超聲沉淀中，表明目的蛋白以包涵體的形式表達(dá)。將誘導(dǎo)8 h后的菌液離心，沉淀超聲后收取蛋白并進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明蛋白純化結(jié)果較好，如圖2所示。同時(shí)將純化后的His-PB1 (aa 550?755) 用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting鑒定，結(jié)果表明(圖3) 抗His的MAb與帶有His標(biāo)簽的融合重組蛋白特異性結(jié)合，也檢測(cè)到了該蛋白的表達(dá)。

圖2　His-PB1融合蛋白的純化Fig. 2 Purification of the His-PB1 fusion protein. E. coli BL21 bacteria were transformed with pET-30a (lane 1, 2) or pET-30a-PB1(lane 3, 4) and harvested at 8 h after IPTG induction (lane 2, 4). Lane 5 indicates the purified His-PB1 protein. The expression of protein was analysed by SDS-PAGE and stained by CBB. Arrow shows the expression of His-PB1 fusion protein. M: protein marker.

圖3　His-PB1融合蛋白的Western blotting鑒定Fig. 3 Identification of the His-PB1 fusion protein by Western blotting. E. coli BL21 bacteria were transformed with pET-30a (lane 1) or pET-30a-PB1 (lane 2) and harvested at 8 h after IPTG induction. Lane 3 indicates the purified His-PB1 protein. The expression of protein was analysed by Western blotting and immunoblotted with anti-His tag antibody.

2.4ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

純化后蛋白經(jīng)BCA試劑盒測(cè)得濃度為0.58 g/L。將所得抗原免疫家兔，取免疫前血清，二次免疫后血清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)。ELISA結(jié)果表明所得兔源PB1多克隆抗體效價(jià)至少為1∶100 000 (圖4)。

圖4　ELISA檢測(cè)兔源PB1多克隆抗體效價(jià)Fig. 4 Detection of the polyclonal antibody titer of PB1 by indirect ELISA. Serum from rabbit immunized with PB1 fusion protein was added to the PB1 protein in dilution of 1:1 000, 1:10 000, 1:100 000 and 1:1 000 000. Serum from rabbit before immunization was added as negative control. The OD450was then detected.

2.5抗PB1重組蛋白多克隆抗體特異性鑒定及效價(jià)分析

Western blotting鑒定純化的抗PB1多克隆抗體與FLAG-PB1及病毒PB1蛋白結(jié)合的特異性，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖5A所示。結(jié)果表明純化后的抗體與過(guò)表達(dá)的FLAG-PB1以及流感病毒W(wǎng)SN毒株的PB1蛋白均能發(fā)生特異性反應(yīng)，且條帶單一，表明特異性較好。同時(shí)該P(yáng)B1抗體也可以與其他亞型如H3N2、H9N2流感病毒的PB1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，結(jié)果如圖5B所示。將制備的PB1多克隆抗體與購(gòu)自Santa 的PB1抗體進(jìn)行比較，結(jié)果顯示PB1多克隆抗體的靈敏度顯著高于商業(yè)化PB1抗體 (Santa I0303) (圖6)。

3　討論

流感病毒PB1蛋白是流感病毒聚合酶復(fù)合體的組分之一，在流感病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。為更好地研究PB1蛋白的功能及其與宿主細(xì)胞因子的相互作用，本實(shí)驗(yàn)制備了靈敏度及特異性都較好的抗PB1多克隆抗體。我們首次選取了PB1蛋白550–755段氨基酸序列作為抗原免疫家兔，該段親水性、可塑性、可及性都較好，是較為理想的抗原表位。同源比對(duì)結(jié)果表明該段蛋白區(qū)域在不同亞型A型流感病毒毒株中高度保守。免疫家兔獲得了高效價(jià)的兔源的PB1蛋白多克隆抗體。獲得的多克隆抗血清經(jīng)膜親和純化后實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明效價(jià)及特異性都較好，其靈敏度顯著高于購(gòu)買(mǎi)的PB1抗體 (Santa I0303)，且能夠與不同亞型的A型流感病毒PB1蛋白特異性結(jié)合，為人們研究流感病毒聚合酶或制備PB1抗體提供了思路。

圖5　Western blotting檢測(cè)PB1多克隆抗體的特異性Fig. 5 Detection of the specificity of the PB1 polyclonal antibody. (A) 293T cells were infected with WSN influenza virus at MOI of 0.5 or transfected with FLAG-PB1 expressing plasmid and harvested 14 h after infection or 24 h after transfection. Total cell extracts were prepared for immunoblotting with indicated antibodies. 293T cells without any treatment were used as negative control. (B) 293T cells were infected separately with WSN, H3N2, H9N2 influenza virus at MOI of 0.5 and harvested 14 h after infection. Total cell extracts were prepared for immunoblotting with indicated antibodies. 293T cells without any treatment were used as negative control.

圖6　PB1多克隆抗體與商業(yè)化PB1抗體靈敏度及特異性比較Fig. 6 Comparison of the specificity and sensitivity between anti-PB1 polyclonal antibody and commercial PB1 antibody. 293T cells were infected with WSN influenza virus at MOI of 0.5 and harvested 14 h after infection. Total cell extracts were prepared for immunoblotting with indicated antibodies. 293T cells without any treatment were used as negative control.

本實(shí)驗(yàn)原核表達(dá)的抗原蛋白以包涵體的形式存在于原核表達(dá)菌株中。一般而言，包涵體的形成主要有兩方面的因素：一方面是因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)效率太高，使得表達(dá)的蛋白無(wú)法正常折疊而發(fā)生聚集，另一方面可能是因?yàn)樗械陌腚装彼釟埢纬闪随滈g的二硫鍵，影響了蛋白質(zhì)的正確折疊[14-15]。通常情況下會(huì)通過(guò)采用利用分子伴侶共表達(dá)、降低IPTG誘導(dǎo)濃度或者降低蛋白表達(dá)溫度等手段得到可溶性表達(dá)的蛋白[16-17]。實(shí)驗(yàn)中雖然采用不同IPTG誘導(dǎo)濃度，不同的誘導(dǎo)溫度 (4 ℃、16 ℃、20 ℃、37 ℃)，蛋白仍以包涵體的形式表達(dá)。故選擇在變性條件下鎳柱親和純化包涵體蛋白，達(dá)到了較好的純化效果。

本文中作為抗原免疫家兔的蛋白為變性后的蛋白，未經(jīng)復(fù)性處理。變性蛋白作為抗原免疫家兔時(shí)，抗原中含有8 mol/L的尿素，可能使家兔產(chǎn)生一定的免疫反應(yīng)。同時(shí)由于變性蛋白做抗原獲得的抗體識(shí)別的是蛋白的線性表位，故而抗體可以用于Western blotting實(shí)驗(yàn)，但是只有當(dāng)該段抗原同時(shí)位于處于天然狀態(tài)下的蛋白表面時(shí)，該抗體才可以識(shí)別對(duì)應(yīng)的天然蛋白，即可用于免疫共沉淀、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明該段抗體不能應(yīng)用于該類(lèi)實(shí)驗(yàn)，可能正是因?yàn)镻B1蛋白的550?775段的氨基酸位于天然構(gòu)象的PB1蛋白的內(nèi)部，故以其為抗原制備的抗體不能夠識(shí)別天然狀態(tài)下的PB1蛋白，但是可以用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)也證明該抗體在Western blotting實(shí)驗(yàn)中的靈敏度及特異性都較好。

免疫家兔得到的抗血清成分比較復(fù)雜，使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多的非特異性信號(hào)，需要純化才可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室一般采用的抗體純化方法有分級(jí)沉淀、柱純化以及膜純化等[14]。在柱純化中，抗原與微珠以氫鍵、疏水堆積等作用力相結(jié)合，而抗原與抗體特異性結(jié)合的作用力也是如此，因此抗體洗脫步驟格外重要，洗脫條件太劇烈會(huì)導(dǎo)致抗原一同被洗脫下來(lái)，太溫和洗脫下的抗體量將大大減少[18]，因此抗體的純化質(zhì)量不能夠保證。本實(shí)驗(yàn)采用的膜純化方法是利用抗原抗體的特異性結(jié)合特性，進(jìn)而通過(guò)低pH的甘氨酸洗脫，雖然得到的抗體的量相對(duì)柱純化較少，但是純度更好，且操作簡(jiǎn)單易行[19]。經(jīng)ELISA及Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，純化得到的抗體的效價(jià)達(dá)到100 000且特異性較好，為進(jìn)一步研究流感病毒PB1蛋白與病毒各組分以及宿主細(xì)胞因子的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Samji T. Understanding the viral life cycle. Yale J Biol Med, 2009, 82(4): 153–159.

[2] Wu Y, Wu Y, Tefsen B, et al. Bat-derived influenza-like viruses H17N10 and H18N11. Trends Microbiol, 2014, 22(4): 183–191.

[3] Muramoto Y, Noda T, Kawakami E, et al. Identification of novel influenza A virus proteins translated from PA mRNA. J Virol, 2012, 87(5): 2455–2462.

[4] Tafforeau L, Chantier T, Pradezynski F, et al. Generation and comprehensive analysis of an influenza virus polymerase cellular interaction network. J Virol, 2011, 85(24): 13010–13018.

[5] Poch O, Sauvaget I, Delarue M, et al. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J, 1989, 8(12): 3867–3874.

[6] Asano Y, Ishihama A. Identification of two nucleotide-binding domains on the PB1 subunit of influenza virus RNA polymerase. J Biochem, 1997, 122(3): 627–634.

[7] González S, Zürcher T, Ortín J. Identification of two separate domains in the influenza virus PB1 protein involved in the interaction with the PB2 and PA subunits a model for the viral RNA polymerase structure. Nucleic Acids Res, 1996, 24(22): 4456–4463.

[8] González S, Ortín J. Distinct regions of influenza virus PB1 polymerase subunit recognize vRNA and cRNA templates. EMBO J, 1999, 18(13): 3767–3775.

[9] Jung TE, Brownlee GG. A new promoter-binding site in the PB1 subunit of the influenza A virus polymerase. J Gen Virol, 2006, 87(3): 679–688.

[10] Gíria M, de Andrade HR. Genetic evolution of PB1 in the zoonotic transmission of influenza A (H1) virus. Infect Genet Evol, 2014, 27: 234–243.

[11] Biswas SK, Nayak DP. Mutational analysis of the conserved motifs of influenza A virus polymerase basic protein 1. J Virol, 1994, 68(3): 1819–1826.

[12] Yang QH, Wang XW, Jin Y, et al. Prediction of the B cell epitope for MUC1 antigen. Med Militaris Tertiae, 2005, 27(5): 406–409 (in Chinese).楊清浩, 王祥衛(wèi), 金燕, 等. MUC1抗原的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè). 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 27(5): 406–409.

[13] Apostolopoulos V, Yu M, Corper AL, et al. Crystal structure of a non-canonical low-affinity peptide complexed with MHC class I: a new approach for vaccine design. J Mol Biol, 2002, 318(5): 1293–1305.

[14] Wang Z, Dai R, Zhang JW, et al. Induced expression of Arabidopsis thaliana WUSCHEL in Escherichia coli, affinity protein purification and polyclonal antibody preparation. Chin J Biotech, 2009, 25(9): 1409–1416 (in Chinese).王增, 代茹, 張江巍, 等. 擬南芥WUSCHEL蛋白的原核表達(dá)、親和純化和多克隆抗體制備. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(9): 1409–1416.

[15] Wang Z, Ma HQ, Zhang W, et al. The progress of inclusion body isolation and chromatographic refolding, purification methods. China Biotechnol, 2009, 29(7): 102–107 (in Chinese).王增, 馬會(huì)勤, 張文, 等. 包涵體蛋白的分離和色譜法體外復(fù)性純化研究進(jìn)展. 中國(guó)生物工程雜志, 2009, 29(7): 102–107.

[16] Swietnicki W. Folding aggregated proteins into functionally active forms. Curr Opin Biotechnol, 2006, 17(4): 367–372.

[17] Lin GZ, Lian YJ, Ryu JH, et al. Expression and purification of His-tagged flavonol synthase of Camellia sinensis from Escherichia coli. Protein Expr Purif, 2007, 55(2): 287–292.

[18] Shu W, Li FH, Deng M, et al. Preparation, purification the antibody and immunofluorescence analyse of ANKRD17. Lett Biotechnol, 2007, 18(5): 771–773 (in Chinese).舒?zhèn)? 李發(fā)慧, 鄧敏, 等. ANKRD17蛋白抗體的制備、純化及檢測(cè). 生物技術(shù)通訊, 2007, 18(5): 771–773.

[19] Cai R, Ye X. Preparation, purification and identification of the polyclonal antibody of PHD finger protein 8. Chin J Biotech, 2010, 26(3): 393–397 (in Chinese).蔡榮, 葉昕. PHD finger protein 8蛋白多克隆抗體的制備、純化與檢測(cè). 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(3): 393–397.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Preparation and detection of anti-influenza A virus polymerase basic protein 1 polyclonal antibody

Yujie Qin, Tinghong Zhang, and Xin Ye
Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Abstract:Influenza A virus is an enveloped virus that belongs to the Orthomyxoviridae family. It has 8 negative RNA segments that encode 16 viral proteins. The viral polymerase consists of 3 proteins (PB1, PB2 and PA) which plays an important role in the transcription and replication of the influenza A virus. Polymerase basic protein 1 (PB1) is a critical member of viral polymerase complex. In order to further study the function of PB1, we need to prepare the PB1 antibody with good quality. Therefore, we amplified PB1 conserved region (nt1648–2265) by PCR and cloned it into pET-30a vector, and transformed into Escherichia coli BL21. The expression of His tagged PB1 protein was induced by IPTG, and His-PB1 proteins were purified by Ni-NTA resin. For preparation of PB1 protein antiserum, rabbits were immunized with His-PB1 fusion protein 3 times. Then the titer of PB1 polyclonal antibody was measured by indirect ELISA. The antibody was purified by membrane affinity purification and subjected to immunoblotting analysis. Data showed that PB1 antibody can recognize PB1 protein from WSN virus infected or pCMV FLAG-PB1 transfected cells. Meanwhile, PB1 antibody can also recognize specifically other subtype strains of influenza A virus such as H9N2 and H3N2. PB1 polyclonal antibody we generated will be a useful tool to study the biological function of PB1.

Keywords:influenza A virus, PB1, polyclonal antibody, affinity purification

DOI:10.13345/j.cjb.150103

Corresponding author:Xin Ye. Tel: +86-10-64807508; E-mail: yex@im.ac.cn