陸海榮，張宜濤，黃青山

1 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，上海 2012062 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 遺傳學(xué)研究所 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

?

重組溶葡萄球菌酶的PEG定點(diǎn)修飾

陸海榮1,2，張宜濤1，黃青山1,2

1 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司，上海 201206
2 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 遺傳學(xué)研究所 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

陸海榮, 張宜濤, 黃青山. 重組溶葡萄球菌酶的PEG定點(diǎn)修飾. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 127–134.

Lu HR, Zhang YT, Huang QS. Site-specific PEGylation of recombinant lysostaphin. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 127–134.

摘 要:為獲得高抗菌活性聚乙二醇 (PEG) 定點(diǎn)修飾的溶葡萄球菌酶 (Lysn)，根據(jù)該酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，在它的催化域和結(jié)合域上優(yōu)選8個(gè)位點(diǎn) (Q9、N13、N40、T172、N174、G197、V240和T244)，將其分別突變成半胱氨酸，純化后的溶葡萄球菌酶突變體經(jīng)DTT處理后與20 kDa的單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺 (mPEG-MAL)進(jìn)行定點(diǎn)修飾反應(yīng)，RP-HPLC分析顯示PEG修飾率大于70%，修飾產(chǎn)物經(jīng)MacroCap SP陽(yáng)離子交換層析純化后，PEG化溶葡萄球菌酶的純度大于95%。比濁法和最小抑菌濃度 (MIC) 實(shí)驗(yàn)表明20K-PEG-LysnV240C和20K-PEG-LysnT244C的抗菌活性維持在原來(lái)的50%左右。研究結(jié)果為溶葡萄球菌酶全身給藥治療金黃色葡萄球菌感染奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:溶葡萄球菌酶，金黃色葡萄球菌，抗菌活性，最小抑菌濃度

Received: March 11, 2015; Accepted: May 21, 2015

Supported by: China Postdoctoral Science Foundation (No. 2014M551322), Post-doctor Research Foundation Project of Shanghai (No. 14R21421300), Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms (No. 13DZ2252000).

中國(guó)博士后科學(xué)基金 (No. 2014M551322)，上海市博士后科研資助計(jì)劃 (No. 14R21421300)，上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心(No. 13DZ2252000) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-06-08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150608.1417.002.html

金黃色葡萄球菌是臨床主要病原菌，它能引起肺炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等多種感染性疾病[1-2]。隨著抗生素的廣泛使用，金葡菌耐藥性問(wèn)題日益突出，尤其是耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)[3-4]。MRSA已經(jīng)造成臨床治療上的困難及病死率增高，嚴(yán)重威脅人類健康[5-6]。

溶葡萄球菌酶 (Lysostaphin，Lysn) 是1964 年Schindler和Schuhar[7]首次從模仿葡萄球菌培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)并分離的一種細(xì)菌素。它是一種含鋅的金屬蛋白酶，由特異性靶向細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和高效水解葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖中甘氨酸肽鍵的催化結(jié)構(gòu)域組成 (圖1)。Lysn通過(guò)溶解細(xì)菌細(xì)胞壁，從而達(dá)到殺菌目的，其對(duì)葡萄球菌 (包括MRSA) 具有很強(qiáng)的殺菌作用 (MICs在0.003–0.125 μg/mL之間)[8]，并且不容易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株。但由于Lysn的體內(nèi)半衰期非常短 (<1 h)[9]，它的臨床應(yīng)用還停留在局部外用階段，主要用于治療創(chuàng)面金葡菌感染和清除鼻部定殖的金葡菌[10-13]。

如何改善Lysn的體內(nèi)穩(wěn)定性，是擴(kuò)大其臨床應(yīng)用所面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了Lysn的PEG修飾方面的工作。Walsh等[14]報(bào)道通過(guò)偶聯(lián)PEG到Lysn的賴氨酸，PEG化Lysn的體內(nèi)半衰期從原來(lái)的不到1 h提高至24 h以上；同時(shí)，ELISA檢測(cè)顯示，PEG化Lysn抗體的產(chǎn)生水平比PEG化前降低了10倍以上，說(shuō)明Lysn經(jīng)PEG化后，不但延長(zhǎng)了其體內(nèi)半衰期，而且顯著降低了抗體產(chǎn)生。然而由于是非定點(diǎn)修飾 (Lysn有16個(gè)賴氨酸可被修飾)，修飾后產(chǎn)物的異構(gòu)體多，其中大部分位點(diǎn)的修飾會(huì)降低Lysn與細(xì)菌細(xì)胞壁 (大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)) 的親和力，導(dǎo)致生物活性急劇下降。最近，王永等[15]同樣也進(jìn)行了Lysn的PEG非定點(diǎn)修飾工作，獲得的PEG-Lysn的生物活性只有原來(lái)的25%。吳宏等[16]在Lysn兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)引入半胱氨酸，再進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾 (偶聯(lián)PEG至半胱氨酸的巰基)，雖然產(chǎn)物單一，但抗菌活性只有修飾前的20%左右。

之前PEG修飾Lysn研究的一個(gè)重要限制因素是該酶的空間結(jié)構(gòu)尚不明確，因此只有充分了解Lysn的作用機(jī)制以及兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互關(guān)系，才能更好地進(jìn)行該酶的PEG修飾。最近我們[17]和Sabala等[18]對(duì)Lysn高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，闡明了該酶高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的作用依賴于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間一定范圍內(nèi)的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。為獲得高抗菌活性PEG定點(diǎn)修飾的Lysn，本文根據(jù)Lysn高級(jí)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選8個(gè)位點(diǎn)，將其分別突變成半胱氨酸，再進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾，并進(jìn)一步用比濁法和最小抑菌濃度 (MIC) 法評(píng)價(jià)了PEG化Lysn的體外抗菌活性。

1　材料與方法

1.1材料

表達(dá)載體pET28a(+)、大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3) 購(gòu)自Novagen公司；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；DNA marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；定點(diǎn)突變引物由上海生工生物工程有限服務(wù)公司合成；QuikChange lightning site-directed mutagenesis kit購(gòu)自Stratagene公司；mPEG-MAL (單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺)購(gòu)自北京鍵凱科技有限公司；

1.2Lysn的表達(dá)和純化

為在大腸桿菌中表達(dá)Lysn，在編碼成熟Lysn基因的5?端引入NcoⅠ位點(diǎn)和編碼OmpA信號(hào)肽的基因序列；在其3?端引入Hind Ⅲ位點(diǎn)。OmpA-Lysn基因片段經(jīng)NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，割膠回收OmpA-Lysn基因片段，克隆到pET28a(+) 載體的NcoⅠ和Hind Ⅲ位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-OmpA-Lysn，陽(yáng)性克隆送上海英駿生物公司測(cè)序。將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)Lysn的工程菌。

挑單克隆接種于LB培養(yǎng)液 (含30 mg/L卡那霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1%接種到相同的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至光密度值 (波長(zhǎng)600 nm) 約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)4 h左右，離心收集發(fā)酵上清，保存于4 ℃。

將離心后發(fā)酵上清進(jìn)樣至預(yù)先用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 9.0)平衡的Capto MMC陽(yáng)離子交換層析柱 (26 mm×60 mm)，用含1.0 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集目的峰。收集峰經(jīng)超濾濃縮后，進(jìn)樣至Sephadex G50凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行精純，用含150 mmol/L NaCl 的PBS緩沖液 (pH 7.0) 進(jìn)行洗脫，收集目的峰。純化后的樣品經(jīng)超濾濃縮后置于–20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

用12% SDS-PAGE測(cè)定重組蛋白樣品的大小和純度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用BCA (Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸) 法測(cè)定蛋白濃度。

1.3Lysn半胱氨酸 (Cysteine，Cys) 突變體的表達(dá)和純化

Lysn不含Cys，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)在擬PEG修飾的位置引入一個(gè)Cys，利用Cys的巰基和mPEG-MAL的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。為減少PEG修飾對(duì)Lysn生物活性的影響，我們根據(jù)Lysn的高級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)選8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Cys突變，如圖1所示。擬突變的位點(diǎn)需要滿足3個(gè)條件：必須在分子表面；不在結(jié)構(gòu)域的活性中心一側(cè)；不在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相互作用界面上。

為表達(dá)Lysn突變體，設(shè)計(jì)合成系列引物，以pET28a-OmpA-Lysn為模板，按照QuikChange?lightning site-directed mutagenesis試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用DpnⅠ消化模板，然后轉(zhuǎn)化DH5α。挑克隆測(cè)序分析，將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)Lysn突變體的工程菌。蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化方法同上。

圖1　溶葡萄球菌酶中8個(gè)Cys突變位點(diǎn)Fig. 1 Eight selected sites in lysostaphin for cysteine substitutions.

1.4比濁法測(cè)定重組蛋白抗菌活性

采用比濁法[19]，在特定條件下細(xì)菌懸液濁度下降值代表Lysn的酶活。將過(guò)夜培養(yǎng)的金葡菌 (ATCC 6538) 轉(zhuǎn)接后生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期 (OD600大約0.5)，離心 (5 000 ×g，5 min) 收集菌體。菌體用PBS (pH 7.2) 清洗2次，然后重懸于含150 mmol/L NaCl的PBS緩沖液中 (OD600約為1.0)。在比色皿中加入20 μL樣品 (0.5 mg/mL) 和2 mL的菌懸液，室溫 (25 ℃) 下在分光光度計(jì)600 nm波長(zhǎng)下讀數(shù) (間隔1 min，共15 min)。

1.5重組蛋白的PEG修飾以及純化

將純化獲得的Lysn突變體用20 mmol/L的DTT處理 (室溫15 min)，DTT處理的樣品經(jīng)SP-650M陽(yáng)離子柱純化去除DTT。將洗脫峰與分子量20 kDa的mPEG-MAL修飾劑按1∶5摩爾比混合，再加入10%的DMSO，于4 ℃反應(yīng)2–3 h，RP-HPLC分析PEG修飾率。反應(yīng)混合物與純水1∶5稀釋后，進(jìn)樣至預(yù)先用50 mmol/L NaAc緩沖液 (pH 4.5) 平衡的MacroCap SP陽(yáng)離子交換層析柱 (16 mm×30 mm)，用含1.0 mol/L NaCl 的Tris-HCl緩沖液 (pH 9.0) 梯度洗脫，收集目的峰。純化后的樣品置于–20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。?2% SDS-PAGE測(cè)定PEG修飾樣品的大小和純度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用BCA法測(cè)定PEG修飾樣品的蛋白濃度。

1.6最小抑菌濃度 (MIC) 檢測(cè)

采用二倍稀釋法測(cè)定MIC。將金黃色葡萄球菌ATCC6538復(fù)蘇，細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)過(guò)MH液體培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋至細(xì)菌濃度為104–105CFU/mL，備用。待檢樣品用MH培養(yǎng)基二倍稀釋成各種所需濃度，分別加100 μL到96孔板中，再加入100 μL含受試菌液的MH培養(yǎng)基到96孔板中與待檢樣品混勻，置35 ℃培養(yǎng)18–24 h后觀察結(jié)果。肉眼未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的樣品孔中所含藥物最小的濃度即為MIC值。

2　結(jié)果

2.1Lysn及其突變體的表達(dá)和純化

根據(jù)Lysn的高級(jí)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Cys突變。通過(guò)QuikChange?lightning site-directed mutagenesis點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建8個(gè)Lysn突變體的表達(dá)載體，DNA測(cè)序結(jié)果顯示突變體的DNA序列均正確。

將表達(dá)Lysn和Lysn突變體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Lysn在信號(hào)肽的作用下分泌至發(fā)酵上清中。經(jīng)Capto MMC陽(yáng)離子交換和Sephadex G50凝膠排阻純化，SDS-PAGE顯示重組蛋白位于27 kDa處，與理論分子量 (26 941 Da) 相符，且純度大于95% (圖2)。

圖2　溶葡萄球菌酶半胱氨酸突變體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of single cysteine substitutions in lysosatphin.

2.2重組蛋白的生物活性測(cè)定

采用比濁法[19]測(cè)定重組Lysn及其Cys突變體的生物活性。結(jié)果顯示，與Lysn的溶菌活性相比，突變體N40C、V240C和T244C的活性基本沒(méi)有下降，分別為L(zhǎng)ysn酶活性的95%、100% 和98%；突變體Q9C和G197C的活性有輕微下降，分別為L(zhǎng)ysn酶活性的88%和91%；而突變體N13C、T172C和N174C的活性下降了近20%，為L(zhǎng)ysn酶活性的82%、81%和83% (圖3)。說(shuō)明這些位點(diǎn)的突變對(duì)Lysn的結(jié)構(gòu)和功能影響并不明顯，純化獲得的突變體可進(jìn)一步用于PEG修飾。

2.3PEG定點(diǎn)修飾及PEG-Lysn的純化

將Lysn突變體與mPEG-MAL (分子量20 kDa) 按1:5摩爾比4 ℃反應(yīng)2–3 h后，RP-HPLC分析結(jié)果顯示Lysn突變體的PEG修飾率大于70%(數(shù)據(jù)未顯示)。將mPEG-MAL與Lysn的反應(yīng)液經(jīng)MacroCap SP柱純化。通過(guò)梯度洗脫，PEG-Lysn最先被洗脫下來(lái)。Lysn被PEG修飾后，蛋白分子表面的帶電基團(tuán)被PEG覆蓋，導(dǎo)致PEG-Lysn帶電荷比Lysn少，因此與MacroCap SP陽(yáng)離子純化介質(zhì)的結(jié)合能力減弱。SDS-PAGE顯示經(jīng)純化后的PEG-Lysn的純度達(dá)到了95%以上 (圖4)。電泳顯示PEG-Lysn位于70 kDa處，比理論分子量 (47 kDa) 大，可能是由于線性PEG分子在SDS-PAGE中的泳動(dòng)速度比橄欖型蛋白分子慢所致。

圖3　溶葡萄球菌酶Cys突變體的生物活性分析Fig. 3 The bacteriolytic activities of single cysteine substitutions in lysosatphin.

圖4　PEG修飾溶葡萄球菌酶的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of PEGylated lysostaphin. M: protein marker; 1: single-cysteine mutant (LysnQ9C); 2: PEGylation reaction mixture; 3: purified 20K-PEG-LysnQ9C.

2.4PEG-Lysn的生物活性測(cè)定

采用比濁法和MIC法測(cè)定PEG-Lysn的生物活性。結(jié)果顯示，與Lysn的溶菌活性相比，突變體V240C和T244C經(jīng)PEG修飾后的生物活性保留較高，分別為L(zhǎng)ysn酶活性的45%和51%；突變體N174C和G197C經(jīng)PEG修飾后的生物活性有明顯下降，分別為L(zhǎng)ysn酶活性的29%和36%；而突變體Q9C、N13C、N40C和T174C經(jīng)PEG修飾后活性急劇下降，分別只有Lysn酶活性的9%、11%、20%和23% (圖5)。

MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20K-PEG-LysnT244C 和20K-PEG-LysnV240C對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 6538的MIC均為0.25 μg/mL，MIC值是Lysn的2倍。其他PEG-Lysn的MIC值在0.5–1.0 μg/mL之間，抗菌活性明顯低于Lysn (表1)。

3　討論

病原菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，尤其是MRSA，因此迫切需要研發(fā)具有新型作用模式的抗菌藥物。近年來(lái)，抗菌蛋白 (包括細(xì)菌素、噬菌體裂解酶、細(xì)菌自溶素等) 因其能高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁而具有很好的應(yīng)用前景[20-23]。其中Lysn的研究最為廣泛[24]，它作為治療創(chuàng)面金葡菌感染的新藥，目前處于臨床III期研究階段。但由于Lysn的體內(nèi)半衰期問(wèn)題，它只能局部外用。PEG修飾已被廣泛應(yīng)用于蛋白類藥物，它能顯著延長(zhǎng)藥物體內(nèi)半衰期并減少免疫原性，增強(qiáng)藥物的生物利用度[25-26]。目前有多個(gè)PEG修飾藥物已經(jīng)上市銷售，還有大量PEG 修飾藥物處于臨床研究階段，然而前期PEG修飾Lysn的研究進(jìn)展并不順利[14-16]。

圖5　PEG化溶葡萄球菌酶的生物活性分析Fig. 5 The bacteriolytic activities of PEGylated lysostaphin.

為獲得高生物活性的PEG-Lysn，本研究基于Lysn最新研究的高級(jí)結(jié)構(gòu)，在其分子表面優(yōu)選8個(gè)位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)分別引入Cys，完成8個(gè)突變體的構(gòu)建、表達(dá)和生物活性分析。進(jìn)一步建立了簡(jiǎn)便可控、適合放大的PEG修飾和純化工藝。由于是定點(diǎn)修飾，因此不存在多P E G修飾產(chǎn)物或者同分異構(gòu)體，降低了PEG-Lysn質(zhì)量控制的難度。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在PEG修飾前通過(guò)DTT處理，能顯著提高PEG的修飾率，這可能是由于在表達(dá)和純化過(guò)程中部分巰基已經(jīng)被氧化，導(dǎo)致無(wú)法被mPEG-MAL修飾，經(jīng)過(guò)快速DTT處理，還原Cys上的巰基。PEG修飾可以延長(zhǎng)Lysn的體內(nèi)半衰期，從而延長(zhǎng)體內(nèi)作用時(shí)間，但由于引入的PEG會(huì)對(duì)Lysn與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合產(chǎn)生空間位阻，使其溶菌活性急劇下降。之前，王永等[15]和吳宏等[16]的研究結(jié)果表明，Lysn分子中賴氨酸的隨機(jī)PEG修飾產(chǎn)物和Lysn兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間linker處的定點(diǎn)PEG修飾產(chǎn)物的溶菌活性都顯著下降。與這些報(bào)道相似，我們?cè)谘芯窟^(guò)程中也發(fā)現(xiàn)催化域上的一些位點(diǎn) (LysnQ9C和LysnN13C) 經(jīng)PEG修飾后，其溶菌活性只有修飾前的10%左右 (圖5)，提示這些位點(diǎn)的PEG修飾嚴(yán)重影響了Lysn催化域與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合。

表1　Lysn和PEG-Lysn對(duì)金葡菌的最小抑菌濃度(MIC)Table 1 Antibacterial activity of Lysn and PEG-Lysn against Staphylococcus aureus (ATCC 6538)

當(dāng)我們?cè)谖挥贚ysn結(jié)合域的LysnT244C和LysnV240C進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾后發(fā)現(xiàn)，修飾產(chǎn)物的生物活性能維持在原來(lái)的50%左右，可能是由于這些位點(diǎn)的修飾對(duì)Lysn結(jié)合域與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合的影響相對(duì)較??；同時(shí)，這些位點(diǎn)遠(yuǎn)離Lysn催化域和結(jié)合域的相互作用界面，因此也不會(huì)影響兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)作。由于本研究中選擇PEG修飾的位點(diǎn)數(shù)量有限，不排除有更好的位點(diǎn)可被用來(lái)PEG修飾，從而進(jìn)一步提高PEG-Lysn的生物活性。在下一步工作中，將通過(guò)金葡菌感染動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證高活性PEG-Lysn的體內(nèi)生物學(xué)活性。

REFERENCES

[1] Lowy FD. Medical progress: Staphylococcus aureus infections. New Engl J Med, 1998, 339(8): 520–532.

[2] Whitby M, McLaws ML, Berry G. Risk of death from methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia: a meta-analysis. Med J Aust, 2001, 175(5): 264–267.

[3] Chambers HF, Deleo FR. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era. Nat Rev Microbiol, 2009, 7(9): 629–641.

[4] Hu FP, Zhu DM, Wang F, et al. CHINET 2013 surveillance of bacterial resistance in China. Chin J Infect Chemother, 2014, 14(5): 369–378 (in Chinese).胡付品, 朱德妹, 汪復(fù), 等. 2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè). 中國(guó)感染與化療雜志, 2014, 14(5): 369–378.

[5] Dombrowski JC, Winston LG. Clinical failures of appropriately-treated methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections. J Infect, 2008, 57(2): 110–115.

[6] Schindler CA, Schuhardt VT. Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the Staphylococcus. Proc Natl Acad Sci USA, 1964, 51(3): 414–421.

[7] Lodise TP, Graves J, Evans A, et al. Relationship between vancomycin MIC and failure among patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia treated with vancomycin. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(9): 3315–3320.

[8] Yang XY, Li CR, Lou RH, et al. In vitro activity of recombinant lysostaphin against Staphylococcus aureus isolates from hospitals in Beijing, China. J Med Microbiol, 2007, 56(1): 71–76.

[9] Tang ZM, Liu XW, Song HF. Pharmacokinetics of Bio-technology Derived Drugs. Beijing: Chemical Industry Press, 2004: 300–302 (in Chinese).湯仲民, 劉秀文, 宋海峰. 生物技術(shù)藥物藥代動(dòng)力學(xué). 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 300–302.

[10] Quickel Jr KE, Selden R, Caldwell JR, et al. Efficacy and safety of topical lysostaphin treatmentof persistent nasal carriage of Staphylococcus aureus. Appl Microbiol, 1971, 22(3): 446–450.

[11] Chen L, Guo L, Xiong AB. Antibiotic effect of lysostaphin on granulation wound. Acta Acad Med Milit Tert, 2006, 28(14): 1517–1519 (in Chinese).陳莉, 郭力, 熊愛(ài)兵. 溶葡萄球菌酶對(duì)創(chuàng)面肉芽組織抗菌效果的臨床研究. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28(14): 1517–1519.

[12] Miao JJ, Pangule RC, Paskaleva EE, et al. Lysostaphin-functionalized cellulose fibers with antistaphylococcal activity for wound healing applications. Biomaterials, 2011, 32(36): 9557–9567.

[13] Belyansky I, Tsirline VB, Martin TR, et al. The addition of lysostaphin dramatically improves survival, protects porcine biomesh from infection, and improves graft tensile shear strength. J Surg Res, 2011, 171(2): 409–415.

[14] Walsh S, Shah A, Mond J. Improved pharmacokinetics and reduced antibody reactivity of lysostaphin conjugated to polyethylene glycol. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(2): 554–558.

[15] Wang Y, Liu MR, Wan HT, et al. Chemical modification of lysostaphin with activated polyethylene glycol. China Biotechnol, 2013, 33(6): 12–17 (in Chinese).王永, 劉沐榮, 萬(wàn)海同, 等. 聚乙二醇修飾重組溶葡球菌酶的初步研究. 中國(guó)生物工程雜志, 2013, 33(6): 12–17.

[16] Wu H, Fang W, Yuan J, et al. Site-directed mutagenesis and sulfhydryl PEGylation of lysostaphin. Chin J Biotech, 2011, 27(11): 1623–1630 (in Chinese).吳宏, 房偉, 袁璟, 等. 溶葡球菌酶的定點(diǎn)突變與 PEG巰基定點(diǎn)修飾. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(11): 1623–1630.

[17] Lu HR, Gu MG, Huang Q, et al. Hydrogen/ Deuterium exchange mass spectrometry and site-directed disulfide cross-linking suggest an important dynamic interface between the two lysostaphin domains. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(4): 1872–1881.

[18] Sabala I, Jagielska E, Bardelang PT, et al. Crystal structure of the antimicrobial peptidase lysostaphin from Staphylococcus simulans. FEBS J, 2014, 281(18): 4112–4122.

[19] Kusuma CM, Kokai-Kun JF. Comparison of four methods for determining lysostaphin susceptibility of various strains of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(8): 3256–3263.

[20] Villa TG, Crespo PV. Enzybiotics: Antibiotic Enzymes as Drugs and Therapeutics. Hoboken: John Wiley & Sons, 2010.

[21] Szweda P, Schielmann M, Kotlowski R, et al. Peptidoglycan hydrolases-potential weapons against Staphylococcus aureus. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(5): 1157-1174.

[22] Pastagia M, Schuch R, Fischetti VA, et al. Lysins: the arrival of pathogen-directed anti-infectives. J Med Microbiol, 2013, 62(10): 1506–1516.

[23] Rodríguez-Rubio L, Martínez B, Donovan DM, et al. Bacteriophage virion-associated peptidoglycan hydrolases: potential new enzybiotics. Crit Rev Microbiol, 2013, 39(4): 427–434.

[24] Kumar JK. Lysostaphin: an antistaphylococcal agent. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80(4): 555–561.

[25] Harris JM. Chess RB. Effect of PEGylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(3): 214–221.

[26] Pasut G. Veronese FM. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research. J Control Release, 2012, 161(2): 461–472.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及應(yīng)用

段文文，張陽(yáng)，許國(guó)強(qiáng)

江蘇省重大神經(jīng)精神疾病診療技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省老年病預(yù)防與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123

段文文, 張陽(yáng), 許國(guó)強(qiáng). 羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 135?148.

Duan WW, Zhang Y, Xu GQ. Optimization and application of protein C-terminal labeling by carboxypeptidase Y. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 135?148.

摘 要: 蛋白質(zhì)水解是一種重要的翻譯后修飾，它在許多生化過(guò)程 (如細(xì)胞凋亡和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等) 中起著極其重要的作用。鑒定蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)可以進(jìn)一步加深我們對(duì)這些生化過(guò)程的認(rèn)識(shí)。盡管蛋白質(zhì)氨基端標(biāo)記方法和蛋白質(zhì)組學(xué)在復(fù)雜生物體系中鑒定獲得了許多蛋白質(zhì)的水解位點(diǎn)，但這種方法存在固有的缺陷。羧基端標(biāo)記方法是另一種可行的鑒定蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)的方法。本文優(yōu)化了蛋白質(zhì)羧基端生物酶標(biāo)記方法，提高了親和標(biāo)記效率，從而可以更好地利用正向分離方法對(duì)蛋白質(zhì)羧基端多肽進(jìn)行分離并用質(zhì)譜鑒定。我們用優(yōu)化后的羧基端標(biāo)記方法來(lái)標(biāo)記大腸桿菌Escherichia coli復(fù)雜蛋白樣品后鑒定到了120多個(gè)蛋白質(zhì)羧基端多肽和內(nèi)切多肽。在其所鑒定的蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)中，我們發(fā)現(xiàn)了許多已知和未知的位點(diǎn)，這些新的水解位點(diǎn)有可能在正常生化過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。該研究提供了一個(gè)可以與蛋白質(zhì)氨基端組學(xué)互為補(bǔ)充、可在復(fù)雜體系中鑒定蛋白質(zhì)水解的方法。

關(guān)鍵詞: 羧肽酶Y，羧基端標(biāo)記，ProC-TEL，蛋白質(zhì)水解，蛋白質(zhì)組學(xué)

Received: March 11, 2015; Accepted: May 13, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31470772), Jiangsu Key Laboratory of Translational Research and Therapy for Neuro-Psycho-Diseases (No. BM2013003), the Priority Academic Program Development (PAPD) of Jiangsu Higher Education Institutions.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31470772)，江蘇省重大神經(jīng)精神疾病診療技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (No. BM2013003)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目 (PAPD) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-06-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150626.1508.001.html

Site-specific PEGylation of recombinant lysostaphin

Hairong Lu1,2, Yitao Zhang1, and Qingshan Huang1,2
1 Shanghai Hi-Tech United Bio-Technological R&D Co. Ltd., Shanghai 201206, China
2 State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Keywords:lysostaphin, Staphylococcus aureus, antibacterial activity, minimum inhibitory concentration

Abstract:Lysostaphin (Lysn) is an antibacterial metalloendopeptidase that cleaves the pentaglycin bridges in the cell wall of Staphylococci. Although many studies have demonstrated its high activity in vitro, the medical application of Lysn has been hampered by its short half-life in vivo. In order to enhance its stability in vivo without significantly suppressing theenzymatic activity, we designed and tested eight single cysteine substitutions in Lysn for covalent attachment of polyethylene glycol chains (PEGylation). The purified mutants, fully reduced by Dithiothreitol (DTT), were treated with mPEG-MAL(20 kDa). The PEG modification efficiency was above 70% as determined by reverse-phase high-pressure liquid chromatography (HPLC) analysis. The PEG-Lysn proteins were further purified by cation exchange chromatography (MacroCap SP), reaching at least 95% purity. The activities of the PEG-Lysn proteins were determined by the turbidity and minimum inhibitory concentration (MIC) assays. We found that the PEGylated V240C and T244C mutants retained about 50% of the original antibacterial activity of Lysn. Overall, this study will help develop highly stable and active PEG-Lysn to treat systemic S. aureus infections.

DOI:10.13345/j.cjb.150106 10.13345/j.cjb.150107

Corresponding author:Qingshan Huang. Tel: +86-21-65642814; E-mail: qshuang@fudan.edu.cn Guoqiang Xu. Tel: +86-512-65882723; E-mail: gux2002@suda.edu.cn