田吉騰， 侯 丫， 2， 劉志鴻， 楊愛國， 吳 彪， 周麗青， 董春光， 2（. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所， 山東 青島26607； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 20306）

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基于線粒體COI基因的毛蚶群體遺傳多樣性

田吉騰1， 侯 丫1， 2， 劉志鴻1， 楊愛國1， 吳 彪1， 周麗青1， 董春光1， 2
（1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所， 山東 青島266071； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306）

采用PCR 技術(shù)， 擴(kuò)增了大連、乳山、煙臺(tái)、舟山4個(gè)毛蚶（Scapharca subcrenata）地理群體共38個(gè)個(gè)體的線粒體COI 基因部分序列， 并分析了4個(gè)毛蚶群體的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究結(jié)果顯示： 38個(gè)毛蚶COI部分序列經(jīng)處理得到長度均為625bp的基因片段， 共分為30種單倍型； 基于COI部分序列的分析結(jié)果， 毛蚶4個(gè)地理群體總的變異位點(diǎn)為301個(gè)， 多樣性指數(shù)Pi為0.15048， 平均核苷酸差異數(shù)為92.242， 單倍型多樣性指數(shù)S為241。聚類分析顯示毛蚶大連群體、乳山群體和煙臺(tái)群體具有高度的遺傳多樣性， 3個(gè)群體交叉聚在一起， 沒有明顯的群體分化； 舟山群體單獨(dú)聚為一支， 與其他3個(gè)群體分化明顯。研究表明， 線粒體COI 基因不能單獨(dú)做為毛蚶大連、乳山和煙臺(tái)群體的遺傳標(biāo)記， 但可以作為毛蚶舟山群體的有效群體遺傳標(biāo)記， 為線粒體COI基因在群體遺傳學(xué)的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)資料。

毛蚶（Scapharca subcrenata）； COI 基因； 群體； 遺傳多樣性

［Foundation ： National Basic Research Special Foundation of China （2013FY110700）； Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes， Yellow Sea Fisheries Research Institutes （20603022013032）］

毛蚶（Scapharca subcrenata）， 俗稱瓦楞子或毛蛤，屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）， 雙殼綱（Bivalvia）， 翼形亞綱（Pteriomorphia）， 蚶目（Arcoida）， 蚶科（Arcidae），毛蚶屬（Scapharca）， 廣泛分布于中國、朝鮮和日本沿海［1］， 在中國的渤海、黃海、東海、南海均有大量分布， 是中國北方重要經(jīng)濟(jì)貝類之一。毛蚶普遍生活在低潮線以下， 至水深幾十米的海域， 喜歡棲息于軟泥質(zhì)底或泥沙質(zhì)底［2-3］。20世紀(jì)60～70年代， 毛蚶資源豐富， 曾為主要的捕撈對(duì)象之一。但由于捕撈強(qiáng)度過大， 毛蚶資源遭到了嚴(yán)重的破壞， 資源衰退。近年來， 毛蚶的增養(yǎng)殖工作以及各方面的研究已經(jīng)引起人們的重視［4］。迄今人們對(duì)于毛蚶的研究， 主要集中在親貝的促熟、苗種的培育和養(yǎng)成技術(shù)， 以及生理生化、生態(tài)習(xí)性、餌料需求等方面［4-7］， 分子遺傳多樣性方面未見報(bào)道。

群體遺傳多樣性水平與生物的生長速度、抗病能力和物種的進(jìn)化速度有重要的關(guān)系。近年來， 線粒體基因組的研究在一定程度上促進(jìn)了群體遺傳學(xué)的發(fā)展，并且實(shí)現(xiàn)了從分子水平上對(duì)自然群體的保護(hù)［8］。線粒體中的COI基因， 即線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基Ⅰ， 作為一種分子標(biāo)記， 具有多種優(yōu)勢： （1）COI基因在物種進(jìn)化中屬于中度變異， 其進(jìn)化速率一般大于ITS-1的進(jìn)化速率， 能夠從DNA分子水平上成功的區(qū)分物種。（2）COI基因的引物通用性比較強(qiáng)， 可操作性強(qiáng)。（3）COI基因密碼子的第3個(gè)位點(diǎn)存在更多的堿基置換， 并且長度約為650bp， 能夠表現(xiàn)出足夠物種的的差異和變化， 同時(shí)也剛好適宜進(jìn)行擴(kuò)增和后期檢測。

在海洋貝類中， 線粒體COI基因也廣泛用于分析群體的遺傳多樣性， 如對(duì)文蛤［9］， 光滑河藍(lán)蛤［10］，泥蚶［11］， 縊蟶［12］等研究表明， COI基因可以用于分析物種的群體內(nèi)和群體間的遺傳距離， 分析個(gè)體差異，從而推斷群體的遺傳分化水平及基因交流的可能性。本實(shí)驗(yàn)通過測定毛蚶群體的線粒體的COI基因部分序列， 進(jìn)行遺傳分析， 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹， 旨在分析毛蚶遺傳多樣性水平和不同地理群體的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系， 并推測線粒體COI基因能否作為區(qū)分毛蚶不同群體的有效分子標(biāo)記， 同時(shí)為毛蚶的資源保護(hù)及群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的4個(gè)毛蚶地理群體樣品分別取自遼寧大連旅順（2013年6月1日）， 山東乳山白沙灘（2013年4月2日）， 山東煙臺(tái)芝罘島（2013年4月1日）， 浙江舟山普陀（2013年4月18日）近海， 樣品是活體加冰運(yùn)輸， 迅速解剖， 取出閉殼肌部分， 置于–80℃超低溫冰箱保存。

1.2 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

每個(gè)群體隨機(jī)選取9～10個(gè)樣品， 采用常規(guī)的酚氯仿法提取基因組DNA［13］， 最終得到的DNA模板稀釋至100ng/μL。使用COI通用引物（F： GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G； R： TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA［14］）進(jìn)行毛蚶4個(gè)群體COI基因片段的擴(kuò)增。PCR采用Easy Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增， PCR反應(yīng)在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為30μL， 包括3μL PCR緩沖液（Mg2+plus）， 4μL 高純度的脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L）， 10μmol/L的正反方向引物各2μL，1μL Taq酶（5 U/μL）， 2μL DNA模板（80 ng/μL），16μL滅菌水。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性5min；（94℃： 20s， 52℃： 50s， 72℃： 1min； ）30個(gè)循環(huán)， 最后72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

1.3 測序和數(shù)據(jù)處理

將瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果中條帶較單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品送于北京華大基因生物有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化測序。所得的結(jié)果進(jìn)行NCBI BLAST比對(duì)驗(yàn)證同源性， 保證測序結(jié)果的可靠性。利用DnaSP 5軟件［15］分析毛蚶群體單倍型數(shù)（Number of Haplotype， H）、平均核苷酸差異（Average number of nucleotide difference， K）及核苷酸多樣性指數(shù)（Nucleotide diversity， Pi）等遺傳多樣性參數(shù)， 運(yùn)用MEGA 5.0軟件［16］對(duì)序列的堿基組成（Nucleotide composition）、多態(tài)位點(diǎn)（Number of polymorphic sites， S）、變異位點(diǎn)（Variable sites）進(jìn)行分析， 采用NJ（Neighbor-joining）法構(gòu)建毛蚶4個(gè)地理群體的系統(tǒng)發(fā)育樹， Bootstrap置信值設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的堿基組成

測序后獲得的COI基因片段長度不一， 經(jīng)序列對(duì)準(zhǔn)去除序列兩端部分堿基后， 得到38條長度均為625 bp的COI基因片段。4個(gè)群體毛蚶COI基因部分片段的堿基組成（表1）， A+T含量普遍高于G+C含量， 這與Medina等的研究一致［17］。大連、乳山、煙臺(tái)3個(gè)群體COI序列堿基組成相差不大， 而舟山群體盡管在A+T含量上與其他3個(gè)群體相近， 但其堿基A的含量比其他3個(gè)群體低19.9%， T的含量高16.7%。說明舟山群體在遺傳系統(tǒng)分化上可能占有較為特殊的地位。

表1 毛蚶不同群體COI基因部分序列的堿基組成Tab. 1 Base compositions of COI gene partial sequences of four populations of S. subcrenata

2.2 遺傳多樣性分析

毛蚶群體COI基因片段遺傳多樣性指數(shù)（表2），大連、乳山和煙臺(tái)群體序列之間差異不大， 多態(tài)位點(diǎn)分別占總數(shù)的28.8%， 35.0%和28.0%， 多樣性豐富。乳山群體的平均核苷酸差異指數(shù)最高， 為106.58。舟山群體9個(gè)個(gè)體的COI基因部分序列中僅有2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)， 群體特征明顯， 群體遺傳分化很小， 平均核苷酸差異指數(shù)最低， 僅為0.44。

由于大連群體中DL1和煙臺(tái)群體中YT7單倍型是相同的， 因此本文研究的38個(gè)毛蚶個(gè)體中共存在30個(gè)單倍型， GenBank序列號(hào)為KP253046-KP253075，對(duì)應(yīng)的個(gè)體依次為DL（2、3、4、6、7、8）， RS（6、5、8、10）， YT（5、8、9、10）， ZS（2、1、5、6）， YT（1、2、3、4）， RS（3、4、1、2）， DL（5、9）， RS（9、7）。30個(gè)單倍型的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)見表3。

2.3 遺傳距離

根據(jù)4種毛蚶群體COI基因部分序列計(jì)算的群體內(nèi)和群體間的遺傳距離如表4所示。乳山群體內(nèi)遺傳距離最大， 為0.21， 舟山群體內(nèi)遺傳距離最小，為0.0011。群體間遺傳分析表明， 毛蚶舟山群體和大連群體間的遺傳距離最大， 為0.26， 煙臺(tái)群體和大連群體之間遺傳距離最小， 為0.15。

表2 毛蚶不同群體COI基因片段的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 2 The genetic diversity parameters of COI gene partial sequences in different populations of S. subcrenata

2.4 分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

根據(jù)4種毛蚶群體COI基因部分序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）?？梢钥闯?， 舟山群體首先單獨(dú)聚在一起， 乳山群體、煙臺(tái)群體和大連群體則相互交叉聚合在一起， 沒有明顯的先聚在一起的情況。

3 討論

3.1 毛蚶4個(gè)群體的遺傳多樣性

本實(shí)驗(yàn)中毛蚶群體的多態(tài)位點(diǎn)較多， 核苷酸多樣性指數(shù)較高， 可能的原因分以下兩種： （1）選取樣品的時(shí)候要先調(diào)查其來源， 距離較近的物種可能受到外來物種的污染或人為因素的干擾， 如群體中的個(gè)體經(jīng)過捕撈作業(yè)和商戶之間的轉(zhuǎn)手買賣可能群體之間的交叉所致。（2）煙臺(tái)和乳山地理位置較近， 在遺傳分化上不明顯， 兩群體和大連群體均與黃海相鄰， 地理群體之間可能存在一定的基因交流。

李旭光等［18］對(duì)毛蚶江蘇海州灣群體、浙江象山港群體和遼寧遼東灣群體的同工酶遺傳多樣性進(jìn)行了研究， 發(fā)現(xiàn)毛蚶群體具有較為豐富的遺傳多樣性，這與本文的研究結(jié)果相一致。毛蚶大連、煙臺(tái)和乳山群體均具有較高的遺傳變異水平， 這說明毛蚶對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng)， 也是毛蚶能夠在中國沿海地區(qū)廣泛分布的原因之一［19］。王曉梅等［20］對(duì)毛蚶3個(gè)群體核糖體ITS區(qū)進(jìn)行了RFLP分析， 發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性最低的為寧波樣本， 而寧波群體和舟山群體距離很近， 存在一定的基因流， 從而與本實(shí)驗(yàn)中舟山群體遺傳多樣性的研究結(jié)果一致。

王曉梅等［20］發(fā)現(xiàn)毛蚶ITS區(qū)限制性片段長度多態(tài)性很低， ITS區(qū)564 bp的序列中多態(tài)位點(diǎn)僅為3.37%， 與本研究中高多態(tài)性的結(jié)果不一致， 原因是在線粒體基因組中， 不同基因的進(jìn)化速率并不相同，而COI基因的進(jìn)化速率一般大于ITS-1的進(jìn)化速率，因此所得出的結(jié)論并不矛盾。

3.2 群體間的遺傳進(jìn)化關(guān)系

陳蓉［1］等采用形態(tài)性狀多變量分析方法， 對(duì)中國5個(gè)野生毛蚶群體進(jìn)行了分析， 發(fā)現(xiàn)在形態(tài)學(xué)方面， 毛蚶天津塘沽和山東青島群體最為接近， 廣西北海群體與其他群體差異最大。形態(tài)最為一致說明具有較近的進(jìn)化關(guān)系， 與本研究結(jié)果中山東青島與遼寧大連群體遺傳關(guān)系相近的結(jié)果基本一致。

王曉梅等［20］構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中顯示毛蚶大連群體和塘沽群體沒有明顯的群體分化， 寧波群體單獨(dú)聚為一支。李旭光等人［18］的聚類分析中， 江蘇海州灣群體首先與寧波象山港群體相聚， 后與遼東灣群體聚類。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系均表明環(huán)渤海灣的群體遺傳距離較近， 和東海海岸附近的群體遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.3 COI基因作為群體之間遺傳進(jìn)化關(guān)系標(biāo)記的討論

本研究分析表明， 線粒體COI基因的進(jìn)化速度相對(duì)適中， 不僅對(duì)相近的物種進(jìn)行識(shí)別鑒定， 也可以對(duì)具有地理隔離的群體進(jìn)行分類鑒定。

4 結(jié)論

基于COI基因片段的研究結(jié)果表明， 中國北部的毛蚶群體如煙臺(tái)、大連、乳山群體具有較高的遺傳多樣性， 群體內(nèi)差異大， 群體間差異不大。而舟山群體遺傳多樣性較低， 群體內(nèi)遺傳差異很小， 與北方群體具有較大的遺傳距離。

表3 毛蚶4個(gè)地理群體30個(gè)單倍型的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)Tab. 3 Nucleotide polymorphism in four geographical populations of 30 haplotypes of S. subcrenata

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

表4 毛蚶4個(gè)群體內(nèi)和群體間的遺傳距離Tab. 4 The genetic distance within and between different populations of S. subcrenata

圖1 基于毛蚶4個(gè)群體COI部分序列建立的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig. 1 Phylogenetic relationships among four groups of S. subcrenata based on COI gene partial sequences

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（本文編輯： 梁德海）

Genetic diversity of different populations of Scapharca subcrenata based on mitochondrial COI gene

TIAN Ji-teng1， HOU Ya1， 2， LIU Zhi-hong1， YANG Ai-guo1， WU Biao1， ZHOU Li-qing1，DONG Chun-guang1， 2
（1. Key Laboratory of sustainable development of marine fisheries， Ministry of agriculture， the Yellow Sea Institute of fisheries， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China； 2. College of Fisheries and Life Sciences， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

May， 9， 2015

Scapharca subcrenata； COI gene； population； diversity

General PCR technology was used for the amplification of mitochondrial COI gene partial sequences of four groups of Scapharca subcrenata （Dalian， Rushan， Yantai， and Zhoushan）. A total of 38 sequences from different populations were determined and analyzed. The results are as follows： （a） After excluding both sides of the inaccurate sequences， 38 COI gene partial sequences of S. subcrenata， 625 bp each， were eventually identified， among which 30 haploid types were detected. （b） Based on partial COI gene sequence analysis of the four groups of S. subcrenata， the total variation loci， haploid type diversity index S， nucleotide diversity index Pi， and average nucleotide difference index were 301， 241， 0.15048， and 92.242， respectively. （c） Cluster analysis showed that ark shells from three groups， Rushan， Dalian， and Yantai， had a high degree of genetic diversity， and they clustered across， without the obvious characteristics of the groups. However， ark shells from the Zhoushan group gathered themselves together， apart from the other three groups obviously. The genetic diversity index of Zhoushan group was much lower than that of other groups. （d） Mitochondrial COI gene could not separate the ark shells from Rushan， Dalian， and Yantai but can be a marker for Zhoushan populations of S. subcrenata， which provides more basic data for the application of mitochondrial COI gene in population genetics.

S917.4

A

1000-3096（2016）01-0001-09

10.11759/hykx20140429002

2015-05-09；

2015-09-10

國家科技部基礎(chǔ)工作專項(xiàng) （2013FY110700） ； 黃海水產(chǎn)研究所級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助（20603022013032）

田吉騰（1986-）， 男， 助理研究員， 主要從事海洋生物種質(zhì)資源與遺傳育種的研究， E-mail： 0708jixiang@163.com； 劉志鴻（1972-），通信作者， 女， 研究員， E-mail： liuzh@ysfri.ac.cn， 電話： 0532-85836340