趙 晨, 張雙琴, 王利鳳, 李 薇(上海交通大學實驗動物中心, 上海 200240)

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還原型谷胱甘肽對C57BL/6J小鼠體外受精的影響

趙 晨, 張雙琴, 王利鳳, 李 薇
(上海交通大學實驗動物中心, 上海 200240)

[摘要]目的 探討受精液中添加還原型谷胱甘肽(GSH)對C57BL/6J小鼠體外受精的影響。 方法 以體外受精液(HTF)作為對照, 在HTF液中添加不同濃度(0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L和1.50 mmol/L)的GSH，對C57BL/6J近交系小鼠進行體外受精實驗，觀察體外受精和早期胚胎發(fā)育情況。同時，用5種C57BL/6J小鼠背景的基因工程小鼠加以驗證。結(jié)果 與對照組相比，實驗組的體外受精率顯著升高，濃度為0.50 mmol/L時，體外受精率提高顯著(P<0.05)，濃度在1.25 mmol/L時，體外受精率最高(P<0.01)。受精卵的體外囊胚發(fā)育率實驗組與對照組無顯著性差異(P>0.05)。C57BL/6J背景的基因工程小鼠的體外受精率和體外囊胚發(fā)育率與C57BL/6J近交系小鼠相似。結(jié)論 在HTF中添加一定濃度的GSH能夠提高C57BL/6J小鼠及C57BL/6J背景的基因工程小鼠的體外受精效果。

[關(guān)鍵詞]還原型谷胱甘肽(GSH); C57BL/6J小鼠; 體外受精

E-mail: zhaochenjnpy@163.com

C57BL/6J小鼠為近交系小鼠，由于其具有遺傳信息穩(wěn)定等特點，基因工程小鼠多以C57BL/6J小鼠為遺傳背景[1-5]。近年來，隨著CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因工程小鼠模型應用于科學研究[6-8]。然而很多基因工程小鼠由于多方面的原因出現(xiàn)難以生育或瀕臨死亡等問題，直接影響了科研工作的正常進行。針對這種情況，以體外受精為代表的輔助生殖技術(shù)受到廣泛關(guān)注[9-11]。體外受精中，透明帶是精子最難穿越屏障，Cohen等[12]和Gorden等[13]分別通過物理方法或化學方法，解決了上述問題，但因其操作復雜、設備昂貴等原因而難以推廣。谷胱甘肽(GSH)對人、牛等動物體外受精起促進作用的報道已有很多[14-16], 本研究通過在體外培養(yǎng)液中添加不同濃度的GSH，探討其在阻止卵母細胞透明帶硬化，提高C57BL/6J小鼠體外受精率中的作用，同時用5種以C57BL/6J小鼠為遺傳背景的基因工程小鼠進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6J小鼠, 4周齡雌性103只, 12周齡雄性7只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2012-0002]。5種基因工程小鼠購自美國Jackson實驗室, 在上海交通大學實驗動物中心屏障環(huán)境中[SYXK(滬)2013-0052]繁殖擴群獲得SPF級后代。溫度為21～25 ℃，相對濕度為40%～60%，小鼠自由采食和飲水。光照明暗周期為12 h∶12 h (8∶00 am～8∶00 pm，為光照時間)。

1.2 試劑與儀器

試劑: 還原型谷胱甘肽(美國Sigma, G6013-5G);注射用孕馬血清素(PMSG)(生產(chǎn)批號：140825)，規(guī)格為1 000 IU/支，注射用人絨毛促性腺激素(hCG)(生產(chǎn)批號: 140220)，規(guī)格為500 IU/支，均為寧波第二激素廠生產(chǎn)，凍干粉劑, 保存于4 ℃，使用前用生理鹽水配置成稀釋液; 礦物油(美國Sigma，M5310-500ML)，KSOM培養(yǎng)基(Millipore，MR-020-5F)、體外受精液(HTF)培養(yǎng)基由本實驗自行配制(參考《小鼠胚胎操作實驗指南》)，配置后用0.22 mm的濾器過濾。

儀器: 超凈工作臺, CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，顯微鏡(Zeiss), 超純水儀(Millipore)，高壓滅菌鍋(Zealway)，培養(yǎng)皿(Falcon)，自制洗卵針，顯微鑷，移液槍，酒精燈等。

1.3 方法

1.3.1 GSH受精液配制 分別配置含0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L和1.50 mmol/L GSH的HTF培養(yǎng)基，用0.22 mm的過濾器過濾后作為受精液備用。以不含GSH的HTF培養(yǎng)基為對照組。

1.3.2 精子采集、超數(shù)排卵及采卵 參照Nagy等[17]方法，采用頸椎脫臼法處死雄鼠，取其附睪尾，將附睪尾移至HTF培養(yǎng)基中，用顯微鑷刺破附睪尾，迫使精子流出，獲能1 h。

雌鼠腹腔注射7.5 IU的PMSG，48 h后再腹腔注射7.5 IU的hCG，注射后14～15 h取卵。取雙側(cè)輸卵管放入HTF中，用顯微鑷將卵子團拖出。

1.3.3 體外受精 采用Nagy等[17]方法進行體外受精, 次日早晨統(tǒng)計2-細胞胚胎數(shù)和體外受精率(2-細胞胚胎數(shù)/分離的卵母細胞總數(shù)×100%)。

1.3.4 胚胎發(fā)育至囊胚 將上述形態(tài)正常的2-細胞期胚胎在KSOM培養(yǎng)基中洗3次, 然后轉(zhuǎn)移至KSOM培養(yǎng)基中, 放入37 ℃、體積分數(shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期。觀察各組胚胎形成數(shù)目, 統(tǒng)計囊胚形成率(囊胚數(shù)/2-細胞胚胎數(shù)×100%)。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 GSH對體外受精率和囊胚形成率的影響

與對照組比較，GSH濃度達到0.50 mmol/L時即可觀察到體外受精效率的顯著提高(P<0.05)。當GSH濃度介于0.25 mmol/L至1.25 mmol/L時, 隨著GSH濃度增高, 體外受精效率也隨之提高, 詳見表1。

2.2 GSH對5種以C57BL/6J小鼠為遺傳背景的基

因工程小鼠體外受精率和囊胚形成率的影響

表1 GSH對C57BL/6J小鼠體外受精率和囊胚形成率的影響

表2 GSH對基因工程小鼠體外受精率和囊胚形成率的影響

3 討論

關(guān)于實驗小鼠體外受精技術(shù)的研究報道很多，其結(jié)果大多與小鼠的體外受精與體外受精培養(yǎng)液、實驗動物的遺傳背景、實驗人員操作技術(shù)、實驗條件等多種因素有關(guān)。徐平等[18]曾報道13個品系小鼠的體外受精率為15.1%～87.9%; 趙丹鳳等[19]研究了35個品系小鼠的體外受精率，結(jié)果顯示受精率為15.2%～97.2%; 朱佳偉等[20]曾報道，昆明鼠體外受精率為81.7% ，表明遺傳背景不同的小鼠體外受精率有顯著差異。相關(guān)研究中有關(guān)C57BL/6J近交系小鼠的體外受精率的報道存在不同的結(jié)果，徐平等[18]的研究結(jié)果顯示C57BL/6J小鼠體外受精率為83.6%，Takeo等的研究結(jié)果為85.7%[21]，而吳紅等[22]的結(jié)果為34%，本研究的結(jié)果為51.7%，表明不同實驗條件、HTF試劑來源等方面的差異是造成C57BL/6J小鼠體外受精率結(jié)果不同的主要原因。

GSH是一種生物抗氧化劑, 包含一個巰基基團。當GSH與二硫鍵發(fā)生作用時, 它可使二硫鍵成為兩個巰基[23,24], 因此它對細胞外源性和內(nèi)源性化合物的解毒和抗氧化起著重要作用[25-27]。Perreault等[28]報道在倉鼠的受精過程和雄原核形成過程中有GSH的參與。Iwamoto等[29]報道牛卵母細胞受精過程中伴隨透明帶上半胱殘基的氧化，巰基基團變?yōu)槎蜴I參與了卵母細胞透明帶的硬化過程，并且阻止精子穿過透明帶。GSH可使透明帶上的二硫鍵轉(zhuǎn)化為巰基。本實驗中GSH對C57BL/6J小鼠體外受精的促進作用，可能是由于其阻止卵母細胞透明帶的硬化, 促進精子穿過透明帶, 進而提高了受精效率。

朱佳偉等[20]報道，在昆明鼠體外受精液中添加300 mmol/L GSH，能夠顯著提高受精率。本研究以梯度濃度(0.25mmol/L, 0.5mmol/L, 0.75mmol/L，1.00mmol/L，1.25mmol/L，1.50mmol/L)添加GSH 到HTF液中，探討GSH對C57BL/6J小鼠的體外受精的影響，結(jié)果顯示體外受精率的提高依賴于GSH濃度，與上述報道基本一致，當在體外受精液中添加GSH濃度為1.00 mmol/L至1.50 mmol/L時，其受精率達到89%以上，與對照組相比，受精率顯著提高，且體外受精時添加的GSH并未影響胚胎由2-細胞期胚胎發(fā)育至囊胚期，表明一定濃度的GSH能夠提高C57BL/6J小鼠體外受精率，且不影響早期胚胎發(fā)育。在5種基因工程小鼠體外受精液中添加濃度為1.25 mmol/L的GSH, 進行5種基因工程小鼠的體外受精實驗, 證實了添加GSH能夠提高以C57BL/6J小鼠為遺傳背景的基因工程小鼠體外受精率，驗證了其在實際應用中的可行性。參考文獻：

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現(xiàn)階段我國部分地區(qū)中出現(xiàn)中小微企業(yè)招工困難的問題，而與此同時隨著教育普及化的不斷深入發(fā)展，高校畢業(yè)生的數(shù)量逐年增多，大學生的職業(yè)生涯發(fā)展成為亟待解決的問題。企業(yè)的招工難及大學生就業(yè)難問題是多種因素影響下的結(jié)果，也是社會經(jīng)濟發(fā)展迅速與社會就業(yè)需求供給結(jié)構(gòu)矛盾的重要反應，因此應著重解決我國就業(yè)結(jié)構(gòu)中的矛盾性問題。

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Influence of Reduced Glutathione Added Medium on in vitro Fertilization in C57BL/6J Mouse

ZHAO Chen, ZHANG Shuang-qin, Wang Li-feng, LI Wei
(Laboratory Animal Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

[Abstract]Objective To study the influence of reduced glutathione (GSH) in fertilization medium on the in vitro fertilization (IVF) in C57BL/6J mouse. Methods The fertilization medium without reduced glutathione was prepared as control group, and the different concentrations of GSH (0.25 mmol/L, 0.50 mmol/L, 0.75mmol/L, 1.00mmol/L, 1.25mmol/L and 1.50mmol/L) were added to the fertilization medium during IVF, which were divided into 6 experimental groups, to investigate its effect on the fertilization and early embryo development of C57BL/6J inbred mice. In addition, 5 strains of genetically engineered mice having a genetic background of C57BL/6J were chosen to verify the influence of GSH. Results Compared with the control, GSH increased the fertilization rate in a dose-dependent manner. Statistically significant increased fertilization was first observed at 0.5 mmol/L GSH (P<0.05), reaching maximum values at 1.25 mmol/L(P<0.01). The blastocyst developmental rates have no significant difference from that of the control group (P>0.05). Fertilization and development rates of the genetically engineered mice were similar to those of C57BL/6 inbred mice. Conclusion In a certain range of concentration of GSH during the IVF procedure, it can enhance the fertility of C57BL/6J mouse and the genetically engineered mice having a genetic background of C57BL/6J.

[Key words]Reduced glutathione(GSH); C57BL/6J mouse; In vitro fertilization (IVF)

[中圖分類號]Q95-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-5817(2016)03-0208-04

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.010

[收稿日期]2016-01-05

[作者簡介]趙 晨(1987-), 男, 碩士研究生, 從事專業(yè): 體外受精和基因工程小鼠的制作。

[通訊作者]李 薇, 高級工程師, 從事專業(yè): 實驗動物相關(guān)技術(shù)與管理。E-mail: liweishen@sjtu.edu.cn