宗　劍,楊　春,胡明珠,周　波,季　永

[江南大學(xué) 1.附屬醫(yī)院(無錫市第四人民醫(yī)院)麻醉科， 2. 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫　214062]

?

BDNF-trkB信號通路在氯胺酮治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用

宗劍1,楊春1,胡明珠2,周波1,季永1

[江南大學(xué) 1.附屬醫(yī)院(無錫市第四人民醫(yī)院)麻醉科， 2. 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214062]

摘要:目的研究腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)-酪氨酸受體激酶B(tyrosine receptor kinase B，trkB)信號通路在氯胺酮治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用。方法♂ Wistar大鼠48只，3月齡，體質(zhì)量200～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為4組(n=12)：正常對照組(C組)、生理鹽水組(S組)、氯胺酮組(K組)及氯胺酮+ANA-12組(KA組)。S、K及KA組大鼠腹腔單次注射鏈脲菌素(STZ)65 mg·kg-1構(gòu)建糖尿病神經(jīng)病理痛模型。28 d后，S、K及KA組大鼠分別連續(xù)7 d腹腔注射等容積生理鹽水、氯胺酮10 mg·kg-1及氯胺酮10 mg·kg-1+ANA-12 0.5 mg·kg-1。d 8，測定大鼠機(jī)械縮足痛閾(MWT), 然后處死大鼠取腰段脊髓背根及大腦前額皮層。采用Western blot和高爾基染色檢測BDNF、p-trkB/trkB、突觸素(synaptophysin)及樹突棘密度。結(jié)果與C組比較，S組大鼠MWT明顯下降，且脊髓背根和前額皮層BDNF、p-trkB/trkB、突觸素及樹突棘密度均明顯下降(P<0.05)；與S組相比，K組大鼠MWT、各部位BDNF、p-trkB/trkB、突觸素和樹突棘密度均明顯增加(P<0.05)；與K組相比，KA組大鼠MWT明顯下降，且各部位BDNF、p-trkB/trkB、突觸素和樹突棘密度均明顯下調(diào)(P<0.05)。各部位BDNF與樹突棘密度均呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論氯胺酮治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制與BDNF-trkB信號通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：氯胺酮；神經(jīng)病理性疼痛；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；酪氨酸受體激酶;樹突棘密度; 突觸素

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是指由糖尿病引起的一類外周及中樞神經(jīng)病變所致的頑固性疼痛[1]。目前，該類疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且治療手段主要依賴于改善患者的血糖水平及促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的修復(fù)。然而，Schreiber等[2]報道，目前的治療策略及手段，約有37%患者未得到滿意療效。氯胺酮是臨床常用的一類麻醉藥，其主要通過阻斷N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體而發(fā)揮藥理學(xué)作用。新近基礎(chǔ)研究表明，小劑量(亞麻醉劑量)氯胺酮可明顯促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)與再生[3]。本研究擬通過鏈脲菌素構(gòu)建DNP大鼠模型，觀察氯胺酮對其治療作用并試圖闡明其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物與試劑

♂ Wistar大鼠48只，3月齡，體質(zhì)量200～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為4組(n=12)：正常對照組(C組)、生理鹽水組(S組)、氯胺酮組(K組)及氯胺酮+ANA-12組(KA組)。S、K及KA組大鼠腹腔單次注射鏈脲菌素(streptozocin，STZ，美國Sigma公司)65 mg·kg-1制備糖尿病大鼠模型，于注射后48 h，測量尾靜脈空腹血糖，血糖濃度>16.7 mmol·L-1，認(rèn)為造模成功。4周后，S、K及KA組大鼠分別連續(xù)7 d腹腔注射等容積生理鹽水、氯胺酮(10 mg·kg-1)及氯胺酮10 mg·kg-1+ANA-12(0.5 mg·kg-1)。

1.2機(jī)械縮足痛閾檢測

藥物干預(yù)后d 8，參考先前文獻(xiàn)[4]，對模型大鼠采用機(jī)械縮足痛閾(MWT)測定，將大鼠放置于底為5 mm×5 mm的透明有機(jī)玻璃箱中，適應(yīng)20～30 min。采用折力分別為0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g的經(jīng)典von-Frey纖毛，首先從2.0 g開始，將纖毛垂直刺向大鼠左后爪，依據(jù)大鼠有無縮足反射，再更換纖毛，每次持續(xù)時間不超過8 s，測試間隔時間為10 s。記錄大鼠對不同折力纖毛的反應(yīng)。若大鼠出現(xiàn)快速的縮足反射，則記為陽性反應(yīng)，且以“X”表示，若無反應(yīng)，則視為陰性反應(yīng)，以“O”表示。以出現(xiàn)“X”的前一次“O”作為起點(diǎn)，選擇包含該起點(diǎn)的6次連續(xù)刺激反應(yīng)，作為推算50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechanical paw withdrawal threshold，MWT)的關(guān)鍵序列，推算公式50% MWT/g=(10[Xf+κδ])/10 000。其中，Xf為序列中最后一根von Frey纖毛的對數(shù)值；κ為根據(jù)測量所得“X”、“O”序列查表后得到的值，δ為各個纖毛力度取對數(shù)后的均差，在此約等于0.224。若在0.4～2.0 g力度范圍的刺激均為陽性反應(yīng)，50% MWT記為0.4 g；若在2.0～15.0 g范圍力度的刺激均為陰性反應(yīng)，50% MWT記為15.0 g。

1.3Western blot檢測

大鼠測試行為學(xué)后，采用異氟醚麻醉處死，并稱取脊髓背根和前額皮層組織各200 mg，組織標(biāo)本中加入300 μL裂解液，于4 ℃離心后取上清液。進(jìn)行蛋白定量，取等量上樣緩沖液于試管中，并于(95～100) ℃ 5 min后，冰上冷卻上樣。取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min，按約0.1 mL·cm-2的量將膜置于封閉液和BDNF(1 ∶200， 批號：H117，Santa Cruz公司，美國)、p-trkB抗體(1 ∶1 000，批號：135645，Santa Cruz公司，美國)、trkB抗體(1 ∶200，批號：4606，Cell Signaling公司，美國)和突觸素抗體(1 ∶1 000，批號：5461，Cell Signaling公司，美國)，搖床震蕩孵育(4 ℃，過夜)。洗滌液漂洗濾膜3次，每次10 min。將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(濃度1 ∶5 000，南京建成生物公司)室溫下?lián)u蕩孵育2 h。隨后將顯影液加于膜上，室溫放置1 min。將膜在X光膠片上曝光，調(diào)整曝光時間，直至呈現(xiàn)最佳條帶。采用Image J軟件對條帶進(jìn)行分析，測定灰度值。

Fig 1　Effects of ketamine and ANA-12 on MWT in DNP rats

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsS group;△P<0.05vsK group

1.4免疫組化

參照先前文獻(xiàn)[5]，切取相應(yīng)組織，加入4%多聚甲醛緩沖液固定標(biāo)本，30%蔗糖緩沖液浸泡(4 ℃)，待組織下沉后，OCT包埋，恒冷箱切片機(jī)制備10 μm厚的冠狀連續(xù)切片。各組切片分別用1%鋨酸固定30 min；漂洗后用3.5%重鉻酸鉀浸泡1～3 h。將切片豎直放入1%硝酸銀溶液中6～24 h，取出切片，依次進(jìn)行梯度酒精脫水、水楊酸甲酯透明，然后封片。在顯微鏡下，從距離錐體細(xì)胞胞體50 μm處的2、3級樹突的樹突棘，連續(xù)選取10個樹突棘測量其長度，進(jìn)行分析，計算10 μm長度內(nèi)的樹突棘個數(shù)。

Fig 2　Effects of ketamine and ANA-12 on expression of BDNF,ratio of p-trkB/trkB and synaptophysin in dorsal ganglion of DNP rats

A: Images of Western blot; B～D: Bar graphs of BDNF, p-trkB and synaptophysin.**P<0.01vsC group;#P<0.05vsS group;△P<0.05vsK group

Fig 3　Effects of ketamine and ANA-12 on expression of BDNF, ratio of p-trkB/trkB and synaptophysin in prefrontal cortex of DNP rats

A: Images of Western bands. B～D: Figures of BDNF, p-trkB and synaptophysin.**P<0.01vsC group；#P<0.05vsS group;△P<0.05vsK group

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1疼痛對大鼠行為學(xué)及BDNF-trkB信號通路的影響

與C組比較，S組大鼠MWT明顯下降，且脊髓背根和前額皮層BDNF、p-trkB/trkB、突觸素及樹突棘密度均明顯下降(P<0.05)；與S組相比，K組大鼠MWT、及各部位BDNF、p-trkB/trkB、突觸素和樹突棘密度均明顯增加(P<0.05)。見Fig 1～4。

2.2氯胺酮對DNP大鼠行為學(xué)及BDNF-trkB信號通路的影響

與K組相比，KA組大鼠MWT明顯下降，且各部位BDNF、p-trkB/trkB、突觸素和樹突棘密度均明顯下調(diào)(P<0.05)(Fig 1～4)。各部位BDNF與樹突棘密度均呈現(xiàn)明顯正相關(guān)(P<0.05)(Fig 5)。

3討論

DNP的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，約有87%糖尿病患者長期承受著神經(jīng)病變所致的慢性疼痛[2]。本研究結(jié)果表明，氯胺酮作為一類常用麻醉藥，在DNP的治療方面，有獨(dú)特的療效。Zhou等[6]指出氯胺酮對DNP可獲得滿意治療效果。再者，我們觀察到trkB受體阻斷劑ANA-12可明顯抑制氯胺酮對DNP的治療效果。眾所周知，脊髓背根神經(jīng)節(jié)是外周傷害性刺激傳遞信息的換元神經(jīng)所在部位，以往研究多集中于觀察此部位。然而，我們知道，疼痛是一種伴有軀體癥狀的主觀不愉快感受。因此，本研究觀察前額皮層這一腦區(qū)，試圖說明外周神經(jīng)病變亦可通過上行神經(jīng)纖維將傷害性刺激投射至更高級的中樞神經(jīng)。我們通過Western blot及Glogi染色分別觀察到在脊髓背根和前額皮層BDNF-trkB信號通路激活引起的神經(jīng)棘突再生參與到氯胺酮治療DNP的機(jī)制中。

Fig 4　Effects of ketamine and ANA-12 on spine density in dorsal ganglion and prefrontal cortex in DNP rats

A and C: Images of Golgi stainning; B and D: Figures of spine density numbers.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsS group;△P<0.05vsK group

Fig 5　Scatter gram of correlationship between BDNF and spine density

Forty-eight samples were enrolled in this analysis. R2=0.5958,P<0.05

BDNF對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育及損傷修復(fù)起重要作用[7-8]。BDNF主要以未成熟前體形式proBDNF及成熟的mBDNF兩種形式存在[9]。本研究觀察的是14 ku位點(diǎn)的mBDNF，并未觀察位于28 ku的proBDNF。BDNF(特指mBDNF)對trkB具有高度親和性，通過使trkB磷酸化而發(fā)揮作用[9]。本研究結(jié)果表明,在亞麻醉劑量氯胺酮治療7 d后，大鼠脊髓背根和前額皮層BDNF及p-trkB均呈現(xiàn)明顯上調(diào)，且在ANA-12干預(yù)組該兩類指標(biāo)表達(dá)水平明顯下降。該結(jié)果提示，氯胺酮在外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)均可通過激活BDNF-trkB信號通路而發(fā)揮對DNP的治療作用。然而，氯胺酮可導(dǎo)致神經(jīng)類副作用[10]。Anderson等[11]認(rèn)為嚙齒類動物腹腔注射氯胺酮，其認(rèn)知功能明顯下降，且精神分裂發(fā)生率較生理鹽水對照組明顯增加。盡管本研究并未采用前脈沖抑制、敞箱實(shí)驗(yàn)來觀察氯胺酮的精神分裂樣副作用，但我們認(rèn)為10 mg·kg-1亞麻醉劑量氯胺酮是安全的，主要有以下原因：① 氯胺酮在嚙齒類動物模型上構(gòu)建精神分裂動物模型的劑量約為50 mg·kg-1以上，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過本研究中使用的劑量；② 微清蛋白(PV)及其所產(chǎn)生的γ震蕩波的異常表達(dá)是精神分裂檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，10 mg·kg-1氯胺酮是否引起腦內(nèi)PV神經(jīng)元的缺失，目前尚無研究報道；③ 慢性疼痛患者往往伴有抑郁癥狀，Liebrenz等[12]提示重復(fù)間斷靜脈注射亞麻醉劑量氯胺酮在改善抑郁的同時，對患者簡易精神量表(BDI)并未有影響。

神經(jīng)元細(xì)胞的突起是傳遞信號的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，氯胺酮可明顯增加神經(jīng)突起數(shù)目，間接提示氯胺酮可通過改善受損的突觸，激活突觸再生，從而發(fā)揮治療DNP的作用。BDNF對突觸再生有促進(jìn)作用，我們采用Pearson相關(guān)分析認(rèn)為BDNF可促進(jìn)突起的再生，且在氯胺酮治療DPN中呈現(xiàn)一致性變化。據(jù)此，我們推測氯胺酮通過激活脊髓背根BDNF的表達(dá)，促進(jìn)trkB磷酸化，進(jìn)而上調(diào)突觸素的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)棘突起的再生，從而發(fā)揮對DNP的治療作用，且該效應(yīng)通過脊髓上行系統(tǒng)投射至疼痛敏感區(qū)前額皮層，可通過中樞調(diào)控機(jī)制發(fā)揮對慢性疼痛所伴隨的主觀感受的改善。

綜上所述，本研究通過STZ構(gòu)建的DNP大鼠模型，觀察到氯胺酮對DNP的明顯改善作用，且其機(jī)制與激活脊髓背根和前額皮層BDNF-trkB信號通路及促進(jìn)神經(jīng)突起再生有關(guān)。后續(xù)研究需進(jìn)一步闡明其確切機(jī)制，從而為臨床治療DNP提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1]King J B, Schauerhamer M B, Bellows B K. A review of the clinical utility of duloxetine in the treatment of diabetic peripheral neuropathic pain[J].TherClinRiskManag, 2015, 11:1163-75.

[2]Schreiber A K,Nones C F,Reis R C,et al. Diabetic neuropathic pain: physiopathology and treatment[J].WorldJDiabetes,2015,6(3):432-44.

[3]Li N, Lee B, Liu R J, et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists[J].Science, 2010, 329(5994): 959-64.

[4]Lim D W, Kim J G, Han T, et al. Analgesic effect of ilex paraguariensis extract on postoperative and neuropathic pain in rats[J].BiolPharmBull, 2015, 38(10): 1573-9.

[5]Rico A M, Mendoza A L, Durán D A, et al. The effects of chronic restraint on the morphology of ventral CA1 neurons in female Long Evans rats[J].Stress, 2015, 18(1): 67-75.

[6]Zhou H Y, Chen S R, Pan H L. Targeting N-methyl-D-aspartate receptors for treatment of neuropathic pain[J].ExpertRevClinPharmacol, 2011, 4(3): 379-88.

[7]Khan N, Smith M T. Neurotrophins and neuropathic pain: role in pathobiology[J].Molecules, 2015, 20(6): 10657-88.

[8]萬東,?；埒P,羅勇,謝鵬.梓醇上調(diào)局灶腦缺血大鼠缺血灶周圍大腦皮質(zhì)BDNF和TrkB蛋白表達(dá)[J].中國藥理學(xué)通報,2013,29(6):787-92.

[8]Wan D,Zhu H F,Luo Y,Xie P.Catalpol increases around the focal ischemic focal cerebral ischemia rats cortex BDNF and TrkB protein expression[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(6):787-92.

[9]Hashimoto K, Shimizu E, Iyo M. Critical role of brain-derived neurotrophic factor in mood disorders[J].BrainResBrainResRev, 2004, 45(2): 104-14.

[10]李建立,高冬艷,杜彥茹,侯艷寧.17β雌二醇對氯胺酮誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2014,30(6):816-20.

[10]Li J L,Gao D Y,Du Y R,Hou Y N.17 beta estradiol impact on ketamine induced cortical neuron apoptosis[J].ChinPharmacolBull,2014,30(6):816-20.

[11]Anderson P M,Pinault D,O′Brien T J,et al. Chronic administration of antipsychotics attenuates ongoing and ketamine-induced increases in cortical γ oscillations[J].IntJNeuropsychopharmacol, 2014, 17(11):1895-904.

[12]Liebrenz M, Stohler R, Borgeat A. Repeated intravenous ketamine therapy in a patient with treatment-resistant major depression[J].WorldJBiolPsychiatry,2009,10(4 Pt 2):640-3.

Role of BDNF-trkB signaling pathway in ketamine treating diabetic neuropathic pain

ZONG Jian1, YANG Chun1, HU Ming-zhu2, ZHOU Bo1, JI Yong1

[1.DeptofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofJiangnanUniversity(Wuxi4thPeople′sHospital);2.WuxiMedicalCollege,JiangnanUniversity,WuxiJiangsu214062,China]

Abstract：AimTo investigate the role of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)- tyrosine receptor kinase B(trkB) signaling pathway in the therapeutic effects of ketamine on diabetic neuropathic pain.MethodsForty-eight Wistar rats, aged 3 months, weighing 200～250 g, were equally randomized into 4 groups(n=12):control group(C group), saline group(S group), ketamine group(K group) and ketamine+ANA-12 group(KA group).Rats in S, K and KA groups were intraperitoneally injected with a single of streptozotocin(STZ) 65 mg·kg-1to construct diabetic neuropathic pain model. After twenty-eight days, rats in S, K and KA groups were intraperitoneally injected with saline, ketamine 10 mg·kg-1and ketamine 10 mg·kg-1+ANA-12 0.5 mg·kg-1for consecutive 7 days, respectively. On the 8th day, mechanical withdrawal threshold(MWT) of rats was measured. After that, the rats were immediately sacrificed, and dorsal ganglion of lumbar spine and prefrontal cortex(PFC) were harvested for measuring BDNF, p-trkB/trkB, synaptophysin and spine density by Western blot and glogi staining.ResultsCompared with C group, rats in S group significantly decreased MWT, BDNF, p-trkB/trkB, synaptophysin and spine density in dorsal ganglion and PFC(P<0.05 ).Compared with S group, rats in K group showed a significant increase of MWT, BDNF, p-trkB/trkB, synaptophysin and spine density in the all observed regions(P<0.05).On the contrary, rats in KA group showed a significant decrease of MWT and BDNF, p-trkB/trkB, synaptophysin and spine density as compared with K group in all regions(P<0.05 ). Furthermore, BDNF was positively correlated with spine density in all regions(P<0.05).ConclusionBDNF- trkB signaling pathway mediates ketamine-induced therapeutic effects in diabetic neuropathic pain.

Key words:ketamine; neuropathic pain; brain-derived neurotrophic factor; tyrosine receptor kinase B; spine density; synaptophysin

收稿日期:2016-02-16,修回日期:2016-03-20

基金項(xiàng)目：無錫市醫(yī)學(xué)管理中心醫(yī)學(xué)科研面上項(xiàng)目(No YGZXM1407)

作者簡介：宗劍(1978-)，男，博士生， 主治醫(yī)師，研究方向：疼痛機(jī)制，Tel:0510-88682025,E-mail : zw0086@126.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.013

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0801-06

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R345.57；R441.1；R587.1；R741.02；R971.2；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.026.html

季永(1969-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：疼痛機(jī)制，Tel:0510-88682025,通訊作者，E-mail:jiyong6914@163.com