黃玉影，李常青，陳斯泰，黃志剛，郭潔文，李小翚，屈喜玲

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州　510405；3.惠州市九惠制藥股份有限公司，廣東惠州516007；4.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510130）

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荔枝核有效部位群對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝的治療作用及機(jī)制

黃玉影1，李常青2，陳斯泰2，黃志剛3，郭潔文4，李小翚1，屈喜玲3

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405；3.惠州市九惠制藥股份有限公司，廣東惠州516007；4.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510130）

摘要：【目的】觀(guān)察荔枝核有效部位群（SLEC）對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝（NAFLD）的治療作用，并探討其作用機(jī)制?！痉椒ā窟x用SPF級(jí)大鼠，雌雄各半，采用高脂飼料加高脂乳液灌胃8周復(fù)制NAFLD模型，造模成功后將造模組大鼠根據(jù)體質(zhì)量和血糖值隨機(jī)分為模型組、SLEC低劑量組（劑量為0.74 g·kg-1·d-1）、SLEC高劑量組（劑量為1.48 g·kg-1·d-1）和二甲雙胍組（劑量為100 mg·kg-1·d-1），每組8只，雌雄各半，并設(shè)正常組為對(duì)照。給藥4周后，腹主動(dòng)脈采血、取肝組織。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、空腹血糖（FBG）；采用比色法檢測(cè)血清游離脂肪酸（NEFA）、放射免疫法檢測(cè)血清胰島素（Ins）含量，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、胰島素敏感性指數(shù)（ISI）；采用甘油磷酸氧化酶—過(guò)氧化物酶偶聯(lián)（GPO-PAP）法、膽固醇氧化酶—過(guò)氧化物酶偶聯(lián)（COD-PAP）法、水溶性四氮唑（WST-1）法、硫代巴比妥酸（TBA）法分別檢測(cè)肝組織TG、CHOL、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；觀(guān)察大鼠肝臟組織病理變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和Western-blot法分別檢測(cè)大鼠肝組織固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA和蛋白的表達(dá)?！窘Y(jié)果】SLEC高劑量組能顯著降低NAFLD大鼠血清TG、LDL-C、NEFA和肝脂質(zhì)含量，提高大鼠血清SOD含量，明顯改善大鼠HOMA-IR、提高ISI，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且SLEC高劑量組改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用明顯。與模型組比較，SLEC高、低劑量均能顯著降低大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白表達(dá)（P<0.05）。【結(jié)論】SLEC對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的病理狀況具有明顯改善作用，作用機(jī)制與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低NEFA水平，改善IR、抗氧化應(yīng)激和下調(diào)SREBP-1c基因與蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：荔枝核有效部位群/藥理學(xué)；非酒精性脂肪肝/中藥療法；胰島素抵抗；肝/病理學(xué)；基因表達(dá)調(diào)控；疾病模型，動(dòng)物；大鼠

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）有關(guān)、以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)［1］。NAFLD在我國(guó)發(fā)病增長(zhǎng)迅速，成人患病率在15%左右［1］。荔枝核系無(wú)患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟種子。研究表明荔枝核能提高胰島素敏感性，調(diào)整高脂血癥—脂肪肝所致的糖脂代謝紊亂［2-3］?？傇碥?、黃酮和鞣質(zhì)均是荔枝核發(fā)揮降糖調(diào)脂、改善IR作用的有效部位［4-6］。研究［7］顯示，由荔枝核總皂苷、黃酮和鞣質(zhì)組成的有效部位群（Semen Litchi effective constituents，SLEC），對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗具有顯著的改善作用。本研究采用高脂飼料加高脂乳液建立的大鼠NAFLD-IR模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)SLEC的藥效作用，并探討其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、飼料及高脂乳液SPF級(jí)SD大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002。高脂飼料（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：73.8%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、5%蔗糖、0.2%膽鹽，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002。高脂乳液自制，每100 mL含豬油20 g、花生油30 g、膽固醇15 g、豬膽鹽3 g、吐溫-80 5 mL、丙二醇5 mL、雙蒸水適量?；A(chǔ)鼠料：SPF級(jí)包裝，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥物荔枝核藥材購(gòu)于廣州市藥材公司（批號(hào)：YPA3C001），經(jīng)廣東省生物制品與藥物研究所鐘世順副主任藥師鑒定為無(wú)患子科植物荔枝（Litchi chinensis Sonn.）的干燥成熟種子；荔枝核有效部位群提取方法參照文獻(xiàn)［7］，提取物為粉末，使用前用雙蒸水配成混懸液（SLEC低劑量0.074 g/mL，SLEC高劑量0.148 g/mL）；鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，批號(hào)：1409082）由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，研磨后用雙蒸水配成溶液（10 mg/mL）。

1.3主要試劑及儀器甘油三酯測(cè)試盒（批號(hào)：140761）、膽固醇測(cè)試盒（批號(hào)：141151）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒（批號(hào)：140611）和谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)試盒（批號(hào)：140561）均由中生北控生物科技有限公司生產(chǎn)；高密度脂蛋白膽固醇測(cè)試盒（批號(hào)：806RCL）和低密度脂蛋白膽固醇測(cè)試盒（批號(hào)：810RLK）均由日本積水株式會(huì)社生產(chǎn)；葡萄糖測(cè)試盒（批號(hào)：20141022）由上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)；甘油三酯測(cè)試盒（用于測(cè)定肝脂質(zhì)，批號(hào)：20150423）、膽固醇測(cè)試盒（用于測(cè)定肝脂質(zhì)，批號(hào)：20150325）、游離脂肪酸測(cè)試盒（批號(hào)：20150326）、總超氧化物歧化酶測(cè)試盒（批號(hào)：20150407）、丙二醛測(cè)試盒（批號(hào)：20150324）和總蛋白定量測(cè)試盒（批號(hào)：20150407）均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；碘［125I］胰島素放射免疫分析盒（批號(hào)：20150502）由北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；SYBR Green qPCR SuperMix（批號(hào)：C11744500）由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)；SREBP-1c兔多克隆一抗（批號(hào)：YT5508）由美國(guó)Immunoway公司生產(chǎn)，相應(yīng)二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、Mouse/Human ads-HRP（批號(hào)：4050-05）由美國(guó)Southern biotech公司生產(chǎn)；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的GAPDH內(nèi)參（批號(hào)：KC-5G5）由上?？党缮锕こ逃邢薰旧a(chǎn)；豬膽鹽（批號(hào)：3202090）、膽固醇（批號(hào)：2102013）由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)；吐溫-80、丙二醇均為食品級(jí)，購(gòu)于廣州東征化玻儀器有限公司；卓越金瑞血糖試紙（批號(hào)：473282）由德國(guó)羅氏診斷有限公司生產(chǎn)。AU5421全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus光學(xué)株式會(huì)社）；XDS-2倒置顯微鏡（中國(guó)廣州光學(xué)儀器廠(chǎng)）；ABIPRISMR7500 Sequence Detection System（美國(guó)ABI公司）；EnSpireRMultimode Plate Reader 2000（美國(guó)Perkin Elmer公司）；Accu-ChekRPerforma卓越型血糖儀（德國(guó)Roche公司）。

1.4造模方法［8］90只SPF級(jí)SD大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0001，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組8只、造模組82只，每組雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，每周稱(chēng)量體質(zhì)量1次。正常對(duì)照組用基礎(chǔ)鼠料喂養(yǎng)，造模組用高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，按以下順序灌胃相應(yīng)體積的高脂乳液：第1周2.5 mL/kg、第2周5.0 mL/kg、第3周7.5 mL/kg、第4～8周10 mL/kg，以50 mL/kg為上限。造模持續(xù)8周，2組均給予自由飲水及相應(yīng)飲食。8周后，禁食不禁水16 h，用血糖儀測(cè)定大鼠尾部末端血糖后，立即灌以10 mL/kg的0.2 g/mL葡萄糖溶液，然后測(cè)定120 min時(shí)的血糖值，檢測(cè)糖耐量。從造模組中隨機(jī)抽取雌雄大鼠各1只，用0.2 g/L戊巴比妥鈉以2.0 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血后觀(guān)察肝臟病變情況確認(rèn)造模成功［8］。

1.5動(dòng)物分組及給藥取造模組存在糖調(diào)節(jié)受損（空腹血糖≥6.1 mmol/L，或餐后2 h血糖≥7.8 mmol/L）［9］的32只大鼠，根據(jù)體質(zhì)量和血糖值隨機(jī)分成模型組、SLEC低劑量組（劑量為0.74 g·kg-1· d-）1、SLEC高劑量組（劑量為1.48 g·kg-1·d-1）和二甲雙胍組（劑量為100 mg·kg-1·d-）1，每組8只，雌雄各半。正常組和模型組每日灌胃10 mL/kg雙蒸水，其他組分別灌胃10 mL/kg的相應(yīng)藥物。全部大鼠給予普通鼠料和正常飲水。4周后，禁食不禁水16 h，用0.2 g/L戊巴比妥鈉以2 mL/kg腹腔注射麻醉，用真空采血管從腹主動(dòng)脈采血，取肝稱(chēng)質(zhì)量，迅速切取肝組織放于凍存管、置于液氮中備用，切取肝右葉組織放于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林中固定、送檢，切取肝組織放于離心管中置-20℃冰箱備用。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1血脂、血糖及肝功能采血后靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量。

1.6.2血清胰島素（Ins）含量采用放射免疫法測(cè)定，并用HOMA穩(wěn)態(tài)模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、胰島素敏感指數(shù)（ISI）。計(jì)算公式［8］：HOMA-IR = FBG×Ins/22.5，ISI = 1/（FBG×Ins）。

1.6.3血清游離脂肪酸（NEFA）含量采用比色法測(cè)定。

1.6.4肝脂質(zhì)含量稱(chēng)取0.2 g肝組織，加入9倍體積的無(wú)水乙醇（分析純），用電動(dòng)勻漿器制成100 g/L肝勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別用甘油磷酸氧化酶—過(guò)氧化物酶偶聯(lián)（GPO-PAP）法、膽固醇氧化酶—過(guò)氧化物酶偶聯(lián)（COD-PAP）法測(cè)定100 g/L肝勻漿中TG、CHOL的含量。

1.6.5肝組織總超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量稱(chēng)取0.2 g肝組織，加入9倍體積的生理鹽水，用電動(dòng)勻漿器制成100 g/L肝勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別用水溶性四氮唑（WST-1）法、硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定100 g/L肝勻漿中的SOD、MDA含量。

1.6.6肝組織病理學(xué)取體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林固定后的肝組織，常規(guī)石蠟包埋、切片和蘇木素—伊紅（HE）染色，光鏡下觀(guān)察肝組織病理改變；取冷凍肝組織切片，油紅O染色，光鏡下觀(guān)察肝臟脂肪病變情況。

1.6.7肝組織固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA及蛋白的表達(dá)各組隨機(jī)抽取4只大鼠，取肝組織，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法和蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）檢測(cè)SREBP-1c mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

1.6.7.1 SREBP-1c mRNA檢測(cè)引物由廣州萊德?tīng)柹锟萍加邢薰竞铣?。檢測(cè)序列片段大?。簝?nèi)參片段β-actin 150 bp、目的片段SREBP-1c 184 bp。以Trizol法提取大鼠肝組織總RNA，Dnase I （Rnase Free）去除基因組DNA，分別測(cè)定260、280 nm處吸光度（D）值，并計(jì)算其比值，D260/D280比值均大于1.8。每樣本取1 μL RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（合成cDNA），按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。以cDNA為模板的熒光定量PCR檢測(cè)按20 μL體系，SREBP-1c樣本引物序列：SREBP-1c-F：5’-GTAGAGCACATTCCCCAAGT-3’，SREBP-1c-R：5’-CAGTTGATGTAGAGGCTAAGCT-3’，β-actin-F：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，β-actin-R：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’，以18sr RNA為內(nèi)參。反應(yīng)體系內(nèi)含cDNA模板5.0 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，dH2O 4.0 μL；95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)分析：溫度60℃～95℃。利用ABI公司自帶的PCR系統(tǒng)軟件分析，觀(guān)察擴(kuò)增曲線(xiàn)，計(jì)算樣本歸一化的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）、目的基因Ct值與內(nèi)參Ct值之差△Ct、各組△Ct與正常對(duì)照組△Ct之差得△△Ct，以△△Ct值的負(fù)數(shù)為指數(shù)計(jì)算2-△△Ct，并進(jìn)行比較。

1.6.7.2 SREBP-1c蛋白表達(dá)檢測(cè)采用無(wú)線(xiàn)電免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解大鼠肝組織，提取各組蛋白；二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，按照總蛋白濃度一致進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳，用濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；以50 g/L的脫脂奶粉室溫閉液1 h，分別加入一抗（SREBP-1c兔多抗，稀釋倍數(shù)1∶500），4℃孵育過(guò)夜；加辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗羊抗兔多抗（Goat Anti-Rabbit IgG，稀釋倍數(shù)1∶20 000），室溫1 h；徹底洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，最后進(jìn)行顯影、定影。使用IPWIN60圖像分析軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度的比值（p）作為SREBP-1C蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 10.0對(duì)各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)進(jìn)行個(gè)案排秩后再使用LSD檢驗(yàn)法分析。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況的觀(guān)察正常組大鼠毛發(fā)整潔光澤，行動(dòng)靈活，飲食飲水正常，排泄物正常，體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)。造模組大鼠毛發(fā)稍欠整潔光澤，較不喜活動(dòng)，飲食飲水正常，排泄物油膩，體質(zhì)量增長(zhǎng)比正常組多。雌鼠較雄鼠飲食飲水量少且活潑好動(dòng)。更換飼料及撤除高脂乳液灌胃后給藥期間，模型組及各給藥組大鼠毛發(fā)較造模期間整潔、活動(dòng)稍增多，各給藥組大鼠排泄物較正常。

2.2造模8周后大鼠情況造模8周后，隨機(jī)抽取的造模組大鼠肝臟表面呈油膩黃色狀，各肝葉邊緣較鈍，肝臟脂質(zhì)沉積明顯，顯示脂肪肝模型已建立。大鼠尾部末梢血糖檢測(cè)結(jié)果顯示：正常組大鼠空腹血糖為（5.19±0.46）mmol/L（極小值為4.6，極大值為5.8），餐后2 h血糖為（5.81±0.80）mmol/L（極小值為4.4，極大值為6.8）。造模組共有32只大鼠空腹血糖≥6.1 mmol/L或/和2 h血糖≥7.8 mmol/L，為造模組大鼠總數(shù)的39%。結(jié)果表明32只大鼠存在較明顯的糖調(diào)節(jié)受損，此為胰島素抵抗表現(xiàn)之一，提示NAFLD-IR大鼠模型成立。

2.3各組大鼠血脂、血清NEFA含量比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TG、LDL-C、NEFA水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高劑量組血清TG、LDL-C、NEFA水平均顯著降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠血脂、血清NEFA的比較Table 1 Comparison of blood lipids and serum NEFA level of rats in different groups?。ā纒）

表1　各組大鼠血脂、血清NEFA的比較Table 1 Comparison of blood lipids and serum NEFA level of rats in different groups?。ā纒）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 cTG/（mmol·L-1）0.61±0.16 0.92±0.33①0.47±0.14②0.88±0.44 0.71±0.11 cCHOL/（mmol·L-1）1.54±0.27 1.78±0.39 1.61±0.53 1.66±0.27 1.55±0.50 cLDL-C/（mmol·L-1）0.18±0.03 0.26±0.10①0.18±0.03②0.22±0.04 0.18±0.02②cHDL-C/（mmol·L-1）0.62±0.11 0.58±0.10 0.55±0.10 0.55±0.14 0.51±0.11 cNEFA/（μmol·L-1）423.29±45.65 570.91±81.92①487.43±53.32②504.25±81.40 489.27±67.26②

2.4各組大鼠肝功能比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠ALT、AST含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明造模大鼠沒(méi)有肝損傷發(fā)生。與模型組比較，SLEC高、低劑量組ALT、AST含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5各組大鼠胰島素抵抗程度比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR顯著升高（P＜0.05），ISI顯著降低（P＜0.05），提示模型組大鼠存在明顯的胰島素抵抗和胰島素敏感性降低。與模型組比較，SLEC高、低劑量組大鼠HOMAIR均顯著降低（P＜0.05），SLEC高劑量組ISI顯著升高（P＜0.05），提示SLEC高劑量組具有明顯的改善胰島素抵抗和提高胰島素敏感性作用。

2.6各組大鼠肝脂質(zhì)及肝臟氧化應(yīng)激程度比較

表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TG、CHOL含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高劑量組大鼠肝組織中的TG含量顯著降低（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織的SOD含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高劑量組SOD含量顯著升高（P＜0.05）。各組大鼠的MDA含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組大鼠肝功能的比較Table 2 Comparison of liver function of rats in different groups?。邸纒，J/（U·L-1）］

表2　各組大鼠肝功能的比較Table 2 Comparison of liver function of rats in different groups?。邸纒，J/（U·L-1）］

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 ALT 24.88±4.16 28.88±5.87 24.12±5.51 28.00±8.04 22.38±6.84 AST 165.70±21.95 168.12±15.28 146.88±17.54 159.25±28.35 112.62±21.65①②

表3　各組大鼠胰島素抵抗程度的比較Table 3 Comparison of insulin resistance of rats in different groups　（±s）

表3　各組大鼠胰島素抵抗程度的比較Table 3 Comparison of insulin resistance of rats in different groups?。ā纒）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 cFBG/（mmol·L-1）6.65±1.24 7.17±1.11 6.36±1.12 6.28±0.91 6.84±0.64 JIns/（mU·L-1）56.48±6.69 70.64±7.78 59.07±7.78 66.40±15.87 61.72±11.30 HOMA-IR 16.68±3.81 22.38±3.28①16.64±3.26②18.38±5.01②18.75±3 .95 ISI（×10-3）2.78±0.62 2.02±0.31①2.78±0.64②2.54±0.54 2.46±0.52

表4　各組大鼠肝脂質(zhì)及氧化應(yīng)激程度的比較Table 4 Comparison of liver lipids and oxidative stress of rats in different groups?。ā纒）

表4　各組大鼠肝脂質(zhì)及氧化應(yīng)激程度的比較Table 4 Comparison of liver lipids and oxidative stress of rats in different groups?。ā纒）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 cTG/（mmol·L-1）1.01±0.14 1.76±0.26①1.39±0.42②1.52±0.45 1.32±0.37②cCHOL/（mmol·L-1）0.85±0.08 1.25±0.27①1.14±0.33 1.16±0.24 1.12±0.25 JSOD/（U·mg-1）752.40±67.89 642.06±78.23①814.38±167.75②708.80±94.88 676.13±116.04 bMDA/（nmol·mg-1）1.06±0.12 1.34±0.27 1.03±0.18 1.14±0.16 1.16±0.39

2.7各組大鼠肝組織切片HE染色及油紅O染色病理觀(guān)察圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠肝細(xì)胞大小相仿、形態(tài)相似、細(xì)胞核清晰且位于細(xì)胞中央；模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)彌漫性脂肪變性明顯，細(xì)胞大小不均，脂肪變性使細(xì)胞核移位；各給藥組脂肪變性顯著減少，細(xì)胞形態(tài)較均勻。圖2結(jié)果顯示：正常組大鼠肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯紅色脂泡出現(xiàn)；模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂泡廣泛分布，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)存在大量脂質(zhì)；各給藥組肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂泡均顯著減少，表明SLEC能在一定程度上改善肝脂質(zhì)沉積的病理狀態(tài)。

圖1　各組大鼠肝臟組織病理狀態(tài)比較（HE染色，×250）Figure 1 Comparison of liver pathologic feature of rats in different groups（by HE staining，×250）

圖2　各組大鼠肝臟組織病理變化比較（油紅O染色，×250）Figure 2 Comparison of liver pathologic feature of rats in different groups（by Oil Red O staining，×250）

2.8各組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白的表達(dá)比較表5、圖3結(jié)果顯示：與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝組織的SREBP-1c mRNA及蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高、低劑量組大鼠肝組織的SREBP-1c mRNA及蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。

3　討論

研究表明：幾乎所有的NAFLD患者都存在肝臟和周?chē)M織的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［10］。NAFLD病理機(jī)制主要是指肥胖、高脂血癥等因素導(dǎo)致IR產(chǎn)生及肝細(xì)胞脂肪變性［1］。NAFLD患者由于存在IR，肝臟和脂肪組織等胰島素敏感性降低使脂肪分解增加，血中NEFA含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟NEFA攝取增加，肝內(nèi)TG從頭合成增加，導(dǎo)致了TG在肝臟的聚積［11］。

表5　各組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Table 5　Comparison of relative expression values of SREBP-1c mRNA and protein in rats of different groups?。ā纒）

表5　各組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Table 5　Comparison of relative expression values of SREBP-1c mRNA and protein in rats of different groups?。ā纒）

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N44444 1.31±0.79 4.69±3.00①1.66±1.40②1.92±1.55②0.88±0.65②p 0.120±0.002 0.240±0.002①0.058±0.002②0.225±0.002②0.169±0.004②n2-ΔΔCt

圖3　各組大鼠SREBP-1c蛋白表達(dá)凝膠電泳圖Figure 3 Gel electrophoresis results of SREBP-1c protein expression of rats in different groups

隨著肝臟攝取NEFA的增多，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性后產(chǎn)生過(guò)量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），超出機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）及過(guò)氧化產(chǎn)物產(chǎn)生［12］。氧化應(yīng)激可以進(jìn)一步誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應(yīng)，它可以啟動(dòng)固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterolregulatory element binding proteins，SREBPs），使SREBPs與SREBPs裂解激活蛋白形成復(fù)合物后經(jīng)酶解作用成為轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)入細(xì)胞核與脂肪酸、膽固醇等靶向因子結(jié)合，使脂肪酸合成大量增加，造成肝細(xì)胞脂肪代謝紊亂［12］。

SREBP-1c屬于SREBPs家族成員，對(duì)脂肪合成酶的編碼基因表達(dá)具有正向調(diào)控作用，其表達(dá)升高可導(dǎo)致肝細(xì)胞的脂肪酸合成增加［13-15］。SREBP-1c還可通過(guò)抑制極低密度脂蛋白（VLDL）的組裝使肝臟TG排出減少造成脂質(zhì)聚積。因此，SREBP-1c是機(jī)體脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)［16］。

荔枝核性味甘、溫，微苦澀，入肝腎，具有溫中、理氣、止痛的功效。研究顯示荔枝改善糖脂質(zhì)代謝和逆轉(zhuǎn)IR作用明顯，荔枝核有效部位群含皂苷、黃酮和鞣質(zhì)，是荔枝核發(fā)揮調(diào)脂降糖活性的主要有效部位［2，4，7］。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠血清TG、LDLC、NEFA含量及肝脂質(zhì)含量較正常組均顯著升高（P＜0.05）；病理組織觀(guān)察顯示肝細(xì)胞脂肪變性明顯，且模型組大鼠HOMA-IR顯著升高（P＜0.05）、ISI顯著降低（P＜0.05），表明高脂飼料喂養(yǎng)加高脂乳液灌胃建立的NAFLD-IR大鼠模型成立，但模型組大鼠血清ALT和AST含量均在正常范圍，且與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明造模大鼠主要以肝臟脂質(zhì)沉積為主，沒(méi)有明顯的非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）發(fā)生。經(jīng)SLEC治療后，SLEC高劑量組能顯著降低NAFLD-IR大鼠血清TG、LDL-C、NEFA水平，減輕肝脂質(zhì)沉積，降低HOMA-IR、提高ISI以及血清SOD含量，且SLEC高、低劑量組SREBP-1c mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于模型組（P＜0.05），提示SLEC抗NAFLD脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制，與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低NEFA水平，改善IR、抗氧化應(yīng)激和下調(diào)SREBP-1c基因與蛋白表達(dá)有關(guān)。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Therapeutic Effect of Semen Litchi Effective Constituents for Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rats and Its Mechanism

HUANG Yuying1，LI Changqing2，CHEN Sitai2，HUANG Zhigang3，GUO Jiewen4，LI Xiaohui1，QU Xiling3
（1.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Tropical Medicine Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；3.Huizhou Jiuhui Pharmaceutical Co.，Ltd，Huizhou 516007 Guangdong，China；4.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130 Guangdong，China）

Abstract：Objective To observe the therapeutic effect of Semen Litchi effective constituents（SLEC）for rats with nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）and to explore its mechanism.Methods SPF rats，male in half，were fed with high fat diet for 8 weeks to induce NAFLD model.And then the modeled rats were randomly divided into 4 groups according to body mass and blood glucose level，namely model group，low-dose SLEC group （0.74 g·kg-1·d-1），high-dose LSEC group（1.48 g·kg-1·d-1），and metformin group（100 mg·kg-1·d-1），8 rats in each group，male in half.A normal group was also set up.After medication for 4 weeks，blood was sampled from the abdominal aorta，and liver tissues were taken out for the test.The serum levels of triglyceride（TG），cholesterol（CHOL），high- density lipoprotein cholesterol（HDL-C），low- density lipoprotein cholesterol（LDL-C），alanine aminotransferase（ALT），aspartase aminotransferase（AST）and fasting blood-glucose（FBG）were detected by automatic biochemical analyzer．Serum content of non-esterified fatty acid（NEFA）was detected by colorimetry，and serum insulin content was detected by radioimmunoassay（RIA）.Homeostasis model of assessment for insulin resistence index（HOMA-IR）and insulin sensitivity index（ISI）were calculated.The content of TG，CHOL，superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）in liver tissues were detected respectively by glycerol phosphate oxidase-peroxidase（GPO-PAP），cholesterol oxidase - peroxidase（COD-PAP），water-soluble tetrazolium（WST-1），thiobarbituric acid（TBA）methods.Pathological changes of liver tissues were observed.The sterol-regulatory element binding protein-1c（SREBP-1c）mRNA expression level in liver tissues was detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR），and the hepatic SREBP-1c protein expression was detected by Western blot.Results Compared with the model group，TG，LDL-C，NEFA and liver lipids contents in high-dose SLEC group were decreased，SOD was increased，HOMA-IR was improved，and ISI was enhanced，the difference being significant（P＜0.05），and the degree of hepatic steatosis was alleviated obviously，too.Compared with the model group，the mRNA and protein expression levels of SREBP-1c in high- and low-dose SLEC groups were obviously down-regulated（P＜0.05）.Conclusion SLEC show obvious therapeutic effect on hepatic steatosis in NAFLD rats，which might be related to regulating lipid metabolism，decreasing NEFA level，improving IR and oxidative stress，and down -regulating SREBP -1c mRNA and protein expression．

Key words：Semen Litchi effective constituents/pharmacology；non-alcoholic fatty liver disease/TCD therapy；insulin resistance；liver/pathology；gene expression regulation；disease models，animal；rats

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3213（2016）03 - 0346 - 07

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．016

收稿日期：2015-09-03

作者簡(jiǎn)介：黃玉影（1991-），女，碩士研究生；E-mail：Cheryl-hyy@qq.com

通訊作者：李小翚，女，副教授；E-mail：546647632@qq.com

基金項(xiàng)目：廣東省重大科技專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2012A080202010）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：S2013010012998）；廣州市科技計(jì)劃應(yīng)用研究基礎(chǔ)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2013J4100088）；廣東省中醫(yī)藥局基金項(xiàng)目（編號(hào)：20122004）