黃暨生，張廣獻(xiàn)，譚宇蕙，易華，羅惠，杜標(biāo)炎

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州　510006）

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綠色熒光蛋白示蹤的HSV1-tk /GCV系統(tǒng)重組慢病毒載體的構(gòu)建及活性檢測(cè)

黃暨生，張廣獻(xiàn)，譚宇蕙，易華，羅惠，杜標(biāo)炎

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）示蹤的單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因（HSV1-tk）的重組慢病毒載體，并檢測(cè)該系統(tǒng)對(duì)人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375的感染活性?！痉椒ā繕?gòu)建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體pLV-tk-GFP，并使用限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行鑒定及序列測(cè)定；用該重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T，獲得重組活病毒并感染A375，以嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；使用熒光顯微鏡觀察GFP基因的表達(dá)，更昔洛韋（GCV）殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tk-GFP基因的活性。【結(jié)果】重組質(zhì)粒pLV-tk-GFP經(jīng)限制性酶切鑒定和DNA序列測(cè)定分析顯示，tk基因已連接到載體正確位置，序列無(wú)突變；包裝病毒并感染細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察顯示tk-GFP基因在A375中表達(dá)；篩選得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株A375/ tk-GFP，GCV能顯著殺傷A375/tk-GFP細(xì)胞，表明tk基因活性正常?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建了重組pLV-tk-GFP慢病毒載體，該載體能包裝產(chǎn)生活病毒且在感染的人黑色素瘤細(xì)胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)渭儼捳畈《?型胸苷激酶基因；自殺基因系統(tǒng)；慢病毒；黑色素瘤

腫瘤自殺基因療法由于存在旁觀者效應(yīng)，成為腫瘤生物治療中活躍的研究領(lǐng)域之一。單純皰疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韋（HSV1-tk/GCV）自殺基因系統(tǒng)是最早進(jìn)入臨床試驗(yàn)的自殺基因系統(tǒng)，在多種腫瘤（如白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌和口腔癌等）的治療中均顯示了一定的抗腫瘤效果［1］。本課題組前期研究了多種腫瘤自殺基因治療及中藥方藥對(duì)腫瘤自殺基因治療的增效作用及增效機(jī)制［2-5］，但研究工作多以動(dòng)物腫瘤細(xì)胞株為主，且以逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)HSV1-tk，而慢病毒具有更高的轉(zhuǎn)染效率。故本研究通過(guò)構(gòu)建tk-綠色熒光蛋白（GFP）融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375中，建立綠色熒光示蹤的重組HSV1-tk-GFP/GCV系統(tǒng)，作為自殺基因旁殺傷效應(yīng)直觀量化的檢測(cè)模型，為后續(xù)的中藥方藥對(duì)人源性腫瘤細(xì)胞的自殺基因治療增效作用及作用機(jī)制的體內(nèi)外研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1載體、細(xì)胞株質(zhì)粒CD511B作為過(guò)表達(dá)載體，長(zhǎng)度為7 544 bp，含人EF1啟動(dòng)子和GFP基因，帶有氨芐原核抗性基因、嘌呤霉素篩選標(biāo)記以及BamH I和EcoR I的酶切位點(diǎn)，由本室保存；大腸桿菌E.coli DH5α菌株由本室保存；人胚腎細(xì)胞HEK293T、人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375，為本室保存，均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃和體積分?jǐn)?shù)5%CO2的條件下。

1.2藥物及試劑嘌呤霉素（美國(guó)Amersco公司）；多聚陽(yáng)離子（美國(guó)Polybrene公司）；更昔洛韋（GCV）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國(guó)Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、2.5 g/L胰酶（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，T4 DNA連接酶（上海晶美生物工程有限公司）；普通小量提取質(zhì)粒DNA試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek公司）；B型超純小量提取質(zhì)粒DNA試劑盒（北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司）；DNA凝膠回收試劑盒（DNA Extration Kit）（立陶宛MBI公司）；逆轉(zhuǎn)錄和PCR所需試劑（北京Trans Gen公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.3儀器UnoⅡThermocycler PCR BiometraR儀（美國(guó)MJ Research公司）；Thermo-Forma CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Hepa Filter公司）；IX71-F22FL/PH型熒光倒置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；680型酶標(biāo)儀、小型垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板等耗材（美國(guó)Corning公司）。

1.4重組慢病毒載體構(gòu)建

1.4.1構(gòu)建方案目的基因tk序列來(lái)自NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank：JX392980.1），長(zhǎng)度約1 149 bp（R4312），基因片段兩端含BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。將質(zhì)粒CD511B經(jīng)BamHⅠ/ EcoRⅠ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收獲得載體大片段。將目的基因tk與載體大片段均經(jīng)連接反應(yīng)后（CD511B-R4312）轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，獲得并鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.4.2PCR反應(yīng)以HEK293T細(xì)胞總RNA為模板，用高保真酶將目的基因tk片段擴(kuò)增后進(jìn)行膠回收，擴(kuò)增引物：上游5’-ATATCTTGTGGAAAG GACG-3’，下游5’-CTGCATTCTAGTTGTGGTT-3’；DNA片段擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸80 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min。取產(chǎn)物8 μL加入DNA上樣緩沖液，混勻后點(diǎn)樣至含Goldview （50 μL/L）的10 g/L瓊脂糖凝膠，在TAE電泳緩沖液中電泳，鑒定RT-PCR產(chǎn)物。

1.4.3DNA片段回收、連接將限制酶酶切后的載體DNA片段及RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切取DNA條帶，以瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，溶于無(wú)菌水中－20℃保存。在無(wú)菌的Eppendorf管中加入下列成分并進(jìn)行連接反應(yīng)：目的DNA片段（1∶50稀釋）15 μL，載體DNA片段2 μL，加入2 μL 10×連接緩沖液，1 μL T4 DNA連接酶，總反應(yīng)體系為20 μL。16℃連接（于冰上操作）過(guò)夜后，取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

1.4.4重組克隆篩選、鑒定將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α接種于氨芐抗性（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振搖過(guò)夜。并進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)粒DNA抽提，然后以BamHⅠ/EcoRⅠ酶切進(jìn)行鑒定，DNA片段電泳并回收。

1.4.5序列測(cè)定以回收酶切重組質(zhì)粒的DNA片段為測(cè)序模板，采用通用測(cè)序引物，取部分保種的菌液送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.5包裝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組活病毒的收集病毒包裝：人胚腎細(xì)胞HEK293T，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。鋪板2 d后密度達(dá)90%左右，轉(zhuǎn)染前1 h，更換4 mL的opti-MEM培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將構(gòu)建好的重組慢病毒質(zhì)粒pLV-tk-GFP與包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HER293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6～8 h后換10 mL新鮮培養(yǎng)基沿皿壁緩慢加入。加入新鮮培養(yǎng)基48、72 h后分別收病毒液，離心過(guò)濾分裝到1.5 mL EP管中，置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.6人黑色素瘤細(xì)胞A375的感染和重組基因的活性鑒定

1.6.1A375細(xì)胞感染及穩(wěn)定表達(dá)株的篩選A375為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80%～90%的匯合率時(shí)，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋為5×105/ mL，吸1 mL細(xì)胞懸液到2 mL EP管，再加入2 μL polybrene混勻，加入1 mL病毒液充分混勻后接種到培養(yǎng)皿。24 h后更換含0.5 mg/L嘌呤霉素篩選培養(yǎng)液，48～72 h后置于熒光顯微鏡，藍(lán)光下觀察熒光蛋白的表達(dá)。隔天換液，維持嘌呤霉素篩選濃度1周。

1.6.2A375/tk-GFP穩(wěn)定表達(dá)株的tk活性檢測(cè)將A375和A375-tk-GFP按3 000個(gè)/孔細(xì)胞接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入GCV，換含終濃度分別為0、6.25、25、100 μmol/L的GCV培養(yǎng)液，GCV作用72 h后鏡下觀察細(xì)胞的變化。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度（D）值，按公式p細(xì)胞存活率（%）=（D測(cè)定組/D對(duì)照組）×100%，計(jì)算各組細(xì)胞存活率，比較A375細(xì)胞和A375/tk-GFP細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性。用Calcusyn 2.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制量（IC50）。

1.7統(tǒng)計(jì)方法用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pLV-tk-GFP分子量約為10.0 kb，酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳條帶位置與預(yù)期相符，證明目的基因已經(jīng)成功連接到載體質(zhì)粒，結(jié)果見(jiàn)圖1。重組慢病毒載體pLV-tk-GFP基因序列的測(cè)序結(jié)果與原始載體序列比對(duì)，相應(yīng)序列100%完全一致，結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2，證明攜帶目的基因HSV1-tk的質(zhì)粒pLV-tk-GFP構(gòu)建成功。

重組質(zhì)粒pLV-tk-GFP的測(cè)序結(jié)果表明目的基因tk序列與GenBank：JX392980.1的一致，沒(méi)有突變。

2.2包裝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、重組病毒感染A375和基因表達(dá)觀察將包裝細(xì)胞產(chǎn)生的重組慢病毒pLV-tk-GFP感染A375細(xì)胞48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察，到絕大部分細(xì)胞能被激發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明轉(zhuǎn)染率接近100%。用0.5 mg/L嘌呤霉素維持篩選濃度2周，最終獲得重組基因整合到染色體上的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，命名為A375/tk-GFP，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1　pLV-tk-GFP質(zhì)粒酶切結(jié)果Figure 1 Enzyme-cut result of plasmid pLV-tk-GFP

圖2　重組慢病毒質(zhì)粒pLV-tk-GFP的結(jié)構(gòu)示意圖（R4312為目的基因）Figure 2 Structure delineation for constructed recombinant plasmid pLV-tk-GFP（target gene R4312）

2.3GCV細(xì)胞毒性試驗(yàn)驗(yàn)證重組細(xì)胞株中整合染色體上的tk-GFP活性對(duì)A375細(xì)胞、A375/tk-GFP細(xì)胞進(jìn)行不同濃度GCV（0、6.25、25、100 μmol/L）殺傷試驗(yàn)，采用MTT法檢測(cè)GCV作用72 h的細(xì)胞存活率，圖4結(jié)果顯示：A375/tk-GFP組對(duì)6.25 μmol/L GCV的敏感性已顯著高于A375組，GCV各濃度2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5、圖6結(jié)果顯示：A375/tk-GFP細(xì)胞生存率隨GCV濃度增大逐步減小，GCV作用72 h均見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞膨大變圓，胞膜皺縮，大量細(xì)胞脫落懸浮，并有大量細(xì)胞碎片產(chǎn)生。GCV 對(duì)A375/tk-GFP細(xì)胞作用72 h的IC50為6.113 μmol/L。而GCV作用于A375細(xì)胞時(shí)各濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，與對(duì)照組比較細(xì)胞密度和存活率無(wú)顯著差異。

圖3　穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人黑色素瘤細(xì)胞株A375/tk-GFPFigure 3 Human cutaneous melanoma cell line A375/tk-GFP with green fluorescence

圖4　A375和A375/tk-GFP細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性（72 h）（±s，N=3）Figure 4 Comparison of the sensitivity of A375 & A375/ tk-GFP cells to GCV（72 h）

圖5　不同濃度GCV對(duì)A375細(xì)胞的殺傷作用（72 h）（×200）Figure 5 The antitumor effects of various concentrations of GCV on A375 after culturing for 72 h（×200）

圖6　不同濃度GCV對(duì)A375/tk-GFP細(xì)胞的殺傷作用（72 h）（×200）Figure 6 The killing effects of various concentrations of GCV on A375/tk-GFP after culturing for 72 h（×200）

3　討論

針對(duì)各種惡性腫瘤的基因治療臨床試驗(yàn)方案占了全球批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段基因治療方案總數(shù)的2/3。腫瘤基因治療的原理是通過(guò)將一段具有外源功能的基因采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入至腫瘤細(xì)胞補(bǔ)償其基因缺失，使其獲得特定功能，繼而達(dá)到抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的目的［6］。目前主要的基因?qū)氲某Ｒ?jiàn)方法有病毒載體和非病毒載體系統(tǒng)，其中借助以病毒為基礎(chǔ)的載體是常見(jiàn)方法之一，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、慢病毒等［7-8］，而非病毒載體包括質(zhì)粒DNA、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、PEI、納米膠束等［9-10］。病毒載體轉(zhuǎn)染率大大高于非病毒載體。與其他2種載體比較，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，而且容納外源基因片段有限，腺病毒載體不能整合到染色體上，只適合瞬時(shí)感染；慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有高效的感染性，容納外源基因片段大且可將外源基因有效地整合到宿主染色體，達(dá)到持久穩(wěn)定表達(dá)外源基因的目的，非常適合于較大的融合基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株的建立［11-12］。由于慢病毒載體具有以上眾多的優(yōu)勢(shì)，其在基因治療的應(yīng)用最早始于20世紀(jì)70年代，在RNA干擾、自殺基因及免疫基因等基因治療策略實(shí)現(xiàn)外源基因的高效導(dǎo)入，具有良好應(yīng)用前景并得到廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)構(gòu)建新的重組慢病毒載體pLV-tk-GFP，通過(guò)與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞能產(chǎn)生活病毒，再感染腫瘤細(xì)胞能構(gòu)建各種重組tk-GFP的腫瘤細(xì)胞株，利用其高效轉(zhuǎn)染效率及可示蹤特點(diǎn)用于自殺基因治療以及藥物包括中藥對(duì)其增效作用的研究開(kāi)發(fā)，也可以把它作為一種示蹤工具用于研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制及其他藥理研究等。

免疫基因治療、腫瘤抑制基因治療、自殺基因治療等基因治療策略中，自殺基因治療是將無(wú)毒的前體藥物轉(zhuǎn)化為有毒性的藥物從而產(chǎn)生基因的特異性殺傷作用［13］，同時(shí)還可以通過(guò)旁觀者效應(yīng)（bystander effect）引起導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞鄰近無(wú)自殺基因的腫瘤細(xì)胞死亡［14］。HSV-tk/GCV系統(tǒng)在人體試驗(yàn)中獲得成功，并已經(jīng)開(kāi)展III期臨床相關(guān)試驗(yàn)研究［15］。治療惡性黑色素瘤最常見(jiàn)的自殺基因系統(tǒng)是HSV-tk/GCV系統(tǒng)，本課題組前期以逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)構(gòu)建了綠色熒光示蹤、自殺基因陽(yáng)性的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16/tk-GFP以及紅色熒光示蹤、自殺基因陰性的B16-RFP。通過(guò)這一自殺基因旁殺傷效應(yīng)直觀、量化的分析檢測(cè)模型［16-18］，分析了中藥丹參酮IIA等中藥對(duì)自殺基因的增效作用及旁殺傷效應(yīng)機(jī)制［19］。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了更高轉(zhuǎn)染效率的重組慢病毒載體pLV-tk-GFP，可用于更多腫瘤株的研究，而獲得的A375/tk-GFP細(xì)胞株可用于后續(xù)的人源性惡性黑色素瘤的自殺基因治療，以及中藥方藥增效作用和機(jī)制的體內(nèi)外研究工作。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

·南藥園地·

Construction of Recombinant HSV1-tk/GCV Green Fluorescent Protein Monitoring Lentivirus System and Detection of Its Activity

HUANG Jisheng，ZHANG Guangxian，TAN Yuhui，YI Hua，LUO Hui，DU Biaoyan
（School of Fundamental Medical Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To construct recombinant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase/ganciclovir（HSV1-tk/GCV）green fluorescent protein（GFP）monitoring lentivirus system，and to examine the activity of package cells transfected with the constructed lentiviurs vector and infected with human cutaneous melanoma cell line A375.Methods The recombinant lentiviurs vector pLV-tk-GFP expressing suicide gene HSV1-tk and GFP gene was constructed，and then was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.After the recombinant plasmid and packaging plasmid were cotransfected to packaging cell line HEK293T，the animated virus was obtained and was used to infecting A375 to screen cell line with stable expression by puromycin.A standard fluorescence microscope was used for florescent detection，and the tk-GFP gene activity was evaluated by GCV anti-tumor effect.Results The results of restriction endonuclease digestion and DNA sequencing showed that tk gene had been successfully inserted into the correct position of the recombined plasmid pLV-tk-GFP，showing no sequence mutation.After A375 cells were infected with the packaging virus，tk-GFP gene expression was present under fluorescence microscope，indicating that cell line A375/tk-GFP was obtained.GCV had obvious killing effect on cell line A375/tk-GFP，indicating that tk gene activity was normal.Conclusion The recombinant lentivirus vector pLV-tk-GFP has been successfully constructed，and the vector can produce animated virus and has the bioactivity of tk-GFP gene in the infected human cutaneous melanoma cell line A375.

Key words：herpes simplex virus type 1 thymidine kinase（HSV1-tk）；suicide gene system；lentivirus；melanoma

中圖分類號(hào)：R739.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3213（2016）03 - 0384 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．024

收稿日期：2016-01-30

作者簡(jiǎn)介：黃暨生（1985-），男，博士研究生；E-mail：ziyuanhuang@163.com

通訊作者：杜標(biāo)炎，男，教授；E-mail：dubiaoyan@gzucm.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81072906）